CS263450B1 - Myší lymfocytární hybridom produkující protilátku proti sekrecní komponentně - Google Patents

Abstract

Řešení se týká myšího lymfocytúrního hybridomu, produkujícího protilátku proti lidské sekreční komponente, uloženého ve sbírce hybridotnů Výzkumného ústavu klinické experimentální onkologie v Brně pod označením RICEO-SC-O5· Samotná monoklonální protilátka hybridomu RICE0-SC-05 je vhodná pro použití v enzymoimunologické a radioimunologické analýze tělních tekutin, jakož i k imunoblotin^u a k histocheijjickému průkazu sejjrečni komponenty na tkáňových řezech a buňkách na úrovní optického a elektronového mikroskopu.

Description

(54) Myší lymfocytární hybridom produkující protilátku proti sekrecní komponentně

Řešení se týká myšího lymfocytúrního hybridomu, produkujícího protilátku proti lidské sekreční komponente, uloženého ve sbírce hybridotnů Výzkumného ústavu klinické experimentální onkologie v Brně pod označením RICEO-SC-O5· Samotná monoklonální protilátka hybridomu RICE0-SC-05 je vhodná pro použití v enzymoimunologické a radioimunologické analýze tělních tekutin, jakož i k imunoblotin^u a k histocheijjickému průkazu sejjrečni komponenty na tkáňových řezech a buňkách na úrovní optického a elektronového mikroskopu.

2634 oO

263 430

Vynález se týká nového hybridomu, t j. hybridního jednobuněčného organismu, sestrojeného buněčnou fúz.í myší myelomové linie P3-X63-Ag8.653 a myší slezinné lymfoidní buňky, produkující protilátku proti lidské sekreční komponentě.

Doposud se protilátky proti sekreční komponentě vyrábějí tak, že je sekreční komponenta opakovaně injikována jako antigen (zpravidla spolu s adjuvans) pokusným zvířatům, a to nejčastěji králíkům či morčatům. Sérum takto imunizovaných zvířat, odebírané po určité době působení antigenu, slouží jako zdroj protilátek, užívaných zejména pro průkaz sekreční komponenty ve tkáních a tělních tekutinách. Tento postup, nazývaný konvenční imunizací, má něko7.ík nevýhod. V séru imunizovaných zvířat se nachází heterogenní směs protilátek, jejichž spektrum je v každém jednotlivém organismu různé a neopakovatelné. Organismus zpravidla vytvoří kromě protilátek vůči žádanému antigenu i protilátky proti nečistotám antigenního preparátu, které je nutné ze sér odstraňovat složitým způsobem, zvaným vysycování.

V případě antisér proti .sekreční komponentě (vis Brandtsaeg Role of <J chain and secretory component in receptor-mediated glandular and hepatic transport of ímmunoglobulins in man. Scand. J. Immunol. 22, 111 aí 146, 1935) je situace ještě komplikována kovalentní vazbou sekreční komponenty s imunoglobulinovými řetězci sekrečního IgA a IgM, které jsou (případně ještě s dalšími bílkovinami) častou kontaminantou purifikováných preparátů sekreční komponenty, takže připravit konvenční antisérum, specifické výhradně pro sekreční komponentu vysycování^. je velmi pracné a jen zřídka vede k uspokojivému výsledku. Výrobní šarže konvenčních antisér se proto dají jen velmi nesnadno standardizovat a vycházejí z výroby v širokém rozmezí kvality.

,?ů

263 450

Pro výrobu každé Serže je třeba připravit značně čistý imunizační antigen a další antigeny pro vysycení balastních protilátek proti nečistotám či proti podobným molekulám,jako jsou např. výše uvedené imunoglobuliny.

Uvedené nedostatky výše zmíněného a dosud používaného postupu odpadnou, je-li k dispozici hybridem, produkující monoklonální protilátku proti sekreČní komponentě, uložený ve sbírce hybridomů Výzkumného ústavu klinické a experimentální onkologie v Brně, žlutý kopec 7, pod označením RICE0-SC-05.

