CS261783B1 - Způsob radioimunochemického stanovení lidského choriového gonadotropinu - Google Patents

Abstract

Způsob radioimunochemického stanovení lidského choriového gonadotropinu spočívá v tom, že se na protilátku proti lidskému choriovému gonadotropinu, imobilizovanou na aktivované porézní sklo o velikosti částic 3 až 30^un, působí roztokem radioizotopem značeného choriového gonadotropinu, například 125I, v objemovém poměru 2 až 3:1 k imobilizované protilátce a analyzovaný vzorek krevního séra nebo moči v obj. poměru 1:2 až 3 k inkubačni směsi, obsahující imobilizovanou protilátku, rádio-;..·- izotopem značený choriový gonadotropin a analyzovaný vzorek, přičemž se po 0,5 až 2 hodinách inkubace na nosiči vytvořený imunochemický komplex dostředí a z jeho změřené radioaktivity se určí obsah lidského choriového gonadotropinu v analyzovaném vzorku.

Description

Vynález se týká způsobu radioimunochemického stanovení lidského choriového gonadotropinu /HCG/.

Stanovení choriového gonadotropinu má velký význaim pro průkaz těhotenství v jeho počátečním stadiu. Jeho syntéza nastává již v nejranější fázi vývoje placenty a tak se brzy tento hormon objeví v krevní plazmě, respektive v moči těhotné ženy. Vzhledem k tomu, že je pomalu katabollzován, přetrvává jeho výskyt v organismu řadu dní. Toto skutečnosti využívaly dřívější metody průkazu gravidity žen, založené na průkazu choriového gonadotropinu pomoci biologických testů.

V poslední době se objevily možnosti průkazu, resp. stanovení choriového gonadotropinu pomocí imunochemických technik. Vedle orientačních aglutinačnich testů je to zvláště radioimunostanovení /RIA/ založené na poměrné saturaci protilátky proti choriovému gonadotropinu 125 tímto antigenem obsaženým v analyzovaném vzorku a antigenem značený například I. Tato imunochemická metoda umožňuje stanovit choriový gonadotropin v rozmezí 0 až 800 jednotek/1. Důležitým krokem tohoto stanovení je separace volného a vázaného hormonu na protilátku.

Při klasickém postupu se tohoto oddělení dosahuje obvykle některou precipitační těchnikou, nejčastěji metodou druhé protilátky. Vzhledem k tomu, že vazba choriového gonadotropinu na specifickou protilátku je reverzibilní povahy,'je u uvedených separací nebezpečí porušení rovnováhy mezi volným a vázaným HCG. Značného zjednodušení a výrazné zrychlení celého postupu analýzy je možno dosáhnout imobilizací protilátky na vhodný nosič.

K imobilizaci specifické protilátky proti HCG se v poslední době začaly používat syntetické polymery, na které se protilátka imobilizuje kovalentní vazbou. Při použití těchto nosičů je .však třeba inkubační směs během saturace třepat nebo míchat.

Tuto nevýhodu, která pro svoji experimentální náročnost snižuje přednosti použití imobilizované protilátky, odstraňuje způsobu radioimunochemického stanovení choriového gonadotropinu dle vynálezu spočívající v imobilizaci specifické protilátky proti choriovému gonadotropinu na porézní sklo o velikosti částic 3 až 30 um s povrchem nebo chloridu titanitého s jeho následnou hydrolýzou na povrchu nosiče, k vytvořenému konjugátu specifické protilátky imobilizované na skleněný 125 nosič se přidá roztok radioizotopem značeného choriového gonadotroponu, například I, v obj . poměru 2 až 3:1 k imobilizované protilátce a analyzovaný vzorek krevního séra nebo moči v obj. poměru 2:1 až 3 k inkubační směsi, sestávající z imobilizované specifické protilátky, radioizotopem značeného choriového gonadotropinu a analyzovaného vzorku. Roztok radioizotopem značeného choriového gonadotropinu je možno barvit saturovanou červeni LG 200 % v koncentraci max. 45 ml/1 ředicího pufru a suspenzi s imobilizovanou protilátkou lze obarvit saturovanou modří L4G 300 % v koncentraci max . 15 mg/1 pufru. S ohledem na způsob imobilizace protilátky a strukturu použitého nosiče se způsobem podle vynálezu dosáhne rovnováhy imunochemické interakce za 0,5 až 2'h při' °C, přičemž sedimentační rychlost použitého nosiče je natolik malá, že není nutno inkubační směs míchat či třepat. Po uvedené době se nosič s imobilizovanou pritilátkou a na ní imunochemickou interakcí navázaným hormonem odstředí a na základě změřené radioaktivity se stanoví obsah choriogonadotropního hormonu v analyzovaném vzorku krevního séra, respektive moči.

Výhodou způsobu stanovení choriogonadotropního hormonu podle vynálezu je především výrazné zkrácení inkubační doby a celkové zjednodušení celého postupu. Toto zkrácení má velký význam s ohledem na potřebnou rychlost určeni hodnoty obsahu tohoto hormonu zejména při screeningovém vyšetření žen, kdy lze určit gravidní ženy do jedné hodiny. K dalším výhodám způsobu dle vynálezu patři zmenšený počet lahviček obsažených v soupravě pro stanovéní a z toho plynoucí i menší počet piperovacích kroků, odstranění nutnosti používání termostatu a zkrácení doby centrifugace, případně i používaného počtu otáček centrifugy. Způsob podle vynálezu sníží počet pipetovacích kroků a barevné značení přidávaných komponent umožňuje vizuální kontrolu celého analytického postupu.

