CS253138B1

CS253138B1 - Diagnostic strips for biologic liquids' components determination

Info

Publication number: CS253138B1
Application number: CS858529A
Authority: CS
Inventors: Eva Hrboticka; Vlastimil Svoboda
Original assignee: Eva Hrboticka; Vlastimil Svoboda
Priority date: 1985-11-26
Filing date: 1985-11-26
Publication date: 1987-10-15
Also published as: CS852985A1

Abstract

Předmětem jsou diagnostické proužky pro stanovení množství peroxidu vodíku v moči, určené pro využití v lékařství. Podle vynálezu proužky navíc proti známému stavu obsahují pyrazolon obecného vzorce I s pěti radikály, z nichž první dva jsou alkyly o počtu uhlíků 1 až 6 nebo vodík a zbývající tři jsou stejné nebo rozdílné substítuenty jako vodík, halogen, nitroskupina, sulfoskupina nebo fenoxyskupina. Při zachování barevných vlastností tak dochází ke snížení citlivosti reakce tak, že proužky reaguji na množství peroxidu vodíku až do určité hranice koncentrací.Diagnostic strips for Determining the amount of hydrogen peroxide in the urine intended for medical use. According to the invention moreover, the strips contain a known state pyrazolone of formula I with five radicals, the first two being alkyls of 1 to 6 or hydrogen; the remaining three are the same or different substituents such as hydrogen, halogen, nitro, sulfo or phenoxy. While retaining the color properties so there is a decrease in the sensitivity of the reaction that the strips react to the amount of peroxide hydrogen up to a certain concentration limit.

Description

Předmětem vynálezu jsou diagnostické proužky ke stanovení diagnosticky významných součástí biologických kapalin, které pomocí vhodných pomocných reakcí generují peroxid vodíku.The present invention provides diagnostic strips for the determination of diagnostically important components of biological fluids that generate hydrogen peroxide by appropriate auxiliary reactions.

V klinicko-biochemické laboratorní diagnostice je velmi často potřeba stanovit peroxid vodíku vzniklý in sítu při některých enzymových reakcích. Je tomu tak například při stanovení glukosy nebo kyseliny močové v biologických kapalinách, jako například v moči nebo krvi; glukosa nebo kyselina močová se při tomto stanovení převádějí pomoci specifických enzymů, oxidoreduktas, na své oxidační produkty, kyselinu glukonovou, případně allatonin, za současného vzniku ekvivalentního množství peroxidu vodíku. Pomocí další specifické reakce se takto vzniklý peroxid vodíku stanoví tak, že za přítomnosti vhodného katalyzátoru nejčastěji enzymu peroxidasy, oxiduje bezbarvý chromogen na barvivo, jehož množství - úměrné množství peroxidu vodíku - se pak zjistí podle intenzity vzniklého zbarvení. Obdobným způsobem, i když s použitím poněkud složitějších pomocných reakcí, lze stanovit např. i cholesterol nebo triglyceridy.In clinical-biochemical laboratory diagnostics, it is very often necessary to determine in situ hydrogen peroxide produced by some enzyme reactions. This is the case, for example, when determining glucose or uric acid in biological fluids such as urine or blood; glucose or uric acid is converted in this assay by specific enzymes, oxidoreductase, to their oxidation products, gluconic acid or allatonin, while producing an equivalent amount of hydrogen peroxide. By means of a further specific reaction, the hydrogen peroxide thus formed is determined by oxidizing the colorless chromogen to a colorant in the presence of a suitable catalyst, most often the peroxidase enzyme, whose amount - proportional to the amount of hydrogen peroxide - is then determined by the intensity of the coloration produced. In a similar way, although using somewhat more complex auxiliary reactions, for example, cholesterol or triglycerides can also be determined.

