CS260408B1

CS260408B1 - Diagnostic strips for the determination of hydrogen peroxide

Info

Publication number: CS260408B1
Application number: CS851852A
Authority: CS
Inventors: Vlastimil Svoboda; Eva Hrboticka; Bozena Sedlinska
Original assignee: Vlastimil Svoboda; Eva Hrboticka; Bozena Sedlinska
Priority date: 1985-03-18
Filing date: 1985-03-18
Publication date: 1988-12-15
Also published as: CS185285A1

Abstract

Předmětem řešení jsou diagnostické proužky ke stanovení peroxidu vodíku nebo látek, které peroxid vodíku v průběhu vhodné pomocné reakce generují, obsahující chromogenní systém sestávající z aktivní kopulační komponenty 4-aminoantipyrinu a/nebo 3-methyl-2-benzthiazolinonhydrazonu a pasivní komponenty, vyznačené tím, že jako pasivní komponentu obsahují substituovaný pyrazolon. Barevné vlastnosti tohoto nového chromogenního systému lzThe subject of the solution are diagnostic strips for the determination of hydrogen peroxide or substances that generate hydrogen peroxide during a suitable auxiliary reaction, containing a chromogenic system consisting of an active coupling component of 4-aminoantipyrine and/or 3-methyl-2-benzthiazolinonehydrazone and a passive component, characterized in that they contain a substituted pyrazolone as the passive component. The color properties of this new chromogenic system lz

Description

Předmětem vynálezu je složení chromogenního systému diagnostických proužků pro stanovení součástí biologických kapalín, které v průběhu vhodných pomocných reakcí generují peroxid vodíku.The subject of the invention is the composition of a chromogenic system of diagnostic strips for determining components of biological fluids which generate hydrogen peroxide during suitable auxiliary reactions.

Při vyšetřování tělních kapalin jako séra, moče nebo likvoru se některé stanovované součásti převádějí pomocnými reakcemi na oxidační produkty za současného vzniku peroxidu vodíku. Typickým příkladem je stanovení glukózy, která se za přítomnosti enzymu glukosooxidázy oxiduje vzdušným kyslíkem na kyselinu glukonovou za současného vzniku ekvivalentního množství peroxidu vodíku. Podobným způsobem je možné stanovit pomocí specifických enzymů i další součásti například séra, jako jsou například kyselina močová, cholesterol nebo triglyceridy.When examining body fluids such as serum, urine or cerebrospinal fluid, some of the components to be determined are converted by auxiliary reactions into oxidation products with the simultaneous formation of hydrogen peroxide. A typical example is the determination of glucose, which in the presence of the enzyme glucose oxidase is oxidized by atmospheric oxygen to gluconic acid with the simultaneous formation of an equivalent amount of hydrogen peroxide. In a similar way, it is possible to determine other components of serum, such as uric acid, cholesterol or triglycerides, using specific enzymes.

Ke stanovení tohoto peroxidu vodíku byla v minulosti navržena celá řada speciálních chromogenů nebo chromogenních systémů. Druh a vlastnosti tohoto chromogenů nebo chromogenního systému je zvláště důležitý u tzv. diagnostických proužků, v nichž všechna činidla, potřebná pro průběh pomocných reakcí i koncové barevné reakce chromogenů se vzniklým peroxidem vodíku, jsou obsažena na vhodném nosiči v pevné bázi. U těchto proužků se v poslední době užívá ponejvíce chromogenních systémů založených na tzv. Trinderově reakci, spočívající v oxidační kopulaci vhodné nukleofilní organické sloučeniny jako aktivní kopulační komponenty s vhodnou pasivní komponentou. Jako aktivní komponenty jsou používány převádžně 4-aminoantipyrin nebo hcterocyklické hydrazony. Jako pasivní kopu lační složky byly použity různé aromatické aminy, nebo fenoly popřípadě naftoly nebo substituovaný 8-hydroxychinolin, obecně známý pod názvem primachin — difosfát.A number of special chromogens or chromogenic systems have been designed in the past for the determination of this hydrogen peroxide. The type and properties of this chromogen or chromogenic system are particularly important for so-called diagnostic strips, in which all the reagents required for the course of auxiliary reactions and the final color reaction of the chromogens with the resulting hydrogen peroxide are contained on a suitable carrier in a solid base. Recently, chromogenic systems based on the so-called Trinder reaction have been used for these strips, consisting in the oxidative coupling of a suitable nucleophilic organic compound as an active coupling component with a suitable passive component. 4-aminoantipyrine or heterocyclic hydrazones are mainly used as active components. Various aromatic amines, or phenols or naphthols or substituted 8-hydroxyquinoline, generally known as primaquine — diphosphate, have been used as passive coupling components.

