CS262317B1 - Činidlo pro stanovení katalytické koncentrace aminotransferas obsahující kyselinu pyridoxal-S-fosforečnou - Google Patents

Abstract

Činidlo s kyselinou pyridoxal-5- -fosforečnou pro stanovení katalytické koncentrace aminotransferas obsahuje kyselinu pyridoxal-5-fosforečnou, tris- (hydroxymety1j aminomethan, neutrální tensidy, např. polyetylenglykol nebo ethoxylovaný oleylalkohol, neutrální plnidlo, např. chlorid sodný nebo draselný, laktosu, maltosu, dextran. Roztok připravený z tohoto činidla je stálý několik měsíců při teplotě +2 až +8 °C.

Description

Vynález se týká činidla pro stanovení katalytické koncentrace aminotransferas obsahujícího kyselinu pyridoxal-5-fosforečnou.

Stanovení katalytické koncentrace aminotransferas v krevním séru nebo plasmě je velmi cennou analysou umožňující značné zpřesnění diferenciální diagnostiky jaterních a ischemických srdečních chorob. Proto se stalo od svého zavedení do klinické praxe jednou z nejčastěji prováděných analys v klinické biochemii.

Práce zveřejněné v posledních deseti letech jednoznačně potvrzují, že kyselina pyrodoxal -5-fosforečná je koenzymem aminotransferas. Hladina endogenní kyseliny pyridoxal-5-fosforečné je dosti variabilní a často je pod fyziologickou koncentrací. Proto je nutné reakční směs saturovat přídavkem kyseliny pyridoxal-5-fosforečné. Tento způsob stanovení katalytické koncentrace aminotransferas je též doporučován i v referenční metodě Mezinárodní federace klinické biochemie.

V řadě případů lze naopak z katalytické koncentrace aminotranferas stanovených v přítomnosti přebytku exogenní kyseliny pyridoxal-5-fosforečné usuzovat i na deficit endogenní kyseliny pyridoxal-5-fosforečné. Tato hodnota nabývá též stále většího klinického významu.

V současné době se pracovní roztok připraví tak, že k pufrovanému roztoku substrátu se přidá kyselina pyridoxal-5-fosforečná. Tím dojde k výraznému snížení stability zásobního roztoku pufru asi na jednu třetinu původní doby. Tento nedostatek může být odstraněn, připraví-li se mnohonásobně koncentrovaný roztok kyseliny pyridoxal-5-fosforečné, který se těsně před použitím přidá do reakční směsi. Avšak kyselina pyridoxal-5-fosforečná je ve vodných roztocích nejen velmi málo rozpustná, ale i omezeně stálá. Rozpustnost kyseliny pyridoxal-5-fosforečné se může snadno zvýšit, upraví-li se pH alkálií na hodnotu vyšší než 6,5. Ukázalo se, že běžné alkálíe jako jsou hydroxid sodný a uhličitan sodný katalyticky urychlují rozklad kyseliny pyridoxal-5-fosforečné. Proto je nutné vybrat takovou substanci, která nastaví pH na požadovanou hodnotu, která bude působit katalytický rozklad a která též bude kompatibilní s biochemickým analysovaným systémem.

Zmíněné nedostatky podstatně snižuje činidlo pro stanovení katalytické koncentrace aminotransferas obsahující kyselinu pyridoxal-5-fosforečnou jehož podstata spočívá v tom, že na 1 mmol kyseliny pyridoxal-5-fosforečné obsahuje 0,5 až 10 mmol tris(hydroxymetyl)aminometanu, 0,01 až 1,5 g neutrálního tensidu, např. polyetylengylkolu nebo ethoxylovaného oleylalkoholu a 0,35 až 60 g neutrálního plnidla, např. chloridu sodného nebo draselného, laktosu, maltosu nebo dextran. Činidlo je možné připravip též jako vodný roztok s 0,55 až 111 moLy vody.

Činidlo s kyselinou pyridoxal-5-fosforečnou podle vynálezu má následující přednosti.

Tris(hydroxymetyl)aminometan působí současně jako alkálie převádějící obtížně rozpustnou kyselinu pyridoxal-5-fosforečnou na dobře rozpustnou sůl a má specifickou vlastnost, že na rozdíl od jiných, běžných alkálií, zvyšuje stabilitu roztoku činidla, v roztocích s kyselinou pyridoxal-5-fosforečnou připravených neutralizací běžnými alkáliemi, např. uhličitanem sodným, po 4 týdnech bylo nalezeno pouze ]0 % původního obsahu účinné látky. Oproti tomu v roztoku obsahujícím tris(hydroxymetyl)aminometan bylo nalezeno 95 % kyseliny pyridoxal-5-fosforečné.

Tris(hydroxymetyl(aminometan je současně kompatibilní s analytickými systémy nejčastěji užívanými pro stanovení katalytické aktivity aminotransferáz.

Příklad 1

Z 1 mmolu kyseliny pyridoxal-5-fosforečné nebo její soli, 0,5 mmol tris (hydroxymetyl)aminometanu, 0,01 g polyetylenglykolu a 0,35 g chloridu sodného se připraví homogenní směs.

Příklad 2

Ve 20 ml destilované vody se rozpustí 0,1 mmol kyseliny pyridoxal-5-fosforečné, mmol tris(hydroxymetyl)aminometanu, 6 g chloridu draselného, 1 g ethoxylovaného oleylalkoholu.

Příklad 3

K 1 ml reakční směsi obsahující 122 mmol. 1 ¹ tris. (hydroxymetyl) aminometanu, 244 111101.1^-^

-1 -1 kyseliny L-asparagové, 0,20 mmol-1 nikotinamidadenindinukleotid, 7,6 ukat.l malátdehydrogenasy, 11 ukat.l” laktátdehydrogenasy se přidá 20 ul roztoku činidla s kyselinou pyridoxal-5-fosforečnou připraveného dle příkladu 2 a 100 ^il analysovaného séra. Po 10 minutách preinkubace při 30 °C je enzymová reakce nastartována 100 /il kyseliny 2-oxoglutarové o koncentraci 144 mmol.!^-1. Zaznamenává se změna absorbance při 340 nm za časovou jednotku při 30 °C.

Claims (2)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   1. Činidlo pro stanovení katalytické koncentrace aminotransferas obsahující kyselinu pyridoxal-5-fosforečnou vyznačené tím, že na 1 mmol kyseliny pyridoxal-5-fosforečné obsahuje 0,5 g až 10 mmol tris(hydroxymetyl)aminometanu, 0,01 až 1,5 g neutrálního tensidu, například polyetylenglykolu nebo etoxylovaného oleylalkoholu a 0,35 až 60 g neutrálního plnidla, například chloridu sodného nebo draselného, laktosu, maltosu nebo dextran.
2. 2. Činidlo pro stanoveni katalytické koncentrace aminotransferas podle bodu 1 vyznačené tím, že obsahuje 0,55 až 111 molů vody.