Druh a vlastnosti chromogenu, používaného pro tato stanovení jsou obzvláště důležité u tzv. diagnostických proužků, u nichž veškerá činidla potřebná pro průběh uvedených pomocných enzymových reakcí i koncové barevné reakce jsou obsažena v pevné fázi ní. vhodném nasákavém nosiči.The nature and properties of the chromogen used for these assays are of particular importance in so-called diagnostic strips, in which all the reagents required for the conduct of said auxiliary enzyme reactions and the final color reactions are contained in the solid phase. a suitable absorbent carrier.

V minulosti byly pro tento účel užívány prakticky výlučně chromogeny benzidinového typu, jako o-toluidin, 2,7-diaminofluoren nebo 3,3¹,5,5'-tetrametylbenzidin. V poslední době jsou však tyto chromogeny nahrazovány vhodnějším chromogenním systémem, založeným na tzv. Trinderově reakci, tj. na oxidační kopulaci vhodné nukleofilní organické sloučeniny jako aktivní barvotvorné komponenty s vhodnou pasivní barvotvornou komponentou za vzniku intenzívně zbarveného chinoniminového nebo diazaraerocyartinového barviva.In the past, virtually exclusively benzidine-type chromogens such as o-toluidine, 2,7-diaminofluorene or 3,3 ^L , 5,5'-tetramethylbenzidine have been used for this purpose. Recently, however, these chromogens have been replaced by a more suitable chromogenic system, based on the so-called Trinder reaction, i.e. the oxidative coupling of a suitable nucleophilic organic compound as an active dye component with a suitable passive dye component to produce an intensely colored quinone imine or diazaraerocyartin dye.

Jako aktivní komponenty jsou pro tento účel používány vesměs aminosloučeniny, z nichž se nejlépe osvědčily aromatické nebo heterocyklické aminy se šestičlenným kruhem (viz DOS 3 032 421 a NDR patent 135 243) nebo 4-aminoantipyrin a/nebo heterocyklické hydrazony, jako například 3-methyl-2-benzthiazolinon-hydrazon (viz US patent 4 427 770; 4 119 405 nebo čs.The active components used for this purpose are mainly amino compounds, of which the aromatic or heterocyclic amines with a six-membered ring (see DOS 3,032,421 and GDR patent 135 243) or 4-aminoantipyrine and / or heterocyclic hydrazones, such as 3-methyl -2-benzthiazolinone hydrazone (see U.S. Patent 4,427,770; 4,119,405 or U.S. Pat.

Jako pasivní barvotvorné kopulační komponenty byly pak použity různé aromatické aminy (viz Clin. Chem. 17, 1 154 (1971), Clin. Chem. 18, 943 (1972) nebo DOS 3 124 594), substituované fenoly popřípadě naftoly (Ann. Clin. Biochem. 6, 24 (1969); US patent 4 119 504; US patent 4 427 770; DOS 2 744 812; DOS 3 000 380; DOS 2 838 877; NDR patent 135 243), substituovaný 8-hydroxychinolin, obecně známý pod názvem primachin-difosfát (DOS 2 855 433) nebo substituované 5-pyrazolony (DOS 3 032 421).Various aromatic amines were then used as passive color-forming coupling components (see Clin. Chem. 17, 1154 (1971), Clin. Chem. 18, 943 (1972) or DOS 3 124 594), substituted phenols or naphthols (Ann. Clin. Biochem., 6, 24 (1969); U.S. Patent 4,119,504; U.S. Patent 4,427,770; DOS 2,744,812; DOS 3,000,380; DOS 2,838,877; GDR Patent 135,243), substituted 8-hydroxyquinoline, commonly known under the name primachine diphosphate (DOS 2,855,433) or substituted 5-pyrazolones (DOS 3,032,421).