Všechny tyto známé systémy však mají společný nedostatek v tom, že vlastnosti chinonimlových, případně diazamerocyaninových barviv, vzniklých z těchto komponent, nedovolují stanovení peroxidu vodíku, a tím látek, které tento peroxid v průběhu pomocných reakcí generují, v dostatečně širokém koncentračním rozmezí, tak jak je při vyšetření některých tělních kapalin potřebné. V důsledku toho nelze tyto známé systémy použít například pro vyšetření moče na obsah glukózy, která se v této tělní kapalině může pohybovat v extrémně širokém koncentračním rozmezí od mírně zvýšených hodnot 0,35—0,50 g/1 po neobyčejně vysoké patologické hodnoty dosahující až 150 g/1.However, all these known systems have a common drawback in that the properties of the quinonimil or diazamerocyanine dyes formed from these components do not allow the determination of hydrogen peroxide, and thus of the substances that generate this peroxide during auxiliary reactions, in a sufficiently wide concentration range, as is necessary for the examination of some body fluids. As a result, these known systems cannot be used, for example, for the examination of urine for glucose content, which in this body fluid can range in an extremely wide concentration range from slightly elevated values of 0.35—0.50 g/1 to unusually high pathological values reaching up to 150 g/1.

Tyto nedostatky odstraňuje předložený vynález, jehož předmětem jsou diagnostické proužky ke stanovení peroxidu vodíku nebo látek, které peroxid vodíku v průběhu pomocné reakce generují, obsahující chromogenní systém sestávající z aktivní kopulační komponenty 4-aminoantipyrinu a/nebo 3-methyl-2-benzthiazolinon-hydrazon a pasivní komponenty, vyznačené tím, že jako pasivní komponentu obsahují substituovaný pyrazolon obecného vzorce IThese shortcomings are eliminated by the present invention, the subject of which are diagnostic strips for the determination of hydrogen peroxide or substances that generate hydrogen peroxide during an auxiliary reaction, containing a chromogenic system consisting of the active coupling component 4-aminoantipyrine and/or 3-methyl-2-benzthiazolinone-hydrazone and a passive component, characterized in that they contain a substituted pyrazolone of the general formula I as the passive component

v němž Rt je vodík nebo karboxyl nebo alkyl o počtu uhlíků 1 až 1Θ nebo alkoxyl o počtu uhlíků 1 až 4 nebo acylovaná aminoskupina —NHCOX, kde X je alkyl o počtu uhlíků 1 až 4 nebo fenyl, a R? až Ri jsou stejné nebo různé substituenty jako vodík, halogen, nitroskupina, sulfoskupina nebo fenoxyskupina. Tyto proužky mohou s výhodou obsahovat ještě další chromogen benzidinového typu jako například o-tolidin, o-dianisidin, 3,3‘,5,5‘-tetramethylbenzidin nebo 2,7-diaminofluoren.wherein Rt is hydrogen or carboxyl or alkyl of 1 to 10 carbons or alkoxy of 1 to 4 carbons or an acylated amino group —NHCOX, where X is alkyl of 1 to 4 carbons or phenyl, and R? to R1 are the same or different substituents such as hydrogen, halogen, nitro, sulfo or phenoxy. These strips may advantageously contain another benzidine-type chromogen such as o-tolidine, o-dianisidine, 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine or 2,7-diaminofluorene.