Uvedený hybridom byl získán způsobem.známým z odborné literatury (Pazekas de St. Groth S., Scheidigger Ώ,: Production of monoclonal antibodies s Stratégy and tactios, J. Tmtnvinol. Meth. 35« 1 « 21, 1980, Galfré G., Howe S.C., Mílstein C., Butcher G.W., Howard J.O.: Antibodies to major histocompatibility antigens produced by hybrid cell lineš, Naturé 266: 550 - , 1977) klonováním souboru hybridních buněk, vzniklých fúzí buněk myší myelomové linie P3-X63-Ag8.653 a buněk, získaných ze sleziny myší kmene BALB/c, imunizovaných sekreční komponentou izolovanou z lidského kolostra.

Výhodou lymfooytárního hybridomu SC-05 je, Že produkuje zcela homogenní protilátku, tzv. protilátku monoklonální, fcteje schopna specificky reagovat s lidskou sekreční komponentou. Hybridom SC-05 je možné kultivovat in vitro v médiích vhodných pro pěstování živočišných buněk nebo v podmínkách in vivo v pe ritoneální dutině myší kmene BALB/c . Hybridom SC-05 je vhodný k dlouhodobému uchovávání v konzervách uložených ’v kapalném dusíku. Produkci monoklonální protilátky je možno zahájit po rozmražení buněčné konzervy, aniž by bylo třeba dalšího antigenu. Monoklonálnííprotilátka produkovaná hybridomem SC-05 je specifická výhradně pro glykoprotein o relativní molekulové hmotnosti přibližně 80 000^označovaný jako sekreční komponenta₍ a nereaguje s žádným dalším sekrětovoným proteinem ani jinými bílkovinami (hapř. sérovými), jak bylo zjištěno imunoblotingem, enzymoimunologickým testem, nepřímou imunoperoxidázovou a nepřímouřimunofluorescenční metodou. Průkaz byl zís- 3 263 450 kán po elektroforetickém přenosu rozsáhlého spektra buněčných a tkáňových lyzátů a preparátů lidského kolostra, a. to po separaci bílkovinných komponent v polyakrylamidovém gelu v prostředí dodecylsulfátu sodného za. redukujících podmínek. Po přenosu rozdělených bílkovin na nitrocelulózovou membránu byla sekreční komponenta specificky vizualizována s použitím protilátky SC-05 a následně králičího antiséra proti myším imunoglobulinům konjugovaného s křenovou peroxidázou. Výsledek byl rovněž potvrzen enzymeimunologickým testem, kde byla prokázána vazba protilátky SC-05 na sekreční komponentu, ale nikoliv na imunoglobulin A, imunoglobulin M čí jiné sérové bílkoviny. Pomocí imunoperoxidázové reakce na tkáňových řezech (potvrzené i výsledky nepřímé imunofluorescenční metody - .viz níže) lidských tkání byla u protilátky SC-05 zjištěna reaktivita s epitelíálními tkáněmi sekrečního typu produkujícími sekreční komponentu, nikoliv však s tkáněmi jinými.

V nepřímé .imunofluorescenci využívající protilátky SC-05 a následné inkubace s králičím nebo prasečím antisérem proti myším imunoglobulinům označeným fluorescein-izo-thiocyanátem docházelo u testovaných tkání k vazbě pouze na apikální, případně bazolaterální membránu sekrečních epítelíí a na sekretovaný materiál (sekret) exokrinnich žláz, u buněk s vysokým stupněm sekrece (např. mléčná žláza v laktaci) bylá reakce patrna i v cytoplazmě sekrečních buněk. Jakékoliv jiné buněčné typy a tkáňové komponenty byly negativní.

V ČSSR nebyla dosud podobná monoklonální protilátka dostupná. Lymfocytární hýbridomy produkující protilátky proti sekreční komponentě byly jíž připraveny v zahraničí a jsou též komerčně dostupné a začínají se používat v klinické praxi. Protilátky nabízené v zah.fm J..čí věak postrádají jedinečnou kombinací výhodných.'vlastností charakteristických pro protilátku SC-05» tj· nespojují úzkou specifičnost pro sekreční komponentu s rozpoznáním jak vázané, tak volné formy tohoto glykoproteinu, jakož i'využitelností v různých metodách aplikace včetně imunoblotingu, TCLTSA a RTA a ímunohístochemíe na metacarnem fixovaných parafinových, tkáňových řezech (tedy i v metodách, v nichž protilátky nabízené v zahraničí nelze vůbec použít) ·