Diagnostické proužky, jejichž barevná odezva na peroxid vodíku, popřípadě na látky, které tento peroxid vodíku v průběhu vhodné pomocné enzymové reakce generují, je založena na tomto chromogenním systému, vynikají výbornými vlastnostmi: např. glukosu v moči lze pomocí těchto proužků stanovit v extrémně širokém rozmezí od mírně zvýšených glykosurií od 0,35 až 0,50 g/1 glukosy až po neobyčejně vysoké patologické hodnoty, přesahující 30 až 50 g/1. Obdobně se tyto proužky osvědčují i pro vyšetřování séra nebo krve, kde je možné pomocí nich stanovit s poměrně vysokou přesností obsah glukosy od hypoglykémií v rozsahu 0,20 až 0,40 g/1 glukosy až po, poměrně těžké hyperglykémie, při nichž koncentrace glukosy v séru dosahuje až 8,0 g/1 a více.Diagnostic strips whose color response to hydrogen peroxide or the substances that generate hydrogen peroxide during a suitable auxiliary enzymatic reaction are based on this chromogenic system excel in excellent properties: eg urine glucose can be determined with these strips in an extremely wide range ranging from slightly elevated glycosuria from 0.35 to 0.50 g / l glucose to extremely high pathological values, exceeding 30 to 50 g / l. Similarly, these strips are also useful for serum or blood tests where glucose levels ranging from hypoglycemia in the range of 0.20 to 0.40 g / l glucose to relatively severe hyperglycaemia at which glucose concentrations are relatively high in serum it reaches 8.0 g / l or more.

V některých případech je však žádoucí, aby tyto proužky indikovaly pouze koncentrace glukosy, zvýšené nad určitou hranici. Je to zejména u proužků, obsahujících dvě indikační zóny, z nichž pomocí prvé je možno stanovit nižší koncentraci glukosy např. do 1,1 g/1 (což je horní hranice tzv. normální hodnoty), pomocí druhé pak koncentrace ležící nad touto hodnotou. Při tom je výhodné použít pro nižší koncentrační rozsah zónu s chromogenem benzidino3 pis takovýchto dvouzónových pružků a výhody jejich použití jsou uvedeny například v již čito váném US patentu 4 427 770.However, in some cases, it is desirable that these bands only indicate glucose concentrations raised above a certain level. This is particularly true for strips containing two indicator zones, the first of which can be used to determine lower glucose concentrations, for example, up to 1.1 g / l (the upper limit of the so-called normal value), and the second above concentrations. In this case, it is advantageous to use such dual zone zones for the lower concentration range of the benzidine chromogen zone and the advantages of their use are disclosed, for example, in the aforementioned U.S. Patent 4,427,770.

Chromogenní systémy na bázi oxidační kopulace uvedené výše však pro tento účel nejsou zcela vhodné, nebot dik své poměrně vysoké citlivosti indikují přítomnost a množství glukosy již od jejích velmi nízkých koncentrací, což ovšem při použití na těchto dvouzónových proužcích není žádoucí. Obdobně však i např. u proužků pro stanovení glukosy v moči indikují proužky s tímto chromogenním systémem i nejnižší nadfyziologické vylučování glukosy nadměrně intenzívní pozitivní reakci, což někdy znesnadňuje přesnější diferenciaci pozitivních nálezů v oblasti 0,35 až 1,0 g/1 glukosy, která je ovšem z hlediska diagnostického velmi důležitá. Bylo proto třeba vyvinout diagnostické proužky, u nichž by při zachování vynikajících barevných vlastností uvedeného chromogenního systému byla citlivost reakce snížena tak, aby prouž ky reagovaly první zřetelně pozitivní reakcí na množství peroxidu vodíku - a tím tedy na množství látky tento peroxid generující - teprve od určité hranice koncentrací.However, the chromogenic oxidation coupling systems mentioned above are not entirely suitable for this purpose, since their relatively high sensitivity indicates the presence and amount of glucose from very low concentrations, but this is not desirable when used on these two-zone bands. Similarly, for example, for strips for the determination of urine glucose, strips with this chromogenic system also indicate the lowest overphysiologic glucose excretion of an excessively intense positive reaction, which sometimes makes it more difficult to more accurately differentiate positive findings in the 0.35 to 1.0 g / l range of glucose. however, it is very important from a diagnostic point of view. It was therefore necessary to develop diagnostic strips which, while maintaining the excellent color properties of the chromogenic system, would reduce the sensitivity of the reaction so that the strips reacted with a first clearly positive reaction to the amount of hydrogen peroxide - and hence the amount of peroxide-generating substance. concentration limits.

