CS261344B1

CS261344B1 - (6-PurinylthÍo)acyldipeptidy a způsob jejich výroby

Info

Publication number: CS261344B1
Application number: CS877051A
Authority: CS
Inventors: Antonin Cerny; Jiri Krepelka; Karel Masek; Milan Krojidlo
Original assignee: Antonin Cerny; Jiri Krepelka; Karel Masek; Milan Krojidlo
Priority date: 1987-09-30
Filing date: 1987-09-30
Publication date: 1989-01-12
Also published as: CS705187A1

Abstract

Nové N- f(6-purinylthio)acylj -L-alanyl- -D-isoglutaminy obecného vzorce I, ve kterém R3 značí atom vodíku nebo aminoskupinu, R2 značí alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, benzylovou skupinu nebo atom vodíku a n značí 1 nebo 2, jejich soli a způsob jejich výroby spočívající v kondensaci kyseliny (6-purinylthio)alkanové obecného vzorce II, nebo jejího reaktivního derivátu, s esterem dipeptidu obecného vzorce III a popřípadě v následujícím zmýdelnění takto získaného esteru. Sloučeniny obecného vzorce I vykazují významnou imunostimulační účinnost.

Description

Autoři vynálezu se zabývaly podrobněji studiem některých analogů muramyldipeptidů a neočekávaně nalezli, že nové jednoduché sloučeniny obecného vzorce I, které obsahují jako nosič peptidické části MDP místo kyseliny muramové cytostatioky účinný 6-merkaptopurin, popřípadě 6-thioguanin, vázaný přes zbytek kyseliny octové nebo propionové, vykazují zajímavé imunostimulační účinky. Sloučeniny obecného vzorce I obsahují jako dipeptid L-alanyl-D-isoglutamin, který má stejné sterioké uspořádání na asymetrických centrech aminokyselin jako dipeptid v MDP: skládá se z přirozeného L-alaninu, který je peptidicky vázán na D-isoglutamin, patřící do stérické řady v přírodě se běžně nevyskytujících D-aminokyselin.

Podle vynálezu se N- ^(6-purinylthio)acylj -L-alanyl-D-isoglutaminy obecného vzorce I vyrábějí tím způsobem, že se o sobě známá kyseliny (6-purinylthio)alkanová obecného vzorce II

S(CHj)_nCOOH ,Ά/γ (id,

R¹ H (II) , ve kterém R¹ a n mají shora uvedený význam nebo její reaktivní derivát, uvede do reakce s esterem L-alanýl-D-isoglutaminu obecného vzorce III

o ve kterém R značí alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku nebo benzylovou skupinu, a 2 3 získaný ester obecného vzorce I, ve kterém R má stejný význam jako R , se popřípadě 2 zmýdelní na kyselinu obecného vzorce I, ve kterém R značí atom vodíku.

Reakce kyseliny (6-purinylthio)alkanové obecného vzorce II s esterem dipeptidu III se provádí za použití běžných metod syntézy peptidů, například kondensací aktivního derivátu kyseliny II, jako chloridu, smíšeného anhydridu, reaktivního esteru nebo imidazolidu, s dipeptidem III v přítomnosti činidel vázajících kyseliny, jako trietylaminu, diisopropyletylaminu, 1-metylpiperidinu a podobných nebo kondensací kyseliny II s dipeptidem III v přítomnosti karbodiimidů, jako dicyklohexylkarbodiimidu nebo ve vodě rozpustných karbodiimidů, například hydrochloridu N-etyl-N'-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimidů. Při přípravě 2 esterů obecného vzorce I, ve kterém R značí nižší alkylovou skupinu nebo benzylskupinu, které jsou ve vodě málo rozpustné, lze s výhodou použít těch metod, při kterých vznikají z použitých kondensačních činidel ve vodě rozpustné reakční produkty, jako metody karbonyldiimidazolové nebo karbodiimidové za použití ve vodě rozpustných karbodiimidů.