263 ,ι

Příklad 1 ’

Za účelem pomnožení hybridomovýoh buněk in vivo bylo aplikováno 1 x 10^ buněk do peritoneální dutiny myči RAIiB/c. Pro lepší uchycení indikovaných buněk byla myš 20 dní před přenosem buněk hybridomu ovlivněna parafinovým olejem (0,5 ml íntraperítoneálně)· Po 1& dnech růstu hybridomu v peritoneální dutině byla myš zabita a vytvořená ascitická tekuť na odebrána· Celkem bylo získáno 3,5 ml ascitická tekutiny, která obsahovala 9 mg/ml imunoglobulinu. Protilátka reagovala se specifickým antigenem (sekreční komponentou) v etízymoimunoíogickém testu až do ředění 1 t 10^. Specifičnost získaná protilátky byla testována na pahelu různých bílkovinných aul,?genů, a to jak v imunoblotingu, tak v enzymoimunologickém testu s vyučí tib prasečí nebo králičí protilátky proti, myšímu ímnnoglobuliηι\ značené křenovou (peroxidázou. Výsledky jsou ahrnuty v tabulce č.1.

Tabulka č.1. Reaktivita protilátky SC-05 s různými bílkovinnými antigeny a buněčnými homoganáty (+' pozitivita,- - negativita)·

Testovaný materiál	Přítomnost sekreční komponenty	Reakce
Vysoce čištěná sekreční komponenta	, ANO	+
Částečně Čištěná — „ —	. AKO	+
Lidské kolostrum	A-NO .	+
Lidské sekreční imunoglobulíny
(slgA, slgM)	ANO v	4-
Sérové imunoglobulíny ·	W.	-
Sérový albumin	NE	-
Lidské keratiny	NE	-
Homogenát .linie fibroblastů (LEP)	NE	w»
Homogenát leukemické linie MOLT 3	RE	«»
Homogenát karclnomové linie HeLa	KB	-
Homogenát linie gliomu U 118 MG	NE	-
Homogenát linie melanomu LT	NE ,
Homogenát linie rhabdonjyo sarkomu L1168	NE	....... .

Z výsledků uvedených v Tabulce 1 je zřejmé, že protilátka 3(3-05 reaguje s volnou i vázanou sekreční komponentou, zatímco je negativní na jiných sérových či buněčných bílkovinách.

263 450

Příklad 2

Pro pomnožení buněk hybridomu RICE0-SC-05 v podmínkách in vitro bylo vpraveno 1 x 10^ hybridomových buněk do kultivační lahve Legroux obsahující 20 ml kultivačního média DMEM s 10% fetálního telecího séra a antibiotiky (viz níže)· Po 5 dnech růstu kultury hybridoroových buněk bylo z lahve získáno kultivační médium obohacené o monoklonální protilátku 30-0¾ uvolňovanou do média hybridomovými buňkami. Tkáňová specifičnost reakce protilátky byla testována nepřímým imunofluorescenčním testem a potvrzena rovněž nepřímou imunoperoxidázovou reakcí, v obou případech na tkáňových řezech. Vzorky tkání uvedených v tabulce č.2 byly odebrány z operačního nebo pitevního materiálu, tkáňové bločky o velikostí 0,5 X 0,5 x 1 cm byly zmraženy v kapalném dusíku a uchovávány pri teplotě -70°0. Pro vlastní testování byly zmražené bločky adaptovány na teplotu -25 až -30°C a na kryostátu byly z každého z nich připraveny řezy o tloušťce 5«7 mikrometrů. Tkáňové řezy byly pak přeneseny na podle žní hi.etologická skla, po zaschnutí na vzduchu byly pak řezy fixovány 10 minut směsí' metanolu''e·· acetonem (1:1) předchíazenou na ~15°O a po vymytí zbylého f'ixatíva 2 x 10 minut ve fyziologickém roztoku s fosfátovým ústojem o pH 7,4 (PBS) byla ra řezy aplikována monoklonální protilátka 30-05· Po inknbnční době 1 hodiny bylá nenavázaná protilátka z řezu odstraněna opakovaným promytím (3 x 5 min) v PBS a na řez byla'nanesen« králičí'nebo prasečí pro tilátka s fluorescein-izo-thiocyanátem» Inkubace (40 - 60 min) byla ukončena trojím, promytím ·ν PBS po 5 min», řezy byly ponechány při pokojové teplotě do zaschnutí a preparáty montovány např· do média s glycerinem.'Výsledky hodnocení reakce protilátky SC-05 s vybranými tkáněmi jsou uvedeny v tabulce č»2.

