CS260806B1

CS260806B1 - Suplement kultivačních medií hybridomů a myelomových buněk

Info

Publication number: CS260806B1
Application number: CS867157A
Authority: CS
Inventors: Jan Kovar; Frantisek Franek
Original assignee: Jan Kovar; Frantisek Franek
Priority date: 1986-10-03
Filing date: 1986-10-03
Publication date: 1989-01-12
Also published as: CS715786A1

Abstract

Suplement kultivačních médií hybridomů a myelomových buněk je tvořen nejméně jednou vodorozpustnou sloučeninou železa. Suplement může dále obsahovat 2 χ 102 mg sloučenin stopových biogenních prvků, 1 x 10”1 až 5 χ 103 mg kyseliny askorbové, 1 x 10-5 až 5„x 10”* mg steroidních látek a 1 χ 10“2 až 7,5 x 102 mg aminů na 1 mmol vodorozpustných sloučenin železa. Tento suplement je vhodnou náhradou bílkovinných suplementů jako jsou krevní sera nebo čisté bílkoviny

Description

Vynález se týká suplementu kultivačních médií pro hybridomy a myelomové buňky.

Dosud se hybridomy a myelomové buňky kultivují in vitro na médiích, která kromě základních složek jako jsou anorganické soli, monosacharidy, aminokyseliny, vitaminy, antibiotika, látky tlumící změny pH a indikátor změny pH musí obsahovat bílkoviny. Je známo, že v kultivačním médiu bez bílkovinných suplementů se nemohou hybridomy ani myelomové buňky množit. Proto se k základnímu médiu přidává až 10% obj. krevního séra, například hovězího, koňského nebo fetálního telecího séra. Krevní sérum vnáší do kultivačního média neznámé látky, z nichž některé růst hybridních a myelomových buněk podporují, jiné mohou růst inhibovat. Krevní séra je proto nutné před použitím testovat a vybírat vhodné šarže, čímž vzrůstají náklady na výrobu kultivačních médií. Proto bylo krevní sérum v řadě receptur na kultivační média nahrazeno směsí čistých bílkovin, například transferinem, sérovým albuminem, insulinem a případně dalšími látkami, jako jsou nenasycené mastné kyseliny, aminy a nízkomolekulární hormony.

Bílkoviny přidávané do kultivačního média musí být čištěny do vysokého stupně, aby byly prosté toxických příměsí a jejich cena je proto poměrně vysoká.

Další nevýhodou kultivačních médií, obsahujících bílkovinný suplement, je obtížná isólace bílkovinných produktů vylučovaných hybridomy, popřípadě myelomovými buňkami.

Nedostatky bílkovinných suplementů odstraňuje suplement podle vynálezu, který je tvořen nejméně jednou vodorozpustnou sloučeninou železa, například síranem železnatým, citronanem železitým, chloridem železitým nebo ferikyanidem draselným.

-4 2

Suplement dále může obsahovat 2 x 10 až 1 x 10 mg —1 v 3 sloučeniny stopových biogenních prvků, 1 x 10 až 5 x 10 mg kyseliny askorbové, 1 χ'ΙΟ až 5 x 10 ¹ ng steroidní látky a 1 x 10 až 7,5 x 10 mg aminů na 1 mmol vodorozpustných sloučenin železa.

- 2 260 806

Suplement se přidává do kultivačního média v množství odpovídajícím výsledné koncentraci 2 x 10 až 10 molů vodorozpustné sloučeniny·železa na 1 1 kultivačního média.

Bylo totiž zjištěno, že jedinou nepostradatelnou složkou bílkovinných suplementů je transferin (kovář J., Franěk F., Methods in Enzymology l2li 277, 1986). Transferin funguje jako přenašeč železa z kultivačního prostředí do buňky. Jeho funkci lze nahradit přítomností vodorozpustné sloučeniny železa vyšší koncentraci.

Řada autorů (například Phillips P.D., Cristofalo V.J.,

Exp. Cell Rés., 134: 297, 1981; Perez-Infante V., Mather J.P., Exp. Cell Res., 142: 325, 1982; Taetle R., Rhyner K., Castagnola J., To D., Mendelsohn J., J. Clin. Invest., 75: 1061, 1985) použila jako náhradu transferinu vodorozpustné sloučeniny že·6 leza v koncentracích 1 x 10 až 20 x 10 mol/1. Tyto koncentrace jsou však v případě hybridomů a myelomových buněk nedostatečné.