Při karbonyldiimidazolové metodě se z 1 molekvivalentu kyseliny I a 1,1 molekvivalentu Ν,Ν'-karbonyldiimidazolu připraví ve vhodném prostředí, jako v dimetylformamidu nebo v dimetylsulfoxidu, při teplotě 0 až +25 °C, roztok imidazolidu kyseliny I, který se ve stejném prostředí a při stejné teplotě uvede do reakce s roztokem 1 molekvivalentu esteru dipeptidu III ve stejném rozpouštědle. Průběh reakce se sleduje tenkovrstvenou chromatografii a po skončení reakce (za 10 až 24 h) se žádaný produkt isoluje běžnými postupy preparativní organické chemie, například zředěním reakční směsi vodou, úpravou pH, odfiltrováním surového produktu a jeho krystalizaci nebo absorpcí produktu rozpuštěného ve vodě na vhodný iontoměnič, například katex, jeho elucí a popřípadě dalším čištěním.

•

Při karbodiimidové metodě se k roztoku 1 molekvivalentu kyseliny II a-1 molekvivalentu esteru dipeptidu III ve vhodném rozpouštědle, jako v dimetylformamidu, dimetylsulfoxidu, hexametyltriamidu kyseliny fosforečné a podobných, přidá při teplotě 0 až +5 °C 1,0 až 1,1 molekvivalentu příslušného karbodiimidů, jako dicyklohexylkarbodiimidu nebo hydrochloridu N-etyl-N'-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimu, a směs se míchá po přidání 1 molekvivalentu esteru dipeptidu III 1 až 72 h při teplotě v rozmezí od 0 do 40 °C; průběh reakce se sleduje tenkovrstevnou chromatografii. Po skončení reakce se v případě použití dicyklohexylkarbodiimidu odfiltruje vyloučená dicyklohexylmočovina a filtrát se zředí, po případném odpaření rozpouštědla za sníženého tlaku, vodou, přičemž vykrystalizuje málo rozpustný ester obecného vzorce I, nebo, při použití ve vodě rozpustného karbodiimidů,'se reakční směs přímo zředí vodou a po úpravě pH na slabě kyselou reakci se vyloučený surový ester odfiltruje a čistí sloupcovou chromatografii a/nebo krystalizaci, nebo se ve vodě rozpustný ester isoluje po zředění reakční směsi vodou pomocí iontoměničů.

Zmýdelnění esterů obecného vzorce I, ve kterém R značí alkylovou skupinu s 1 až 2 atomy uhlíku nebo benzylskupinu, na kyseliny obecného vzorce I, ve kterém R značí atom vodíku, se provádí působením 2 až 3 molekvivalentů hydroxidů alkalických kovů, jako hydroxidu sodného nebo draselného, na 1 molekvivalent esteru v prostředí vody nebo směsi s nižším alkoholem, jako metanolem nebo etanolem, při teplotě 0 až 40 °C, po dobu 2 až 10 h. Průběh hydrolýzy se sleduje tenkovrstevnou chromatografii a po zmýdelnění veškerého esteru se reakční směs, popřípadě po oddestilování alkoholu, okyselí silnou kyselinou, jako kyselinou chlorovodíkovou nebo kyselinou sírovou, na pH asi 3,5 až 4 a vyloučený produkt se po odfiltrování čistí krystalizaci, výhodně z vody.

Výchozí sloučeniny obecného vzorce II jsou známé látky nebo je lze připravit analogickými způsoby; přípravu kyselin (6-purynilthio)alkanových (obecného vzorce II, ve kterém R^ značí atom vodíku) popsali Semonský a spolupracovníci /Collection Czechoslov. Chem. Comun.

25, 1 091 (1960)/, kyseliny (2-amino-6-purinylthio)alkanové (obecného vzorce II, ve kterém r! značí aminoskupinu) Elionová a spolupracovníci /J. Am. Chem. Soc. 81, 1 898 (1959)/.