Tento nový chromogenní systém vyniká proti dříve známým systémům zejména tím, že podle druhu prováděného vyšetření lze jeho barevné vlastnosti v poměrně širokém rozmezí modifikovat. Tak například na proužcích pro vyšetřování moče na glykosuríí lze kombinací 4-amínoantipyrinu a 3-methyl-2-benztriazolon-hydrazonu jako dvou aktivních komponent a l-fenyl-3-methyl-5-pyrazolonu jako komponenty pasivní dosáhnout široké barevné škály od čistě žluté pro normální koncentraci glukózy v moči do 0,20 g/1 přes žlutooranžovou až oranžovou při mírně zvýšeném vylučování glukózy v rozmezí 0,5 až 1,0 g/1, oranžově červenou do temně červené při poměrně silných glykosuriích nad 3,0 g/1 glukózy. Tuto barevnou škálu uvedeného chromogenního systému lze pak ještě dále rozšířit přidáním vhodného množství o-dianisidinu do čcrvenohněda, hnědá nebo zcela černá pro extrémní koncentrace glukózy nad 10 až 30 gramů na litr, jak se vyskytují při těžkém, nekompenzovaném diabetů. Pro stanovení glukózy v krvi lze pak použitím pouze 4-aminoantipyrinu a vhodně substituovaného pyrazolonu naopak barevný rozsah chromogenního systému zúžit tak, že až do koncentrace glukózy okolo 1 g/1 zůstane proužek světle žlutý a poskytne pak zřetelně odstupňovanou škálu barevných odstínů z růžové do^! tmavě červené v rozmezí koncentrace glukózy 1 až 8 g/1.This new chromogenic system stands out from previously known systems in particular because its colour properties can be modified within a relatively wide range depending on the type of examination being performed. For example, on urine test strips for glycosuria, a combination of 4-aminoantipyrine and 3-methyl-2-benzotriazolone-hydrazone as two active components and l-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone as a passive component can achieve a wide colour range from pure yellow for normal glucose concentration in urine up to 0.20 g/l, through yellow-orange to orange for slightly increased glucose excretion in the range of 0.5 to 1.0 g/l, orange-red to dark red for relatively severe glycosuria above 3.0 g/l glucose. This color range of the chromogenic system can then be further expanded by adding an appropriate amount of o-dianisidine to reddish brown, brown or completely black for extreme glucose concentrations above 10 to 30 grams per liter, as occurs in severe, uncompensated diabetes. For the determination of blood glucose, by using only 4-aminoantipyrine and a suitably substituted pyrazolone, the color range of the chromogenic system can be narrowed so that up to a glucose concentration of about 1 g/1 the strip remains light yellow and then provides a clearly graduated color range from pink to ^! dark red in the glucose concentration range of 1 to 8 g/1.

Je samozřejmé, že vedle uvedeného chromogenního systému obsahují proužky podle vynálezu řadu dalších činidel a látek, potřebných pro žádoucí průběh celé indikační reakce. U proužků pro stanovení glu260408 kózy, kyseliny močové, cholesterolu nebo triglyceridů jsou to v prvé řadě specifické enzymy, při nichž je stanovovaná složka — analyt oxidována kyslíkem za současného vzniku peroxidu vodíku. Při stanovení glukózy a kyseliny močové jsou to pouze příslušné oxldázy — glukosooxidáza nebo urikasa. Pro stanovení cholesterolu nebo triglyceridů však proužky obsahují ještě další enzymy, potřebné pro transformaci aualytu na produkt přístupný konečné enzymové oxidázové reakci. Tyto enzymové systémy jsou obecně známé a již poměrně dlouhou dobu používané v oboru klinické biochemie.It goes without saying that in addition to the aforementioned chromogenic system, the strips according to the invention contain a number of other reagents and substances necessary for the desired course of the entire indication reaction. In the case of strips for the determination of glucose, uric acid, cholesterol or triglycerides, these are primarily specific enzymes, in which the component to be determined — the analyte — is oxidized by oxygen with the simultaneous formation of hydrogen peroxide. In the determination of glucose and uric acid, these are only the relevant oxidases — glucose oxidase or uricase. However, for the determination of cholesterol or triglycerides, the strips contain other enzymes necessary for the transformation of the analyte into a product accessible to the final enzyme oxidase reaction. These enzyme systems are generally known and have been used in the field of clinical biochemistry for a relatively long time.

