CS263606B1

CS263606B1 - Enzymový elektrochemický senzor na stanovení alkoholů a způsob jeho přípravy

Info

Publication number: CS263606B1
Application number: CS861637A
Authority: CS
Inventors: Miroslav Doc Ing Csc Marek; Bohuslav Doc Ing Csc Dolezal; Zdenek Ing Csc Pavlicek; Radko Ing Csc Volf; Miloslav Ing Csc Stastny; Jiri Ing Csc Nepozitek; Oldrich Ing Csc Gilar
Original assignee: Marek Miroslav; Dolezal Bohuslav; Pavlicek Zdenek; Volf Radko; Stastny Miloslav; Nepozitek Jiri; Gilar Oldrich
Priority date: 1986-03-11
Filing date: 1986-03-11
Publication date: 1989-04-14
Also published as: CS47688A1; CS163786A1; CS268357B1

Abstract

Řešení se týká enzymového elektrochemického senzoru na stanovení alkoholů, především ethylalkoholu, obsahujícího detektor kyslíku, na jehož povrchu je fixována vrstva s imobilizovaným enzymem alkoholoxidázou a způsobu jeho přípravy. Stanovení alkoholu se provádí na principu enzymové exidace katalyzované imobilizovanou alkoxidázou v kombinaci s elektrochemickou detekcí ekvivalentní spotřeby kyslíku. Obsahuje-li fixovaná vrstva aldehydové skupiny, imobilizuje se alkoholoxidáza reakcí svých karboxylových skupin nebo aminoskupin a přidanými složkami obsahujícími izonitrilové a karboxylové skupiny a/nebo aminoskupiny, v případě, že obsahuje aminoskupiny, imobilizuje se enzym alkohol- -oxidáza reakcí svých karboxylových skupin aminoskupinami a přidanými složkami obsahujícími izonitrilové a aldehydové skupiny. Obdobný způsob přípravy je i tehdy, když fixovaná vrstva obsahuje bud karboxylové skupiny nebo izonitrilové skupiny. Enzymový elektrochemický senzor umožňuje rychle a spolehlivě měřit koncentraci alkoholu v technologických vzorcích bez předchozí úpravy analyzované směsi, ve fyziologických roztocích, i v dechu intoxikovaných probantú.

Description

Vynález se týká enzymového elektrotechnického senzoru na stanovení alkoholů na principu jejich enzymové reakce - oxidace katalyzované imobilizovanou alkoholoxidázou v kombinaci s elektrotechnickou detekcí ekvivalentní spotřeby kyslíku a způsobu provedení tohoto enzymového senzoru.

Stanovení primárních alkoholů, především metanolu a etanolu, ale i například n-propanolu, n-butanolu a allylalkoholu je velmi důležité v řadě technologií chemického průmyslu a zvláště v moderních biotechnologiích. V mnoha případech je významné stanovení těchto alkoholů i v surovinách nebo produktech potravinářského průmyslu. Stanovení etanolu je zvlášt potřebné a velmi časté i v soudních a klinických toxikologickýoh laboratořích především z důvodu legislativní kontroly při zajištování bezpečnosti dopravy.

Z uvedených důvodů byla pro stanovení titulních alkoholů vypracována řada postupů chemických, většinou s fotometrickou detekcí, i fyzikálně chemických, z nichž největšího uplatnění doznala plynová chromatografie.

V souvislosti s rozvojem enzymových analytických postupů vyznačujících se vysokou citlivostí, jednoduchostí a speoifitou danou vlastní podstatou enzymové katalýzy, byla věnována pozornost též enzymovému stanovení především etanolu. Při tomto stanovení se využívá katalytického účinku alkoholdehydrogenázy (E.C.1.1.1.1), přičemž je nejběžněji množství oxidovaného etylalkoholu sledováno fotometrioky na základě ekvivalentní tvorby redukované formy koenzymu nikotinamidadenindinukleotidu (NADH).

K enzymovému stanovení etanolu je možno použít též alkoholoxidázu, která katalyzuje oxidaci alkoholu přímo kyslíkem, aniž by byla nutná přítomnosti koenzymu NAD⁺. Substrátová specifita alkoholoxidázy je však širší, zahrnuje i některé další primární alifatické alkoholy, i když jejich relativní rychlost oxidace je ve srovnání s etanolem výrazně nižší. Této skutečnosti může být na jedné straně využito pro stanoveni těchto jednotlivých alkoholů, na druhé straně však může být v některých případech zkreslen výsledek analýzy přítomností kontaminujících alkoholů. Z tohoto hlediska je největší nebezpečí ovlivnění výsledků analýzy přítomností etanolu jako kontaminující složky při stanovení jiných alkoholů. Naopak při stanovení etanolu zvláště ve fyziologických tekutinách, nebo jiných vzorcích fyziologického původu, toto nebezpečí prakticky nepřichází v úvahu.