Rovněž potřebné estery L-alanyl-D-isoglutaminu obecného vzorce III jsou známé. Obvykle se jako výchozí látky používají vhodné N-chráněné deriváty uvedených esterů, například N-etoxykarbonyl-, N-benzyloxykarbonyl- nebo N-terc.butyloxykarbonylderiváty, ze kterých se před vlastní reakcí známými způsoby, například působením roztoku chlorovodíku v ledové kyselině octové nebo hydrogenolyticky, odstraní chránící skupiny a získá se volný ester dipeptidu obecného vzorce III nebo jeho sůl, které se bez dalšího čištění použijí pro rekakci s kyselinou II.

Imunomodulačni činnost sloučenin obecného vzorce I byla hodnocena testem zpožděné přecitlivělosti na bílých morčatech, kterým bylo aplikováno do levé zadní tlapky 0,2 ml směsi ovalbuminu (2,5 mg) se zkoušenou látkou, bud v inkompletnim Freundovu adjuvans (FIA) nebo pouze ve fyziologickém roztoku. Účinek testovaných látek byl měřen po třech týdnech po podání, kdy byla sledována kožní reakce morčat po podání 10 a 20 /ug ovalbuminu. Z výsledků, které jsou uvedeny v tabulce I je zřejmé, že N-£(6-purinylthio)acetylJ-L-alanyl-D-isoglutamin vzorce la (tj. sloučenina obecného vzorce I, ve kterém R¹ značí atom vodíku) ch₃ conh₂sch₂co- nhchco—nhch(ch₂)₂cooh

Ný·

Sr (la) , má účinky na zpožděnou přecitlivělost u morčat jak v minerálním oleji, tak i při podáni pouze ve fyziologickém roztoku, kterýžto účinek látky ze skupiny muramylpeptidů a desmuramylpeptidů nemají.

Tabulka

Indukce zpožděné přecitlivosti u morčat

Zkoušená	Dávka			Kožní odpověd	po :	24	h (mm)
látka	Cug)	dávka	ovalbuminu	dávka	ovalbuminu
	10 TUq		20 /uq
FIA	-	3,7	+	0,31	5,5	+	0,45
MOP	100	6,1	+	0,37	9,8	+	0,55⁺
la	100	5,2	+	0,32	9,1	+	0,58
Fysiol. roztok		0,5	+	0,75	1,0	+	0,97
MDP	100	1,0	+	0,89	2,4	+	1,48
la	100	2,9	+	0,54	5,5	+	0,63⁺

Vysvětlivky:

FIA - Freundovo inkompletnl adjuvans (Bayol + Arlacel 4:1)

MDP - muramyldlpeptid

+. - statisticky významný rozdíl

Z provedených testů vyplývá, že sloužěniny obecného vzorce I, vzláště látku la, lze používat v terapii jako imunostimulačních, antineoplastických a antiinfekčnlch činidel.

Pro uvedené účely jsou rovněž vhodné ve vodě dobře rozpustné netoxické soli těch sloučenin obecného vzorce I, ve kterém R značí atom vodíku. Jako zmíněných solí lze používat solí s farmaceuticky vhodnými anorganickými nebo organickými basemi, jako solí s alkalickými kovy, s kovy alkalických zemin, solí amonných a solí s organickými aminy, například s trietylaminem, etanolaminem, dicyklohexylaminem a dalšími.

Způsob výroby sloučenin obecného vzorce I je blíže objasněn v následujících příkladech, které však rozsah vynálezu nijak neomezuji. Údaje teplot jsou uvedeny ve stupních Celsia a hodnoty specifických rotací se vztahují na látky prosté krystalového rozpouštědla; procentické údaje znáči hmotnostní procenta.

Příklad 1

Benzylester N- ((6-purinylthio)acetyl)-L-alanyl-D-isoglutaminu

K roztoku 0,54 g (3,3 mmol) karbonyldiimidazolu v 6 ml bezvodého dimetylformamidu se za míchání a chlazení na 0 až +5 °C přidá 0,63 g (3 mmol) kyseliny (6-purinylthio)octové.

po rozpuštění kyseliny (asi po 10 min) se k získanému roztoku imidazolidu přidá při uvedené teplotě roztok 0,88 g (3 mmol) benzylesteru L-alanyl-D-isoglutaminu ve 2 ml dimetylformamidu a směs se míchá 15 h při stejné teplotě. Reakční směs se nalije do ledové vody, okyselí kyselinou octovou na pH 6 a vyloučený produkt se odfiltruje (1,03 g, výtěžek 68,7 %). Po překrystalizování surového produktu z vodného etanolu se získá v nadpisu uvedená sloučenina o t.t. 206 až 208 °C a optické rotaci (^{c =} 0,5, pyridin).