Vlastní oxidační kopulace obou komponent samotným peroxidem vodíku za vzniku příslušného chinioniminového nebo dla- / zamerocyaninového barviva probíhá značně . pomalu. Urychlení této reakce je možné o- becně dosáhnout celou řadou vhodných ka- talyzátorů. V praxi se však nejlépe osvědčil;! enzym peroxidáza, který také tvoří nezbytnou součást proužků podle vynálezu.The actual oxidative coupling of both components by hydrogen peroxide itself to form the corresponding quinionimine or dla-/zamerocyanine dye proceeds very slowly. Acceleration of this reaction can generally be achieved by a number of suitable catalysts. However, in practice, the enzyme peroxidase, which also forms an essential part of the strips according to the invention, has proven to be the best.

Vedle těchto hlavních složek mohou proužky podle vynálezu s výhodou obsahovat řadu dalších pomocných látek vytvářejících vhodné podmínky pro optimální průběh všech reakcí, které v průběhu stanovení analytu na proužky probíhají.In addition to these main components, the strips according to the invention may advantageously contain a number of other auxiliary substances creating suitable conditions for the optimal course of all reactions that take place during the determination of the analyte on the strips.

V prvé řadě je to tlumič, jehož úkolem je nejen vytvářet optimální pH pro všechnyji výše popsané enzymové reakce, ale i prop| vlastní koncovou barevnou reakci, tj. oxi-O dační kopulaci 4-aminoantipyrinu a/nebo 3-®® -methyl-2-benzthiazolon-hydrazonu s výše definovaným pyrazolonem I. Pro tento účel je možné použít jakýkoliv z obecně známých a běžně užívaných, tlumičů o pH 4,0 až 9,0, jako jsou například tlumiče citrátové, fosfátové, tlumiče na bázi tris-(hydroxymethylj-aminomethanu apod.First of all, it is a buffer, the task of which is not only to create an optimal pH for all the above-described enzyme reactions, but also to promote the final color reaction itself, i.e. the oxidative coupling of 4-aminoantipyrine and/or 3-®® -methyl-2-benzthiazolone-hydrazone with the above-defined pyrazolone I. For this purpose, it is possible to use any of the generally known and commonly used buffers with a pH of 4.0 to 9.0, such as citrate buffers, phosphate buffers, buffers based on tris-(hydroxymethyl)-aminomethane, etc.

Další účinnou složkou proužků podle vynálezu mohou být s výhodou tzv. „zahušťovadla“, což jsou přirozené nebo syntetické polymerní látky, jako například želatina, karagenan, alginát, polyvinylpyrrolidon, polyvinylalkohol a podobně. Tato zahušťovadla celý indikační systém proužků mírně stabilizují a vedle toho mají pozitivní vliv na egalizaci a zvýraznění vybarvení proužků při pozitivní reakci.Another active ingredient of the strips according to the invention may advantageously be so-called "thickeners", which are natural or synthetic polymeric substances, such as gelatin, carrageenan, alginate, polyvinylpyrrolidone, polyvinyl alcohol, etc. These thickeners slightly stabilize the entire indicator system of the strips and, in addition, have a positive effect on equalizing and enhancing the coloration of the strips in the event of a positive reaction.