Tento úkol se podařilo vyřešit předloženým vynálezem, jehož předmětem jsou diagnostické proužky ke stanovení součástí biologických kapalin obsahující chromogenní systém na bázi oxidační kopulace aromatického nebo heterocyklického aminu s fenolem, naftolem nebo 1,3-disubstituovaným 5-pyrazolonem, vyznačené tím, že obsahují pyrazolon obecného vzorce IThis object was achieved by the present invention, which provides diagnostic strips for the determination of components of biological fluids comprising a chromogenic system based on the oxidative coupling of an aromatic or heterocyclic amine with phenol, naphthol or 1,3-disubstituted 5-pyrazolone, characterized in that they contain pyrazolone of formula I

v němž R^ je alkyl o počtu uhlíků 1 až 6, R^ je vodík nebo alkyl o počtu uhlíků 1 až 6 a R^ až Rj jsou stejné nebo rozdílné substituenty jako vodík, halogen, nitroskupina, sulfoskupina nebo fenoxyskupina.wherein R 1 is alkyl of 1 to 6, R 1 is hydrogen or alkyl of 1 to 6 and R 1 to R 1 are the same or different substituents as hydrogen, halogen, nitro, sulfo or phenoxy.

Tento nový chromogenní systém vyniká proti dosud známým systémům tím, že pomocí pyrazolonu I je možné libovolně regulovat spodní hranici citlivosti proužků vzhledem k množství původního analytu, při jehož enzymové transformaci vzniká peroxid vodíku. Tato skutečnost je dána pravděpodobně tím, že v tomto novém systému dochází přednostně k oxidační kopulaci aktivní kopulačni komponenty s pyrazolonem I za vzniku bezbarvého produktu. Teprve po spotře bování veškerého pyrazolonu I, což odpovídá spotřebování ekvivalentní části peroxidu vodíku, dojde k reakci aktivní kopulačni komponenty s vlastní barvotvornou komponentou, tj. aromatickým nebo heterocyklickým aminem, fenolem, naftolem nebo 5-pyrazolonem, majícím však - na rozdíl od pyrazolonu I - volnou, nesubstituovanou methylenovou skupinu v poloze 4.This novel chromogenic system excels against the prior art systems in that the pyrazolone I can arbitrarily regulate the lower limit of the sensitivity of the strips with respect to the amount of the original analyte whose enzymatic transformation produces hydrogen peroxide. This is probably due to the preferential oxidation coupling of the active coupling component with pyrazolone I in this new system to give a colorless product. Only after all pyrazolone I has been consumed, which corresponds to the consumption of an equivalent part of hydrogen peroxide, does the active coupling component react with its own color-forming component, i.e. an aromatic or heterocyclic amine, phenol, naphthol or 5-pyrazolone, but having - unlike pyrazolone I - a free, unsubstituted methylene group at the 4-position.

Z uvedeného nástinu předpokládaných pochodů, které probíhají při pozitivní reakci v chromogenním systému proužků podle vynálezu, vyplývají i potřebné vzájemné poměry jednotlivých složek. Poměr aktivní a pasivní barvotvorné komponenty není kritický a může se pohybovat v poměrně širokých mezích od přebytku komponenty aktivní až po poměrně vysoký přebytek komponenty pasivní. U většiny proužků se však z hlediska výtěžku oxidační kopulace a z toho vyplývajících barevných vlastností proužků ukázal výhodným stechiometrický poměr obou těchto složek až do zhruba trojnásobného molárniho přebytku pasivní kopulačni komponenty. Možnost použití aktivní a pasivní kopulačni komponenty v prakticky zcela libovolných molárních poměrech vyplývá konečně i z popisu výše citovaných vynálezů, jako například z amerických patent· nich spisů 4 119 405 a 4 427 770 nebo DOS 3 032 421.The above-mentioned outlines of the processes which take place in a positive reaction in the chromogenic system of the strips according to the invention also indicate the necessary relative proportions of the individual components. The ratio of active and passive color-forming components is not critical and can range from a relatively wide range from an excess of the active component to a relatively high excess of the passive component. However, for most strips, the stoichiometric ratio of the two components up to about a three-fold molar excess of the passive coupling component has proven to be advantageous with respect to the yield of oxidative coupling and the resulting color properties of the strips. Finally, the possibility of using the active and passive coupling components in virtually any molar ratios also results from the description of the above-cited inventions, such as from U.S. Pat. Nos. 4,119,405 and 4,427,770 or DOS 3,032,421.