Bylo zjištěno, že sloučeniny železa v koncentraci vyšší než 2 x 10 mol/1 umožňují růst hybridomů a myelomových buněk a nejsou pro hybridomy a myelomové buňky toxické až do kon-3 centrace 1 x 10 mol/1.

Výhodou náhrady bílkovinných suplementů suplementem podle vynálezu je podstatné snížení ceny kultivačního média a snadná isolace bílkovinných produktů vyloučených hybridomy nebo myelomovými buňkami, neboň jsou jedinou bílkovinou nacházející se po kultivaci v kultivačním médiu.

Použití vodorozpustných sloučenin železa podle vynálezu je dokumentováno následujícími příklady.

Příklad 1

Kultivační médium obsahovalo jak základní složky RPMI 1640 v němž byl rozpuštěn L-glutamin (300 ^ug/ml), N-2-hydroxyethylpiperazin-N*-2-ethansulfonová kyselina (1,5 x 10 mol/1), penicilín (100 jednotek/ml), streptomycin (100 jig/ml) a gentamycin , _ν 260 806 (40 pg/ml).

Jako suplement obsahovalo kultivační medium 5 χ· ΐδ^ mol/1 **6 citronanu železitého, 1 x 10 mol/1 síranu zinečnatého, 2,5 “ (9 “10 x 10 mol/1 vanadičnanu amonného, 2,5 x 10 mol/1 chloridu

-7 cínatého, 2 x 10 mol/1 křemičitanu sodného, 4 x 10 seleničitanu sodného, 2,5 x 10^-10 síranu nikelnatého, 5 x 10¹⁰mol/l “10 —8 chloridu manganatého, 5 x 10 molybdenanu amonného, 1 x 10 mol/1 síranu mě3natého, 1 x 10 ® mol/1 chloridu kobaltnatého, “8 “9 x 10 síranu kademnatého, 5 x 10 mol/1 hydrokortisonu, “5 -5 x 10 mol/1 kyseliny askorbové a 2 x 10 mol/1 ethanolaminu.

V tomto mediu byly kultivovány hybridomy PLV-01 a PGG-05.

Po 4 dnech kultivace vzrostl počet buněk z původního počtu 60 x 10® buněk v 1 ml na 819 x 10® buněk/1 ml u hybridomu PLV-01 3 a na 675 x 10 buněk/1 ml u hybridomu PGG-05.

Koncentrace monoklonální protilátky stanovená s pomocí enzymoimunologického testu založeného na stanovení peroxidasové aktivity a vyjádřená v relativních jednotkách absorbance dosáhla hodnoty ^A4g_O ^e 0,298 pro hybridom PLV-01 a hodnoty ^Α49Ο^β l'®2 P^ro hybridom PGG-05.

Příklad 2

Kultivační medium obsahovalo základní složky stejné jako v příkladu 1. Pro srovnání byl přidán suplement, který obsahoval 5 mg/1 transferinu a 10 mg/1 insulinu.

V tomto mediu byly kultivovány hybridomy PLV-01 a PGG-05.

Po č dnech kultivace vzrostl počet buněk z původního počtu x 10® buněk/ml na 706 x 10® buněk a hodnota ^Α49θ* 0,310 u hybridomu PLV-01. U hybridomu PGG-05 vzrostl počet buněk na 731 x 10 a hodnota ^A49O^S 1,26.

Příklad 3 260 808

Buňky PLV-Ol byly inokulovány v počtu 10 x ÍO^{2 3 *} buněk do 0,1 ml kultivačního media, které obsahovalo základní složky stejné jako v příkladu 1 a jako suplement obsahovalo síran železnatý v koncentraci 5 x io“⁵ mol/1. Po 3 dnech kultivace * 3 se buňky namnožily na 26 x 10 .

Claims

předmEt vynálezu

1. Suplement kultivačních medií hybridomů a myelomových buněk,vyznačující se tím, že je tvořen nejméně jednou vodorozpustnou sloučeninou železa, výhodná síranem železnatým, citronanem železitým, chloridem železitým nebo ferikyanidem draselným,
2, Suplement podle bodu 1 vyznačující se tím, že obsahuje

2 x 10 až 1 x 10 mg sloučenin stopových biogenních prvků, 1 x ÍO¹ až 5 x 10³ mg kyseliny askorbové, 1 x 10 až 5 x ÍO^- ¹ mg steroidních látek a 1 x' 10 až 7,5 χ 10^ mg aminů na 1 mmol vodorozpustných sloučenin železa.