Vedle toho je výhodné, jestliže proužky obsahují i vhodná smáčedla, jako například polyethylenglykol, které zvyšují smáčivost proužků a usnadňují tak proniknutí vyšetřované kapaliny k činidlům a tím urychlují průběh celé reakce. Navíc však přispívají i ke zvýšení čistoty a bilance zabarvení, vzniklého při pozitivní reakci proužků.In addition, it is advantageous if the strips also contain suitable wetting agents, such as polyethylene glycol, which increase the wettability of the strips and thus facilitate the penetration of the examined liquid to the reagents and thus accelerate the course of the entire reaction. In addition, they also contribute to increasing the purity and balance of the coloration resulting from a positive reaction of the strips.

V některých případech je i výhodné, jestliže proužky obsahují ještě také vhodné indiferentní barvivo, které koriguje barevný odstín proužků při pozitivní reakci a zvýrazňuje rozdíly v intenzitě zbarvení proužků při reakci a zvýrazňuje rozdíly v intenzitě zbarvení proužků při reakci s rozdílnými koncentracemi analytu. I když principiálně lze pro tento účel použít nejrůznější barviva, ve většině případů se nejlépe osvědčují žlutá barviva jako například tartrazin, fluoresciein nebo kyselina pikrová.In some cases, it is also advantageous if the strips also contain a suitable indifferent dye, which corrects the color shade of the strips in the case of a positive reaction and highlights the differences in the intensity of the color of the strips in the reaction with different concentrations of the analyte. Although in principle various dyes can be used for this purpose, in most cases yellow dyes such as tartrazine, fluorescein or picric acid prove best.

Diagnostické proužky podle tohoto vynálezu se připravují o sobě známým a pro přípravu diagnostických proužků obecně používaným způsobem, spočívajícím v tom, že všechny výše uvedené složky se rozpustí ve vhodných rozpouštědlech, jako například ve vodě, alkoholu, acetonu, a tento tzv. impregnační roztok se nanese na vhodnou nasákavou podložku, jako je například filtrační papír nebo rouno ze syntetických vláken, a vysuší. V některých případech je pak výhodné část uvedených součástí rozpustit v jednom roztoku a část pak odděleně ve druhém impregnačním roztoku a tyto roztoky nanést na nasákavý nosič postupně, přičemž po každé této impregnaci se nosič důkladně vysuší například proudem teplého vzduchu. Popis takovéto přípravy diagnostických proužků vysvítá z níže uvedených příkladů. Je možné však také všechny výše uvedené složky inkorporovat do vhodné polymerní vrstvy, která se pak formou tenkého filmu nanese na podložku z plastické hmoty. Tuto polymerní vrstvu s chromogenním systémem lze vedle toho použít i jako reakční vrstvu v tzv. integrálním analytickém elementu.The diagnostic strips according to the invention are prepared in a known manner and generally used for the preparation of diagnostic strips, consisting in dissolving all the above-mentioned components in suitable solvents, such as water, alcohol, acetone, and applying this so-called impregnation solution to a suitable absorbent substrate, such as filter paper or synthetic fiber fleece, and drying. In some cases, it is then advantageous to dissolve part of the above-mentioned components in one solution and part separately in a second impregnation solution and apply these solutions to the absorbent carrier sequentially, with the carrier being thoroughly dried, for example, by a stream of warm air after each impregnation. A description of such preparation of diagnostic strips will become clear from the examples given below. However, it is also possible to incorporate all the above-mentioned components into a suitable polymer layer, which is then applied in the form of a thin film to a plastic substrate. This polymer layer with a chromogenic system can also be used as a reaction layer in a so-called integral analytical element.

Proti dříve známým řešením proužky podle tohoto vynálezu se vyznačují nejen vysokou citlivostí vůči obsahu analytu ve vyšetřovaných biologických kapalinách a možností použití pro poměrně široké rozsahy koncentrace tohoto analytu, ale poskytují při pozitivních reakcích i výrazné a jasné zabarvení od oranžové přes různé odstíny červené případně až do temně hnědé, což umožňuje velmi přesné semikvantitativní vizuální i fotometrické vyhodnocení výsledků testů.Compared to previously known solutions, the strips according to this invention are characterized not only by high sensitivity to the content of the analyte in the examined biological fluids and the possibility of use for relatively wide ranges of concentration of this analyte, but also by providing, in the case of positive reactions, a distinct and clear color from orange through various shades of red or even dark brown, which enables very accurate semi-quantitative visual and photometric evaluation of test results.