Množství pyrazolonu I (který lze z hlediska předpokládaného mechanismu jeho účinku označit za bezbarvou pasivní kopulačni komponentu) použitého na proužcích podle vynálezu se řídí hranicí koncentrace peroxidu vodíku (případně látky, která tento peroxid v průběhu pří253138 slušné pomocné reakce generuje), při níž mají proužky poskytovat první pozitivní reakci.The amount of pyrazolone I (which can be described as a colorless passive coupling component in terms of its anticipated mechanism of action) used on the strips of the present invention is controlled by the hydrogen peroxide concentration provide the first positive response.

Toto množství pyrazolonu I, případně jeho molární poměr například k barvotvorné pasivní komponentě je závislý jak na substituentech Rg až R_g v pyrazolonu I, tak i na použité kombinaci aktivní a pasivní barvotvorné komponenty a hlavně na biologické kapalině, k jejímuž vyšetřování jsou proužky určeny.This amount pyrazolone I or its molar ratio such as a color forming the passive component is dependent on both Rg and R _{g of} the pyrazolone I and on the combination of active and passive color-forming components and especially biological fluid to whose investigation of the strips are determined.

Tak například u proužků pro stanovení glukosy v moči, které jako chromogenní systém obsahují kombinaci 4-aminoantipyrinu s l-fenyl-3-methyl-5-pyrazolon a jako pyrazolon X l-(4-sulfofenyl)-3,4-dimethyl-5-pyrazolon, a u nichž je nutné potlačit pozitivní reakci do koncentrace glukosy 0,20 g/1 a zeslabit pozitivní reakci pro koncentrace glukosy 0,30 až 0,50 g/1, je nutné použít poměrně vysoké množství pyrazolonu I, vyjádřené molárním poměrem k 1-fenyl-3-methyl-5-pyrazolonu 1 ku 5.For example, in urine glucose strips which contain a combination of 4-aminoantipyrine with 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone as the chromogenic system and 1- (4-sulfophenyl) -3,4-dimethyl-5 as pyrazolone X -pyrazolone, in which it is necessary to suppress a positive reaction to a glucose concentration of 0.20 g / l and to attenuate a positive reaction for a glucose concentration of 0.30 to 0.50 g / l, a relatively high amount of pyrazolone I, expressed as molar ratio to 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone 1 to 5.

U proužků pro stanovení glukosy v kapilární karvi, obsahujících chromogenní systém 4-aminoantipyrin s 1-(sulfofenyl)-3-methyl-5-pyrazolonem a jako pyrazolon I 1-(4-sulfofenyl)-3-methyl-4-butyl-5-pyrazolon, u nichž je třeba potlačit pozitivní reakci až do koncentrace glukosy 1,0 až 1,1 g/1, však postačuje molární poměr obou složek pouze 1 ku 100 až 1 ku 140. Obecně se tudíž pyrazolon I používá v diagnostických proužcích podle vynálezu v množství definovaném poměrem k pasivní barvotvorné komponentě 1 ku 2,5 až 1 ku 250, přičemž u proužků pro stanovení glukosy v moči činí tento poměr s výhodou 1 ku 2,5 až 1 ku 25, u proužků pro stanovení glukosy v krvni nebo séru s výhodou 1 ku 50 až 1 ku 150.For capillary karvic glucose test strips containing the chromogenic system 4-aminoantipyrine with 1- (sulfophenyl) -3-methyl-5-pyrazolone and as pyrazolone I 1- (4-sulfophenyl) -3-methyl-4-butyl-5 -pyrazolone, in which a positive reaction up to a glucose concentration of 1.0 to 1.1 g / l has to be suppressed, however, a molar ratio of both components of only 1 to 100 to 1 to 140 is sufficient. In general, therefore, pyrazolone I is used in diagnostic strips according to of the invention in an amount defined by the ratio to the passive dye component 1 to 2.5 to 1 to 250, wherein for urine glucose test strips the ratio is preferably 1 to 2.5 to 1 to 25, for blood glucose test strips or preferably between 1 in 50 and 1 in 150.

