CS261080B1 - Trojsodná sol' 0-(4-(N-etyl-N-fenylamíno)-6-(4-metyl-2-sulfobenzén- -l-azo-2-(l-hydroxy-3,6-bissulfonát-l-yl)amíno]-l,3,5-triazín-2-yl}škrobu - Google Patents

Description

3 261030

Vynález sa týká trojsodnej soli 0-{4-(N-e-tyl-N-fenylamíno)-6-[4-metyl-2-sulfobenzén--l-azo-2-(l-hydroxy-3,6-bissulfonaft-l-yl)--amíno]-l,3,5-triazín-2-yl}škrobu vhodnej nadetekciu a selekciu mikrobiálnych produ-centa v «-amyláz a na stanovenie aktivityof-amyláz.

Doteraz bolo připravených niekolko typovchromogénnych substrátov pre la-amylázy.V prvom řade sú to vodcnerozpustné fa-rebné substráty ako Phadebas (PharmaciaSouth Seas Co.) Amylochrome (Roche Diag-nostics) farebná amylóza (Calbiochem. Co.)a amylopektín (Sigma Chemical Co.). U násbola příprava takýclito substrátov patento-vaná v CS AO č. 192 202. Druhý typ fareb-ných substrátov sú vodorozpustné, které súvýhodnejšie z dovodu rovnomernejšieho vy-tvárania enzým-substrátovéhO' komplexu vcelom objeme zmesi. Z nich bolí připravenéfarebné deriváty amylopěktínu (Dyamyl IGeneral Diagnostics, Lyosine Red-ReliableReagents Co.), amylózy alebo škrobu modi-fikovaných karboxymetyláciou, hydroxypro-pyláciou, hydroxyetylácíou, suifoetyláciou apod. (US pat. č. 4 321 364, CS AO č. 237 101).Nevýhodou prvého typu vodoro-zpustnýchsubstrátov je obtiažna příprava spojená sizoláciou farebného amylopěktínu od ne-viazaného farbiva gélovou filtráciou na dra-hých dovozových molekulových sitách (Sep-hadex G—25). V druhom případe je nevýhodou nut-nost chemickej modifikácie škrobu, ktoráje technicky náročná a sposobuje změnyvlastností substrátu pre enzýmovú hydrolýzu a má za následok zníženie citlivostipri detekcii i stanovení aktivity «-amyláz.Pri detekcii «-amyláz v géloch (CS AO č.241341) sa použil kovalentne farbený deri-vát hydroxyetylškrobu. Hydroxyetylškrobvšak ni.e je v súčasnej době dostupný na tr-hu a jeho příprava je náročná a vyžadujespeciálně bezpečnostně opatrenia a taktiežpoužité farbivo- je dovážané z devízovej ob-lasti.

Uvedené nevýhody v podstatnej miere od-straňuje tento vynález.

Podstatou vynálezu je trojsodná sol O-{4-- (N-etyl-N-f enylamíno) -6- [ 4-metyl-2-sulf o-benzén-l-azo-2- (l-hydroxy-3,6-bissulfonaft--l-yl)-amíno]-l,3,5-triazín-2-ylfškrobu. Táto zlúčenina sa připraví z čiastočnehydrolyzovaného škrobu reakciou vo vod-nom prostředí s obsahom 1 až 2 % hmot.-hydroxidu sodného alebo draselného za pří-tomnosti soli ako octan, síran alebo- chlo-rid sodný alebo draselný pri teplote 40 až60 °C počas 1 až 2 hodin s trojsodniou sofou2-chlór-4- (N-etyl-N-f enylamíno) -6- [ 4-metyl--2-sulf obenzén-l-azo-2- (l-hydroxy-3,6-bis-sulfonaft-l-yl)amíno]-l,3,5-triazínu pri hmot-nostných pomeroch hydrolyzovaný škrob : : trojsodná sol' 2-chlór-4-(N-etyl-N-fenylamí- 4 no) -6- [ 4-metyl-2-sulfobenzén-l-azo-2-(l--hydroxy-3,6-bissulf onft-l-yl) amíno ] -1,3/5--triazínu : hydroxid sodný alebo draselný == 1 : 0,3 až 0,6 : 0,3 až 0,6. Načo sa zafar-bený škrob vyzráža 2 až 4 objemami 96 %obj. etylalkoholu a neviazané farbivo a fa-rebné nižšie molekulárně frakcie škrobu saodstráni vymýváním s roztokem obsahujú-cim 1 objem 0,6 až 1 % hmot. vodného roz-toku octanu sodného a 2 až 4 objemy 96 %obj. etylalkoholu.