Příklady provedeníDesign examples

Příklad 1Example 1

Impregnační roztok A:Impregnation solution A:

Citrátový tlumič, pH — 5,3 Citrate buffer, pH — 5.3 94,0 94.0 ml ml Želatina, 1 %-ní vodný roztok Gelatin, 1% aqueous solution 50,0 50.0 ml ml Glukosooxidáza Glucose oxidase 2,5 2.5 g g Peroxidáza, 1 %-ní vodný roztok Peroxidase, 1% aqueous solution 14,0 14.0 ml ml Impregnační roztok B: Impregnation solution B: Methylalkohol Methyl alcohol 53,0 53.0 ml ml l-fenyl-3-methyl-5-pyrazolon 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone 2,15 2.15 g g 4-aminoantipyrin 4-aminoantipyrine 0,95 0.95 g g o-dlanisidin . 2 HC1, 2,5 %-ní o-dlanisidine. 2 HCl, 2.5% vodný roztok aqueous solution 47,0 47.0 ml ml Polyvinylpyrolidon, 5 %-ní Polyvinylpyrrolidone, 5% vodný roztok aqueous solution 30,0 30.0 ml ml Laurylsulfát sodný Sodium lauryl sulfate 0,6 0.6 g g Tartrazin, 1 %-ní vodný roztok Tartrazine, 1% aqueous solution 3,6 3.6 ml ml

Oba impregnační roztoky se připraví od-Kg děleně smícháním, popřípadě rozpuštěním·» všech složek ve výše uvedeném pořadí. NaJ|| filtrační papír o plošné hmotnosti 180 g/m²'^ se nanese impregnační roztok A a papír se dokonale vysuší proudem teplého vzduchu. Na tento papír se pak nanese impregnační roztok B a vysuší se stejným způsobem. Vysušený papír se rozřeže na čtverečky 6X6 milimetrů a nalepí — například pomocí oboustranné samolepící pásky — na podložku z bílé plastické hmoty.Both impregnation solutions are prepared separately by mixing or dissolving all the components in the order given above. Impregnation solution A is applied to filter paper with a surface weight of 180 g/m ² and the paper is dried thoroughly with a stream of warm air. Impregnation solution B is then applied to this paper and dried in the same way. The dried paper is cut into 6X6 millimeter squares and glued — for example, using double-sided adhesive tape — to a white plastic backing.

V močích, obsahujících různá množství glukózy tyto proužky nabývají po 1 až 2 minutách po namočení zbarvení uvedená v následující tabulce:In urine containing various amounts of glucose, these strips acquire the colors shown in the following table after 1 to 2 minutes of soaking:

3-methyl-2-benzthiazolon-hydrazon .3-methyl-2-benzthiazolone-hydrazone.

.2HC1 0,1 g □ba impregnační roztoky se připraví odděleně postupným rozpuštěním, příp. smícháním jednotlivých složek v uvedeném pořadí. Tyto impregnační roztoky se nanesou postupně na papír o plošné hmotnosti 180 gramů na m², který se dále zpracuje na hotové proužky způsobem popsaným v příkladě 1..2HC1 0.1 g □ba and the impregnation solutions are prepared separately by gradually dissolving or mixing the individual components in the order listed. These impregnation solutions are applied successively to paper with a basis weight of 180 grams per m ² , which is further processed into finished strips in the manner described in Example 1.