Průběh enzymové reakce je možno sledovat přímo na základě tvorby nebo spotřeby určité substance, nebo pomoci následných chemických nebo enzymových reakcí vzniklých reakčních produktů. Vedle velmi často používané fotometrie má velký význam spojeni enzymové reakce s elektrochemickými čidly detekujícími substráty, produkty nebo jiné látky ovlivňující průběh enzymové reakce.

Použití volných enzymů je spojeno v některých případech s technickými nebo ekonomickými problémy jejich získáváni. Z tohoto důvodu je velmi atraktivní jejich fixace v blízkosti elektrochemického čidla, čímž je vytvořen senzor - enzymová elektroda, opakovaně použitelný při stovkách analýz bez jakékoliv spotřeby chemikálii, v některých případech pouze pufru.

Pro stanoveni alkoholů byla vypracována příprava enzymové elektrody spočívající v imobilizaci enzymu alkoholoxidázy ve spojení bud s elektrochemickou detekcí vznikajícího peroxidu vodíku, nebo s elektrochemickým stanovením spotřeby kyslíku kyslíkovým článkem Clarkova typu.

S ohledem na stabilitu vytvořeni enzymové elektrody je výhodná imobilizace enzymu kovalentní vazbou. Pro přípravu enzymových elektrod je nejčastěji používanou technikou imobilizace prokříženi molekul, případně v kombinaci s jinými enzymy či přidanou bílkovinou pomocí·; glutaraldehydu.

Tento: problém je řešen enzymovým elektrochemickým senzorem na stanovení alkoholů a způ3 sobem jeho přípravy podle vynálezu. Senzor obsahuje detektor kyslíku, na němž je fixována vrstva nebo membrána s imobilizovaným enzymem alkoholoxidázou. Podstatou vynálezu je, že vrstva nebo membrána je tvořena polymerem obsahujícím reaktivní zbytek organické sloučeniny vybraný ze skupiny obsahující aldehydové skupiny, aminoskupiny, karboxylové skupiny nebo izonitrilové skupiny, přes které je na polymer enzym vázán kovalentní vazbou. Způsob přípravy spočívá v tom, že na polymerni vrstvu obsahující aldehydové skupiny se enzym alkoholoxidáza imobllizuje reakcí svých karboxylových skupin nebo aminoskupin a přidanými složkami obsahujícími izonitrilové a karboxylové skupiny a/nebo aminoskupiny, případně v tom, že na polymerni vrstvu obsahující aminoskupiny se enzym alkoholoxidáza imobilizuje reakcí svých karboxylových skupin s aminoskupinaml obsaženými v polymerni vrstvě a přidanými složkami obsahujícími izonitrilové a aldehydové skupiny. Dále na polymerni vrstvu se enzym alkoholoxidáza imobilizuje reakcí svých aminoskupin s karboxylovýmí skupinami obsaženými v této vrstvě a přidanými složkami obsahujícími izonitrilové a aldehydové skupiny, nebo na polymerni vrstvu obsahující izonitrilové skupiny se enzym alkoholoxidáza imobilizuje reakcí svých karboxylových skupin nebo aminoskupin a přidanými složkami obsahujícími aldehydové skupiny a/nebo aminoskupiny.

Výhodou enzymového elektrochemického senzoru a způsobu jeho přípravy podle vynálezu je zvýšení jeho stability. Pro některé aplikace senzoru s ohledem na další zvýšení jeho stability je výhodné překrýt vrstvu s imobilizovaným enzymem další membránou propustnou pouze pro nízkomolekulární látky.

Enzymový elektrochemický senzor na stanoveni alkoholu podle vynálezu umožňuje rychle a spolehlivě měřit koncentraci alkoholů v technologických vzorcích bez předchozí úpravy analyzované směsi, zvláště výhodný je pro stanovení ethylalkoholu ve fyziologických tekutinách, především plasmě a v dechu intoxikovaných probantů, v rozsahu desetin až stovek promile.

Předmět vynálezu je dokumentován dále uvedenými příklady použití, aniž by se jimi omezoval.