Vynález je dokumentován příklady, aniž by se jimi omezoval.

Přiklad l

K jednomu hmotnostnímu dílu porézního skla o velikosti částic 3 až 30 /um se přidá 10 hmotnostních dílů 20 % hmot. roztoku gamma-aminopropyltriethoxysilanu v toluenu a zahřívá se pod zpětným chladičem. Po 24 h se sklo promyje toluenem. Po vysušeni se k 1 hmotnostnímu dílu modifikovaného skla přidá 10 objemových dílů 5 % hmot. glutaraldehydu a směs se třepe při 37 °C. Poté se aktivované sklo promyje na fritě 0,05 M fosfátovým pufrem pH 7,5. K jednomu hmotnostnímu dílu vlhkého aktivovaného nosiče se přidá 2,5 objemových dílů specifické protilátky proti choriovému gonadotropinu. Ke 100 £il suspenze této specifické protilátky zředěné 0,05 M fosfátovým pufrem pH 7,5 v poměru 1:100 se přidá 100 £il ¹²⁵I značeného hormonu a 100 (ll analyzovaného vzorku krevního séra či moči. Inkubační směs se ponechá 2 h při laboratorní teplotě 20 °C a poté se odstředí 10 minut 3 000 ot/min. Po odsátí supernatantu se změří radioaktivita sedimentu. Takto lze stanovit tento hormon v požadovaném koncentračním rozsahu 0 až 800 IU/1 s variačním koeficientem stanoveni do 5 %.

Příklad 2

Ke 100 jíl suspenze imobilizované protilátky připravené shodným postupem pH 7,5 v poměru 125

1:15 se přidá 100 {ll I značeného hormonu a 100 ul analyzovaného krevního séra nebo moči. Dalším postupem shodným jako v příkladu 1, při úpravě inkubační doby na 30 minut, je možno screeningově určit graviditu žen, jejichž moč je testována.

Příklad 3

Jeden hmotnostní díl porézního skla o velikosti částic 3 až 30/um se přidá k 10 dílům 12,5 % hmot. chloridu titanitého v koncentrované kyselině chlorovodíkové a nechá se 20 minut třepat při 40 °C. Pak se odsaje a suší při 45 °C po dobu 6 h v termostatu. Usušené aktivované sklo se 6krát promyje vždy 20 hmotnostními díly vody a nakonec se usuší při 45 °C. Imobilizace specifické protilátky na takto připravený nosič se provede shodným postupem jako v příkladu

1. Dalším postupem, shodným jako v příkladu 1, lze stanovit koncentraci hormonu v analyzovaných vzorcích v koncentračním rozsahu 0 až 80 IU/1.

Příkladě

Choriogonadotropní hormon se stanoví shodným postupem jako v příkladu 1 až 3 s tím, že se z důvodu zlepšení vizuální kontroly pipetování obarví roztok radioizotopem značeného hormonu saturovanou červení LG 200 % /45 mg/1 ředícího pufru/ a suspenze s imobilizovanou protilátkou saturovanou modří L4G 300 % /15 mg/1 pufru/.

Claims (4)

1. Způsob radioimunochemického stanovení lidského choriového gonadotropinu vyznačující se tím, že se na protilátku proti lidskému choriovému gonadotropinu imobilizovanou na aktivované porézní sklo o velikosti částic 3 až 30Aim působí roztokem radioizotopem značeného 125 ' choriového gonadotropinu, například I, v obj. poměru 2 až 3:1 k imobilizované protilátce a analyzovaný vzorek krevního séra nebo moči v obj. poměru 1:2 až 3 k inkubační směsi, obsahující imobilizovanou protilátku, radioizotopem značený choriový gonadotropin a analyzovaný vzorek, přičemž se po 0,5 až 2 hodinách inkubace na nosiči vytvořený imunochemický komplex odstředí a z jeho změřené radioaktivity se určí obsah lidského choriového gonadotropinu v analyzovanému vzorku.

2. Způsob podle.bodu 1, vyznačující se tím, že se protilátka proti lidskému choriovému gonadotropinu imobilizuje na povrch porézního skla aktivovaného reakcí s roztokem 5 až 50 % hmot. gamma-aminopropyltriethoxysilanu a následným působením roztoku 5 ažl5 % hmot. glutaraldehydu.

3. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se protilátka proti lidskému choriovému gonadotropinu imobilizuje na povrch porézního skla aktivovaného roztokem 10 až 20 4 hmot. chloridu tranzitního kovu, například chloridu titanitého, s následnou hydrolyzou vodou těchto solí na povrchu nosiče.

4. Způsob podle bodů 1 až 3, vyznačující se tím, že se roztok radioizotopem značeného choriového gonadotropinu obarví saturovanou červení LG 200 % v koncentraci 30 až 60 mg/1 ředícího pufru a supsenze s imobilizovanou protilátkou se obarví saturovanou modří L4G 300 4 v koncentraci 10 až 20 mg/1 ředícího pufru.