Tyto proužky, určené k semikvantitativnímu stanovení glukózy v moči, indikují nižší nadfyzlologické koncentrace glukózy, tj. 0,4 až 2,5 g/1, jasně oranžovým zbarvením, které při stoupajících koncentracích glukózy v rozmezí 3 až 30 g/1 přechází přes záři-These strips, intended for semi-quantitative determination of glucose in urine, indicate lower supraphysiological glucose concentrations, i.e. 0.4 to 2.5 g/l, with a bright orange color, which changes to a luminescent color at increasing glucose concentrations in the range of 3 to 30 g/l.

koncentrace zbarvení glukózy (g/1 j proužků glucose color concentration (g/1 strip) vě červenou a temně vínově červenou čistě hnědé až černé. very red and dark burgundy red pure brown to black. do to 0,00— 0,2 žluté 0.00— 0.2 yellow Příklad 4 Example 4 0,35— 1,0 oranžově červené 0.35— 1.0 orange-red 1,0 — 2,5 červené 1.0 — 2.5 red Proužky pro stanovení glukózy v Glucose test strips séru serum 2,5 — 5,0 sytě červené 2.5 — 5.0 deep red 10,0 —20,0 temně červené 10.0 —20.0 dark red Impregnační roztok I: Impregnation solution I: —30,0 tmavě červené —30.0 dark red Želatina 1,5 %-ní vodný roztok Gelatin 1.5% aqueous solution 38 38 ml ml Příklad 2 Example 2 Glukos ooxidáza Glucose oxidase 1,7 1.7 g g · . · . Peroxidáza Peroxidase 90 90 mg mg Připraví se proužky přesně podle přikla- The strips are prepared exactly as shown in the example. Citrátový tlumič, pH 5,3 Citrate buffer, pH 5.3 60 60 ml ml du 1, avšak l-fenyl-3-methyl-5-pyrazolon se du 1, but 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone se nahradí 2,82 g l-(4-sulfofenyl)-3-hexadecyl-5-pyrazolonem. Tyto proužky reagují na přítomnost peroxidu vodíku popřípadě glu- replace 2.82 g with l-(4-sulfophenyl)-3-hexadecyl-5-pyrazolone. These strips react to the presence of hydrogen peroxide or glucose. Impregnační roztok II: Metanol Impregnation solution II: Methanol 32,5 32.5 ml ml kózy obdobnou barevnou změnou, avšak vznik zabarvení je pomalejší a jeho intenzi- goats have a similar color change, but the onset of coloration is slower and its intensity 1- (2-chlor-4-sulfof enyl) -3-karboxy-5-pyrazolon 1-(2-chloro-4-sulfophenyl)-3-carboxy-5-pyrazolone 1,95 1.95 g g ta podstatně nižší. Tyto proužky lze s výho- that is considerably lower. These strips can be conveniently 4-aminoantipyrin 4-aminoantipyrine 0,8 0.8 g g dou použít pro stanovení extrémně vysokých koncentrací glukózy v rozmezí 30 až 150 g na litr. can be used to determine extremely high glucose concentrations in the range of 30 to 150 g per liter. Methylhydroxypropylcelulóza 4 %-ní roztok ve směsi metanol—voda 1 : 1 Methylhydroxypropylcellulose 4% solution in a 1:1 methanol-water mixture 47,0 47.0 ml ml Přiklad 3 Example 3 Dioktylsulfojantaran sodný 3 %-ní roztok v etanolu Sodium dioctyl sulfosuccinate 3% solution in ethanol 8,0 8.0 ml ml Tartrazin 1 %-ní vodný roztok Tartrazine 1% aqueous solution 2,4 2.4 ml ml Impregnační roztok A: Impregnation solution A: Karaginan 0,5 %-ní vodný roztok Carrageenan 0.5% aqueous solution 10,0 10.0 ml ml