Přiklad 2

Metylester N- |(6-purinylthio)acetylj -L-alanyl-D-isoglutaminu

K roztoku 0,54 g (2 mmol) hydrochloridu metylesteru L-alanyl-D-isoglutaminu v 5 ml bezvodého dimetylformamidu se za mícháni, při teplotě místnosti, přidá 0,22 g (2,2 mmol) trietylaminu a pak se vnese 0,42 g (2 mmol) kyseliny (6-purinylthio)octové. Suspenze se ochladí na 0 až +5 °, přidá se 0,45 g (2,2 mmol) dicyklohexylkarbodiimidu a reakční směs se míchá 8 h při uvedené teplotě. Vyloučená látka, obsahující směs dicyklohexylmočoviny s žádaným produktem, se odfiltruje a metylester se za varu vyjme do 50% vodého metanolu.

Po zahuštění metanolického filtrátu za sníženého tlaku a překrystalizování vyloučeného surového produktu z vody se získá 0,32 g (výtěžek 37,8 %) v nadpise uvedené sloučeniny o t.t. 212 až 215° a optické rotaci +4,1° (c - 0,1, voda). Další podíl metylesteru se dá získat zředěním dimetylformamidového filtrátu vodou (250 ml) a chromatografií vodného roztoku na katexu Dower 50 W x 2 v H formě za použití vody k promytí sloupce a zředěného amoniaku (1:100) k eluci žádané látky.

Příklad 3

Metylester N-£(2-amino-6-puririylthio)acetylj -L-alanyl-D-isoglutaminu

Do roztoku 0,46 g (2 mmol) metylesteru L-alanyl-D-isoglutaminu v 9 ml bezvodého dimetylformamidu se vnese 0,45 g (2 mmol) kyseliny (2-amino-6-purinylthio)octové, suspenze se ochladí na 0 až +5 °, přidá se 0,45 g (2,2 mjmol) dicyklohexylkarbodiimidu a směs míchá 2 h při uvedené teplotě a 44 h při teplotě místnosti. Pevné podíly se odfiltrují, filtrát se zředí vodou (55 ml), malé množství vyloučeného vedlejšího produktu se odfiltruje a filtrát, ve kterém je obsažen žádaný produkt, se chromatografuje na sloupci Dowexu 50 W x 2, 100/200 mesh, v H⁺ formě. Po promytí sloupce vodou se metylester eluuje zředěným amoniakem (1:100) a odparek z eluátu (0,54 g) se chromatografuje na sloupci silikagelu za použití směsi chloroformu, metanolu a koncentrovaného amoniaku (4:4:1) k eluci. Odparek ze spojených jednotných frakcí poskytne po překrystalizování ze směsi metanolu s acetonem v nadpise uvedenou látku o t.t. 133 až 135° a optické rotaci{α]ρθ= +18,6° (c = 0,2, voda).

Příklad 4

Metylester N-£3-(6-purinylthio) propionylj -L-alanyl-D-isoglutaminu

Stejným způsobem jako v příkladu 3, ale za použití kyseliny 3-(6-purinylthio)propionové jako výchoni látky, se po reakční době 24 h při teplotě místnosti získá v nadpise uvedená látka o t.t. 202 až 206° (z vody) a optické rotaci Q>Qp⁰= -9,5° (c = 0,2, voda).