Tabulka č.2 Reaktivita protilátky SC-05 a normálními lidskými tkáněmi '(+ pozitiv! ta> - egativní reakce)

Druh Tkáně

Produkce sekreční Reakce komponenty

Sekreční epitel mléčné žlázy Sllznice střeva

ANO . +

ABC +

263 450

Tabulka č. 2 - pokrač.

Druh tkáně	Produkce 3ekreční komponenty	Reakce
Sliznice žlučníku	ANO	+
Epitel slinné žlázy	ANO	+
.Játra - žlučovody	ANO	+
Epitel plic	ANO	+
Epidermis	NE	-
Mazová žláza	NE	-
Vícevrstevný epitel j	azyka NE	M
““ n j	ícnu NE	·*»
	ípku NE	•m
Ovarium	NE	-
Testes	NE	M
Nadledviny	NE 1
štítná žláza	NE
Sval příčně pruhovaný	NE	-
Sval hladký	NE	-
Myokard	LE	-
Chrupavka	M2	-
Stroma různých orgánů	TE	-
Slezina	NE	-
Lymfatícké uzliny	?,r*m	-
Periferní nerv	Z'E
Mozek	NE
Mozeček	líh	-
Ze spektra tkání	i.:(vi|s Tabulka č. 2) reagujících 3 pro	tílátkou

í'iý /UM;

SC-C5 je zřejmé, ze yéechhy tkáně produkující sekreční komponentu jsou pozitivní, kdežto všechny tkáně postrádající tento glykoprotein jsou negativní, cos jé dalším důkazem specifičnosti protilátky 30-05 pro sekreční kfftponéntu.

Buňky hybridomů ^XCEO-SO-C5 mají morfologieký obraz typických myelomových bual^.. V podmínkách in vitro rostou v podobě polosuspenzních kultur» Základním kultivačním médiem je Bulbeccova modifikace minimálního esenciálního média (DUEM) doplněná

L-glutaminem (3mM), penicilinem, streptomycinem a inaktivovaným

2S3 450 fetálním telecím sérem dom je kultivován při 3 19,2 hodin. Produkovaná noglobulin Třídy IgG1,

Z ,T7;

>?O /t · i υ h. jeao pro bílátka specif1oky

I) Sokolnice u Brno. Hýbr.i střední generační čas je je myší >nonoklonální imu vážící epitop lidská sokreční komponenty.

Monoklonální protilá.tka, produkovaná hybřidomem RICSOS0-05 reaguje s volnou i vázanou sekreční komponentou a jo použitelná v různých testech včetně irounohistochemie na tká nových řezech, imunoblotingu, enzymoimunologických a rádioimunologických stanovení. Protilátka SC-05 je tedy zejména vhodná k detekcí a kvantifikaci sekreční komponenty v různých tělních tekutinách, ni ční imunity), ale nal.E diagnos,tice na odděleních p k odlišení positivně reaguj / s* v · v < V? s * JP ' £'* v — - .* cnr oplatnč.u.í taká v defektů slis— d i f e r e i¹ c .1 á lni etologická rnstonde, jako pomůck '.<pí ch. produkční ch ad.e n.okarc inomů • od jiných typů nádorů jako např. sarkomů, melanomů, lymfomů či karcinomů neprodukujících sekreční komponentu (např. kar cinomů z vícevrstevných epltelů). Kromě lékařská praxe je pro své vlastností využitelná i v řadě aplikací ve výzkumu, biologie normální i transformované epitolíální buňky a studiu mechanismů sekrece, a to potenciálně v .resortech zdravotnictví, Školství i ČSAV a SAV.

Claims (1)

1. PŘEDMĚT

   Myší lymfocytární hybridom RICE0-SC-C9, vyznačující se tim, že produkuje monoklonální protilátku třídy IgGl proti lidské sekreční komponentě.