Voda destilovaná Distilled water 57,0 57.0 ml ml kyselina citrónová citric acid 0,96 0.96 g g Dihydrogencitran sodný Sodium dihydrogen citrate 4,41 4.41 g g Kyselina ethylendiamin- Ethylenediamine acid -tetraoctová -tetraacetic acid 3,95 3.95 σ CJ σ CJ Ctyřsodná sůl Quarterly sodium salt Glukosooxidáza Glucose oxidase 1,2 1.2 g g Peroxidáza 0,5 %-ní vodný roztok Peroxidase 0.5% aqueous solution 26,4 26.4 ml ml Póly viny lpyrrolidon 10 %-ní Half of the lpyrrolidone 10% vodný roztok aqueous solution 3,5 3.5 ml ml Impregnační roztok B: Impregnation solution B: l-sulfofenyl-3-methyl-5-pyrazolon 1-sulfophenyl-3-methyl-5-pyrazolone 1,48 1.48 rr t » rr t » 4-aminoantipyrin 4-aminoantipyrine 0,56 0.56 g g Metanol Methanol 40,0 40.0 ml ml o-dianisidin . 2 HC1 o-dianisidine . 2 HC1 1,40 1.40 g g voda destilovaná distilled water 50,0 50.0 ml ml Polyvinylpyrrolidon 10 %-ní Polyvinylpyrrolidone 10% vodný roztok aqueous solution 10,0 10.0 lili lily Laurylsulfát Lauryl sulfate 0,4 0.4 g g

Oba roztoky byly naneseny na papír o plošné hmotnosti 120 g/m², který byl dále zpracován na hotové proužky způsobem uvedeným v příkladě 1.Both solutions were applied to paper with a basis weight of 120 g/ ^m2 , which was further processed into finished strips in the manner described in Example 1.

Po nanesení 30 ul séra se stoupajícím obsahem glukózy se proužky zbarvily světle až tmavě červeně. Pomocí reflexního densitometru byly s použitím červeného filtru naměřeny pro jednotlivé koncentrace glukózy hodnoty reflexní density D uvedené v následující tabulce koncentrace glukózy (mmol/lj DAfter application of 30 μl of serum with increasing glucose content, the strips turned light to dark red. Using a reflection densitometer, the reflection density values D were measured for individual glucose concentrations using a red filter, as shown in the following table: glucose concentration (mmol/lj D

4,0 4.0 0,21 0.21 8,0 8.0 0,37 0.37 10,0 10.0 0,43 0.43 14,0 14.0 0,50 0.50 22,0 22.0 0,60 0.60 44,0 44.0 0,76 0.76

280408280408

Vizuálně bylo možné vzniklá zbarvení velmi přesně přiřadit k jednotlivým barevným polím zkusmo zhotovené barevné srovnávací stupnice.Visually, it was possible to very accurately assign the resulting colors to the individual color fields of the experimentally created color comparison scale.

Prakticky stejné vlastnosti mají i proužky, u nichž se v impregnačním roztoku II nahradí 1- (2-chlor-4-sulfofenyl) -3-karboxy-5-pyrazolon stejným hmotovým množstvím 1- {2,5-dichlor-4-sulf of enyl j -3-acetamino-5-pyrazolonem.Strips in which 1-(2-chloro-4-sulfophenyl)-3-carboxy-5-pyrazolone is replaced in the impregnation solution II by the same mass amount of 1-(2,5-dichloro-4-sulfophenyl)-3-acetamino-5-pyrazolone have practically the same properties.

Claims

Diagnostic strips for the determination of hydrogen peroxide or hydrogen peroxide-generating substances containing a chromogenic system consisting of the active coupling component of 4-aminoantipyrine and / or 3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazone and a passive coupling component, characterized as being passive the coupling component comprises a substituted pyrazolone of formula I

Wherein R 1 is hydrogen or a carboxyl group or an alkyl of 1 to 16 or an alkoxy of 1-4 carbon atoms or an acylated amino group -NHCOX wherein X is an alkyl of 1 to 4 or phenyl, and R 2 to R 1 are the same or different substituents such as hydrogen or halogen or nitro or sulfo or phenoxy optionally contain another benzidine-type chromogen such as o-tolidine, o-dianisidine, 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine or 2,7-diaminofluorene.