CS262264B1

CS262264B1 - Způsob kultivace hybridomů a myelomových buněk

Info

Publication number: CS262264B1
Application number: CS867159A
Authority: CS
Inventors: Jan Rndr Csc Kovar; Frantisek Rndr Drsc Cle Franek
Original assignee: Kovar Jan; Franek Frantisek
Priority date: 1986-10-03
Filing date: 1986-10-03
Publication date: 1989-03-14
Also published as: CS715986A1

Abstract

Způsob kultivace hybridomů a myelomových buněk na syntetickém kultivačním médiu, které obsahuje základní složky jako jsou anorganické soli, monosacharidy, aminokyseliny, vitaminy, látky tlumící změny pH a indikátor změny pH, a suplement spočívá v tom, že se kultivace provádí na základním médiu v přítomnosti 2x10"^ až lxlO-2 mol/1 suplementu, tvořeného nejméně jednou vodorozpustnou sloučeninou železa. Kultivaci je výhodné provádět ještě v přítomnosti sloučenin stopových biogenních prvků, kyseliny askorbové, steroidních látek nebo aminu při teplotě 4 až 40 °C, pH kultivačního média 6,0 až 8,0 v atmosféře nad kulturou obsahující 1 až 10 i obj. oxidu uhličitého.

Description

Vynález se týká způsobu kultivace hybridomů a myelomových buněk in vitro.

Hybridomy konstruované somatickou hybridisací myelomové buňky a lymfocytu syntetizujícího protilátkou jsou průmyslově používány k výrobě monoklonálních protilátek. Myelomové buňky, do nichž je metodami genového inženýrství zaveden gen pro biologicky aktivní bílkovinu, například enzym, inhibitor enzymu, hormon, imunoregulátor, jsou též průmyslově používány pro výrobu těchto bílkovin.

Dosud se hybridomy a myelomové buňky kultivují tak, že se buňky nejprve namnoží v laboratorních nádobách, jako jsou plastikové misky a lahve, kultivace a produkce bílkoviny se dokončí v průmyslovém fermentoru. Monoklonální protilátka nebo jiná do kultivačního média vyloučená bílkovina se získává z kultivačního média po odstředění nebo odfiltrováni buněk. Isolace produktované bílkoviny je tím obtížnější a nákladnější, čím více bílkovin původní kultivační médium obsahovalo. Koncentrace produkované bílkoviny, například monoklonální protilátky v kultivačním médiu, je poměrně nízká. Ekonomická výhodnost výroby je limitována cenou složek kultivačního média. Syntetické kultivační médium obsahuje základní kultivační složky a suplement.

Základní kultivační složky jsou anorganické soli, například chlorid sodný a fosforečnan sodný, monosacharidy, například glukosa nebo galaktosa, aminokyseliny, například tryptofan, methionin, threonin, glutamin, vitaminy, například thiamin a nikotinamid, látky tlumící změny pH, například N-2-hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonová kyselina, popřípadě pyrohroznan sodný, antibiotika a indikátor změny pH. Tyto základní kultivační složky jsou pro hybridomy a myelomové buňky, stejně tak jako pro jiné živočišné buňky samy o sobě nedosta tečné, a proto jsou doplňovány 10 % objemovými krevního séra, například hovězího, koňského nebo fetálního telecího séra. Krevní sérum vnáší do kultivačního média neznámé látky, z nichž některé růst buněk podporují, jiné mohou růst potlačovat. Krevní séra je proto nutné před použitím testovat a vybírat vhodné šarže. Tím vzrůstají náklady na výrobu kultivačního média. Protože vhodných růst podporujících krevních sér byl nedostatek, byly vyvinuty receptury kultivačních médii, tzv. bezsérových, v nichž je sérum nahrazeno několika definovanými bílkovinami, nejčastěji transferinem, sérovým albuminem a insulinem a případně dalšími látkami/ jako jsou mastné kyseliny, aminy a nízkomolekulární hormony (Kovář J., Franěk F., Methods in Enzymology 121:277, 1986).

Veškeré bílkoviny dosud přidávané do kultivačních médií pro kultivaci hybridomů nebo myelomových buněk musí být prosté toxických příměsí, v důsledku tohoto vysokého stupně čistoty je jejich cena poměrně vysoká.

Další nevýhodou stávajících kultivačních médií je obtížná isolace produktů životní činnosti hybridomů popřípadě myelomových buněk z kultivačního média, která spočívá v několika násobném oddělování žádaných produktů bílkovinné povahy od bílkovin obsažených v kultivačním médiu v mnohonásobném přebytku.