Trojsodná sof O-{4-( N-etyl-N-f enylamíno )--6- [ 4-metyl-2-sulf obenzén-l-azo-2- (1-hydroi-xy-3,6-bissulfonaft-l-yl)amíno-l,3,5-triazín--2-yl}škrobu je substrátom «-amyldáz a jejvýhody spočívajú v tom, že má výrazné čer-vené sfarbenie a že je rozpustná vo voděa v pufroch, ale přitom sa dá z týchto roz-tokov kvantitativné vyzrážať etylalkoholom.Z tohto dovodu je vhodná na stanovenie ak-tivity α-amyláz, na detekciu a na selekciuproducentov α-amyláz v géloch. V porovna-ní s predchádzajúcim vodorozpustným sub-strátem připraveným na báze hydroxyetyl-škrobu, nový substrát vykazuje lepšie sub-strátové vlastnosti, kto-ré sa prejavujú vovyššej citlivosti detekcie a stanovenia akti-vity «-amyláz. Ďalšia výhoda je, že čiastoč-ne hydrolyzovaný škrob je komerčně do-stupný. Příklad 5 g čiastočne hydrolyzovaného škrobu sasuspenduje v 100 ml vody pri 50 °C. Potomsa přidá 1,6 g farbiva Ostazín Brilliant Čer-veň Η—3B rozpustenej v 25 ml vody. Po-tom sa postupné přidává 1 g octanu sodné-ho a po dokladnom premiešaní 1,5 g hydro-xidu sodného rozpuštěného v 25 ml vody amieša sa 2 hod. pri teplote 50 °Ό. Potom sareakčná zmes zneutralizuje s kyselinou oc-tovou na pH 7 a zráža etylalkoholom v po-měre 3 : 1. Vyzrázený produkt sa přefiltru-je a premýva roztokom obsahujúcim 1 dlel0,6 % obj. vodného roztoku octanu sodné-ho a 3 diely 96 % obj. etylalkoholu do bez-farebného filtrátu. Potom sa zrazenina roz-pustí v 500 ml 0,6 % hmot. vodného rozto-ku octanu sodného a vyzráža sa s 1 500 mletylalkoholu a znovu sa vymývá roztokomobsahujúcim 1 diel 0,6 % hmot. vodného roz-toku octanu sodného a 3 diely 96 % obj.etylalkoholu až do bezfarebného filtrátu.Zrazenina se vymyje roztokom obsahujúcim4 diely 96 % obj. etylalkoholu a 1 diel vo-dy, potom etylalkoholom, acetónom a vysu-ší sa. Výťažok je 4,5 g, pričom obsah farbi-va je 10,4 % hmot.

Vynález má využitie v biochémii a biotech-nologii pre detekciu a selekciu mikrobiál-nych producentov θ'-amyláz a pre rýchlestanovenia aktivity os-amyláz.

Claims (2)

1. 5 261ÍÍ80 PREDMET VYNALEZU Trojsodná sol' 0-{4-(N-etyl-N-fenylamínoj-6-[4-meíyl-2-sulf obenzén-l-azo-2-(1-hydro- xy-3,6-bissulfonaft-l-yl)amíno]-l,3,5-triazín -2-yljškrobu. <»s QPRAVA k PVAO č. 261080 ( 51) Int. Cl.4 C 08 B 31/12 Správný název vynálezu je: ' ' i v Trojsodná sol 0-4-(N-etyl-N-fenylamíno)-6-4-metyl-2--sulíobenzén-l-azo-2- (l-hydroxy-3,6-bissulfonaft-l-yl j -• -amíno-l,3,5-triazín-2-yl škrobu ÚŘAD PRO VYNÁLEZY A OBJEVY