Příklad 5

N- J(6-purinylthio)acetylj -L-alanyl-D-isoglutamin

K roztoku 5,0' g (0,01 mol) benzylesteru N-J(6-purinylthio)acetylj-L-alanyl-D-isoglutaminu ve 130 ml 80% vodného metanolu se při teplotě místnosti přidá 20,0 ml (0,02 mol) IM roztoku hydroxidu sodného a směs se míchá 4 h při 20 až 25°. Metanol se oddestiluje za sníženého tlaku při teplotě asi 40°, vodný roztok (asi 30 ml) se zfiltruje s aktivním uhlím, filtrát se okyselí 10,0 ml (0,02 mol) 2M kyseliny chlorovodíkové (pH asi 3,5 až 4), naočkuje a nechá stát přes noc v lednici při teplotě asi +5°. Vyloučený produkt se odfiltruje ·

(2,53 g, výtěžek 62 %) a překrystalizuje z vody. Získá se v nadpisu uvedená kyselina ve formě bezbarvých jehličkovitých krystalů o t.t. 142 až 145° a optické rotaci = -3,5° (c = 0,2, voda).

Příkladů

Stejným způsobem jako v přikladu 5, zmýdelněním příslušných esterů IM roztokem hydroxidu sodného při teplotě místnosti, se z.ískají:

N [(2-amino-6-purinylthio)acetylJ-L-alanyl-D-isoglutamin, t.t. 186 až 188° (z vody), £«Έ°= (c = 0,1, voda);

N-Í3-(6-purinylthio)propionyl] -L-alanyl-D-isoglutamin, t.t. 209 až 210°,£oQ20= -10,8° (c = 0,1, voda).

Claims

PŘEDMĚT VYNÁLEZU

1. N-£(6-purinylthio)acylj -L-alanyl-D-isoglutaminy obecného vzorce I

C^H3 conh₂

S(CH₂)„CO— NHCHCO—NHCH(CH₂)₂COOR² ve kterém r' znáči atom vodíku nebo aminoskupinu,

R značí alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, benzylovou skupinu nebo atom vodíku a n značí číslo 1 nebo 2, a jejich soli.
2. Způsob výroby N-£( 6-purinylthio)acyl]-L-alanyl-D-isoglutaminů obecného vzorce I podle bodu 1 vyznačující se tím, že se kyselina (6-purinylthio)alkanová obecného vzorce II

SfCH^nCOOH (II) , ve kterém R¹ má v bodu 1 uvedený význam, nebo její reaktivní derivát, uvede do reakce s esterem L-alanyl-D-isoglutaminu obecného vzorce III

CH, CONH,

I ³ T ³
3

H₂N-CHCO-NHCH(CH₂)₂COOR (III), □

ve kterém R značí alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku nebo benzylovou skupinu,

2 3 a získaný ester obecného vzorce 1, ve kterém R má stejný význam jako R , se popřípadě ₂ zmýdelní na kyselinu obecného vzorce I, ve kterém R značí atom vodíku.

' 3. Způsob podle bodu 2 vyznačující se tim,že se jako kondenzačního činidla pro reakci kyseliny vzorce II s esterem dipeptidu vzorce III použije karbodiimidu, jako N,N'-dioyklohexylkarbodiimidu nebo ve vodě rozpustného hydrochloridu N-etyl-N'-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimidu, ve vhodném inertním prostředí.
4. Způsob podle bodu 2 vyznačující se tím, že se jako reaktivního derivátu kyseliny obecného vzorce II použije jejího imidazolidu, připraveného in šitu působením N,N'-karbonyldiimidazolu na kyselinu v inertním prostředí.
5. Způsob podle bodu 3 nebo 4 vyznačující se tím, že se jako inertního prostředí použije dimetylformamidu, dimetylsulfoxidu nebo hexametyltriamidu kyseliny fosforečné.
6. Způsob podle bodu 2 vyznačující se tím, že se zmýdelnění esteru obecného vzorce I, ve kterém R značí alkylovou skupinu s 1 az 4 atomy uhlíku nebo benzylskupinu, na kyselinu 2 obecného vzorce I, ve kterém R značí atom vodíku, provádí působením 2 až 3 molekvivalentů hydroxidů alkalických kovů, jako hydroxidu sodného nebo draselného, ve vhodném prostředí.
7. Způsob podle bodu 6 vyznačující se tím, že se zmýdelnění provádí ve vodě nebo ve směsi vody s nižším alkoholem, jako metanolem nebo etanolem, při teplotě 0 až 40 °C.