Příklad 1 o

Na terčík z karboxymethylcelulózy byly aplikovány 2 jul ethylaminu 0,5 mol/dm , 1 ul 3 ' cyklohexylisokyanidu a 150 jul alkoholoxidázy v 0,1 mol/dm fosfátového pufru pH 7,5. Po ^z 3 šesti hodinách byl terčík s navázanou alkoholoxidázou důkladně promyt 0,1 mol/dm fosfátovým pufrem pH 7,5 a poté byl fixován na detektor kyslíku. Pomocí takto připraveného enzymového elektrochemického senzoru byl stanoven n-butanol s lineární odezvou v koncentračním rozsahu 10 ® až 10 ³ _mol v dm³.

Příklad 2

Na terčík z modifikovaného bopolymeru styrenu s glycidylmethakrylátem obsahující izo3 nitrilové skupiny byly aplikovány 2 yul glutaraldehydu - 0,5 mol/dm a 150^ul alkoholoxidázy v 0,1 mol/dm³ fosfátovém pufru pH 7,5. Po šesti hodinách byl terčík s navázanou alkoholoxio dázou důkladně promyt 0,1 mol/dm fosfátovým pufrem pH 7,5 a poté byl fixován na detektor kyslíku. Pomocí takto připraveného enzymového elektrochemického senzoru byl stanoven n-buta“6 -3 3 nol s lineární odezvou v koncentračním rozsahu 10 až 10 mol v dm-.

Příklad 3

Na terčík z modifikovaného bopolymeru styrenu s glycidalmethakrylátem obsahující alde3 hydové skupiny byly aplikovány 2 /il kyseliny octové - 0,5 mol/dm , 1/il cyklohexylisokyanidu a 150yul alkoholoxidázy v 0,1 mol/dm³ fosfátového pufru pH 7,5. Po šesti hodinách byl terčík s navázanou alkoholoxidázou fixován na detektor kyslíku a dále překryt membránou z acetátu celulózy propouštějící pouze nízkomolekulární látky. Pomocí takto, připraveného enzymového elektrochemického senzoru byl stanoven ethylalkohol na základě úbytku kyslíku v reakční -7 -4 3 směsi s lineární odezvou v rozsahu 5.10 až 5.10 mol ethylalkoholu v dm .

Příklad 4

Na terčík z porézního skla modifikovaného gama-aminopropyltriethoxysilanem byly apliko3 vány 2/il kyseliny octové - 0,5 mol/dm , 1/il cyklohexylinkyanidu a 150 /il alkoholoxidázy ' 3 v 0,1 mol/dm fosfátového pufru pH 7,5. Terčík byl fixován na detektor kyslíku a dále překryt membránou z acetátu celulózy propouštějící pouze nízkomolekulární látky. Pomocí takto připraveného enzymového elektrochemického senzoru byl stanoven methylalkohol ve vodných roztocích

-7 -4 3 s lineární odezvou v rozsahu koncentrací 5.10 až 4.10 mol v dm .

Claims

1. Enzymový elektrochemický senzor na stanovení alkoholů obsahující detektor kyslíku, na jehož povrchu je fixována vrstva nebo membrána s imobilizovaným enzymem alkoholoxidázou, vyznačující se tím, že vrstva nebo membrána je tvořena polymerem obsahujícím reaktivní zbytek organické sloučeniny vybraný ze skupiny obsahující aldehydové skupiny, aminoskupiny, karboxylové skupiny nebo izonitrilové skupiny, přes které je na tento polymer enzym vázán kovalentni vazbou.

2. Způsob přípravy enzymového elektrochemického senzoru podle bodu 1, vyznačující se tím, že na polymerní vrstvu nebo membránu obsahující aldehydové skupiny se enzym alkoholoxidáza imobilizuje reakcí svých karboxylových skupin nebo aminoskupin a přidanými složkami obsahujícími izonitrilové a karboxylové skupiny a/nebo aminoskupiny.

3. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že na polymerní vrstvu nebo membránu obsahující aminoskupiny se enzym alkoholoxidáza imobilizuje reakcí svých karboxylových skupin s aminoskupinami obsaženými v polymerní vrstvě nebo membráně a přidanými složkami obsahujícími izonitrilové a aldehydové skupiny.

4. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím,-že na polymerní vrstvu nebo membránu obsahující karboxylové skupiny se enzym alkoholoxidáza imobilizuje reakci svých aminoskupin s karboxylovými skupinami obsaženými v polymerní vrstvě nebo membráně a přidanými složkami obsahujícími izonitrilové a aldehydové skupiny.

5. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že na polymerní vrstvu nebo membránu obsahující izonitrilové skupiny se enzym alkoholoxidáza imobilizuje reakcí svých karboxylových skupin nebo aminoskupina přidanými složkami obsahujícími aldehydové skupiny a/nebo aminosku-- . piny.