Uvedené nevýhody odstraňuje způsob kultivace hybridomů nebo myelomových buněk na syntetickém kultivačním médiu obsahujícím základní složky, které jsou tvořeny anorganickými solemi, monosacharidy, aminokyselinami, vitaminy, látkami tlumící pH, indikátorem změny pH a suplementem podle vynálezu. Jeho podstata spočívá v tom, že se kultivace provádí na -5 -2 základních složkách v přítomnosti 2x10 az 1x10 mol/1 vodorozpustných sloučenin železa.

Kultivaci je vhodné provádět dále v přítomnosti 0,002 až 2 mg/1 sloučenin biogenních stopových prvků, například selenu a zinku, nebo 1 až 100 mg/1 kyseliny askorbové, popřípadě 0,000 1 až 0,01 mg/1 steroidních látek, jako je třeba hydrokortison.

Kultivaci je výhodné provádět též za přítomnosti 0,1 až 15 mg/1 aminů, například ethano1aminu.

Kultivace hybridomu, popřípadě myelomových buněk se provádí při teplotě 4 až 40 °C a pH kultivačního média 6,0 až 8,0 a v atmosféře nad kulturou obsahující 1 až 10 % obj. oxidu uhličitého.

Bylo zjištěno, že jedinou zcela nepostradatelnou bílkovinnou složkou bezsérového kultivačního média je transferin (Kovář J., Franěk F., Methods in Enzymoiogy 121:277, 1986). Jelikož transferin funguje jako přenašeč železa z prostředí do buňky, byly v dalších pokusech přidávány do kultivačního média různé vodorozpustné sloučeniny železa ve vyšších koncentracích než jaké kdy byly v kultivačních médiích dosud použity.

Řada autorů (například Phillips P. D., Cristofalo V. J., Exp. Cell Res., 134:297, 1981; Perez-Infante V., Mather J. P., Exp. Cell Res., 142 : 325, 1982; Taetle R., Thyner K., Castagnola J., To D., Mandelsohn J., J. Clin. Invest., 57:1 061, 1985) použila jako náhradu transferinu vodorozpustné sloučeniny železa v koncentracích 1x10 ⁶ až 20x10 ⁶ mol/1.

Tyto koncentrace jsou však v případě hybridomů a myelomových buněk nedostatečné.

Ukázalo se, že sloučeniny železa nejsou pro hybridomy a myelomové buňky toxické až -2 do koncentrace 1x10 mol/1 a naopak umožňují růst hybridomu a myelomových buněk v kultivačním médiu, v němž není přítomna žádna bílkovina. Mezi sloučeniny železa, schopné nahradit transferin, patří například síran železnatý, chlorid železitý, citronan železitý a ferikyanid “5 — 2 draselný. Účinné koncentrace se pohybují v rozmezí 2x10 až 10 mol/1.

Hlavními výhodami způsobu kultivace podle vynálezu je podstatné snížení ceny kultivačního média, které se promítá i do ceny buňkami vylučované bílkoviny a snadná isolace bílkoviny produkované hybridomovými popřípadě myelomovými buňkami, protože buňkami vylučovaná bílkovina je jedinou bílkovinou nacházející se po kultivaci v kultivačním médiu.

Způsob kultivace hybridomů a myelomových buněk podle vynálezu je dokumentován v následujících příkladech.

Příklad 1

Buňky hybridomu PLV-01 byly inokulovány v množství 50x10^ buněk/ml do 6 ml bezbílkovinného kultivačního média, které jako základní složky obsahovalo médium RPMI 1 640, L-glutamin (300 ^g/ml) , pyrohroznan sodný (110 ^ug/ml) , N-2-hydroethylpiperazin-N'‘-2-ethansulfonovou kyselinu (1,5x1ο*² mol/1), penicilín (100 jednotek/ml), streptomycin (100^ig/ml) a gentamycin (40 {Ug/ml). Bezbílkovinné kultivační médium pak obsahovalo jako suplement tyto přidané látky: ethanolamin (2x10 mol'l), kyselinu askorbovou (2x10 mol/1), hydrokortison (5x10 $ mol/1), síran kademnatý (CdSO^.8/3 H₉0, 5x10 ⁸ mol/1), chlorid kobaltnatý (CoCl₉.6 H„0, lxlO”⁸ mol/1), síran mědnatý, (CuSO..5 H?O, lxl0~⁸ mol/1), molybdenan amonný ( (NH^) 6Μο_?0₂₄ · 4 ^0, 5x10 mol/1), chlorid manganatý (MnCl2«4 ^0, 5x10 mol/1), síran nikelnatý (NiSO..6 Η,.Ο, 2,5x10 ¹⁰ mol/1), seleničitan sodný (Na„SeO~, 4x10 ⁸ mol/1), ^^-7 -10 křemičitan sodný (^28103, 2x10 mol/1), chlorid cínatý (SnCl2»2 H2⁰' 2,5x10 mol/1), vanadičnan amonný (NH^VO^i 2,5x10 $ mol/1), síran zinečnatý (ZnSO^.7 I^O, 1x10 ⁶ mol/1), a citronan železitý (5x10 mol/1).

Po 4 dnech kultivace v termostatu ve vlhčené atmosféře 5 % obj. oxidu uhličitého ve vzduchu při teplotě 37 °C a pH = 7,6 se buňky namnožily na l,58xl0⁸ buněk/ml. Počet buněk se tedy během kultivace přibližně ztřicetinásobil.

Příklad 2

Stejným způsobem jako v příkladu 1 byly kultivovány buňky myelomu FO a hybridomu CMH-02 v 1-ml objemech kultivačního média v jamkách plastikové kultivační destičky. Po jednom dnu kultivace za výše uvedených podmínek byl stanoven počet buněk v jamce a po dalších 24 hodinách byl stanoven počet buněk znovu. Tak byla stanovena střední doba zdvojení v exponenciální růstové fázi, která je pro myelom FO 15,6 hod. a pro hybridom CMH-02 14,6 hod.

Příklad 3

Buňky hybridomu PLV-01 byly inokulovány v množství 10xl0³ buněk do 0,1 ml základních složek uvedených v příkladu 1. Jako suplement bylo do kultivačního média přidáno 2x10 mol/1 ferikyanidu draselného.

Po třech dnech kultivace při teplotě 37 °C a 4,5 % obj. oxidu uhličitého, ve vlhčené atmosféře, při pří média 7,4 se buňky namnožily na 42xl0³.

Příklad 4

Buňky hybridomu PLV-01 byly inokulovány v množství 10xl0³ buněk do 0,1 ml základních složek uvedených v příkladu 1. Jako suplement bylo do kultivačního média přidáno 1x10 mol/1. síranu železnatého.

Po třech dnech kultivace při teplotě 37 °C a 4,5 % obj. oxidu uhličitého ve vlhčené 3 atmosféře při pH média 7,4 se buňky namnožily na 33x10 .

Příklad 5

Buňky hybridomu PGG-05 byly inokulovány v počtu 60x10 buněk do objemu 1 ml bezbílkovinného kultivačního média jako v příkladu 1. Kultivace probíhala za stejných podmínek jako v příkladu 1.

Pro srovnání byl tentýž hybridom v témže množství inokulován do základních složek, k nimž byl přidán transferin v koncentraci 5 mg/1 a insulin v koncentraci 10 mg/1.

Po 4 dnech kultivace byl stanoven počet buněk v obou kultivačních médiích a koncentrace monoklonální protilátky, vyjádřená v relativních jednotkách absorbance s použitím enzymoimunologického testu založeného na stanovení peroxidasové aktivity.

Při kultivaci podle vynálezu v přítomnosti citronanu železitého v bezbílkovinném kultivačním médiu stoupl počet buněk na 675x10^ /ml a koncentrace monoklonální protilátky vyjádřená v relativních jednotkách absorbance měla hodnotu Α^θ = 1,32. Ve srovnávacím pokusu při kultivaci v bílkovinném médiu s transferinem a insulinem stoupl počet buněk na 731xl0^/ml a koncentrace monoklonální protilátky vyjádřená v relativních jednotkách absorbance měla hodnotu A_4go = 1,26.

Claims

PŘEDMÉT VYNÁLEZU

1. Způsob kultivace hybridomů a myelomových buněk na syntetickém kultivačním médiu obsahujícím základní složky tvořené anorganickými solemi, monosacharidy, aminokyselinami, vitaminy, látkami tlumící změny pH a indikátorem změny pH, a suplement, vyznačující se tím, -5 -2 že se kultivace provádí na základních složkách v přítomnosti 2x10 aŽ 1x10 mol/1 suplementu tvořeného nejméně jednou vodorozpustnou sloučeninou železa, například chloridem železitým, citronanem železitým, síranem železnatým nebo ferikyanidem draselným při teplotě 4 až 40 °C a pH kultivačního média 6,0 až 8,0 v atmosféře nad kulturou obsahující «1 až 10 % obj. oxidu uhličitého.
2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se kultivace provádí v přítomnosti 0,001 až 2 mg/1 sloučenin stopových biogenních prvků, například selenu a zinku.
3. Způsob podle bodů 1 a 2, vyznačující se tím, že se kultivace provádí v přítomnosti 1 až 100 mg/1 kyseliny askorbové.
4. Způsob podle bodů 1 až 3, vyznačující se tím, že se kultivace provádí v přítomnosti 0,000 1 až 0,01 mg/ΐ steroidních látek, například hydrokortisonu.
5. Způsob podle bodů 1 až 4, vyznačující se tím, že se kultivace provádí v přítomnosti 0,1 až 15 mg/1 aminů, například ethanolaminu.