Je samozřejmé, že vedle uvedeného ohromogennlho systému a pyrazolonu X obsahuji proužky podle ₍vynálezu řadu dalších látek a činidel, potřebných pro žádoucí průběh celé indikační reakce. U proužků pro stanovení glukosy, kyseliny močové, cholesterolu nebo triglyoeridů jsou to v prvé řadě specifické enzymy, za jejichž přítomnosti jsou tyto součásti biologických kapalin transformovány za současného vzniku peroxidu vodíku. Při stanovení glukosy a kyseliny močové jsou to pouze příslušné oxidoreduktasy - glukosaoxidasa nebo urikasa. Pro stanoveni cholesterolu nebo triglyceridů však proužky obsahují - vedle příslušné oxidoreduktásy ještě i dalši enzymy, potřebné pro transformaci stanovované látky na produkt, přístupný konečné oxidasové reakci. Tyto enzymy jsou obecně známé a již poměrně dlouhou dobu používané v klinicko-biochemioké analytice. Popis takovýchto složitějších enzymových systémů lze nalézt například v americkém patentním spise 3 983 005 nebo v DOS 2 512 586 a 2 737 286.It is understood that in addition to said ohromogennlho system pyrazolone X comprises strips _(invention, a variety of other materials and reagents required for the desired course of the indicator reaction. For strips for determining glucose, uric acid, cholesterol or triglyoeridů are primarily specific enzymes, For the determination of glucose and uric acid, it is only the respective oxidoreductases - glucose oxidase or uricase, but for the determination of cholesterol or triglycerides, the strips contain, in addition to the respective oxidoreductase, also other enzymes needed for the determination of cholesterol or triglycerides. transformation of the test substance to a product accessible to the final oxidase reaction These enzymes have been well known and have been used for a long time in clinical biochemistry analysis. See, for example, U.S. Pat. No. 3,983,005 or DOS 2,512,586 and 2,737,286.

Vlastní oxidační kopulace obou barvotvorných komponent i kopulace aktivní komponenty s pyrazolonem I působením peroxidu vodíku probíhá značně pomalu. Urychleni této reakce lze dosáhnout celou řadou vhodných katalyzátorů, z nichž se však v praxi nejlépe osvědčil enzym peroxidasa, která tvoři také nezbytnou součást proužků podle vynálezu.The actual oxidative coupling of both the color forming components and the coupling of the active component with pyrazolone I by the action of hydrogen peroxide proceeds very slowly. The acceleration of this reaction can be achieved by a variety of suitable catalysts, of which the enzyme peroxidase, which also forms an essential part of the strips according to the invention, has proved to be the best in practice.

Vedle těchto hlavních složek mohou však proužky podle vynálezu s výhodou obsahovat ještě řadu dalších pomocných látek vytvářejících vhodné podmínky pro průběh všech reakcí, které při stanovení příslušné součásti biologických kapalin na proužku probíhají. V prvé řadě je to tlumič, jehož úkolem je nejen vytvářet optimální pH pro všechny výše popsané enzymové reakce, ale i pro vlastní koncovou barevnou reakci, tj. oxidační kopulaci barvotvorných složek chromogenního systému. Pro tento účel může být použit jakýkoliv z obecně známých a pro tento účel běžně užívaných neinterferujících tlumičů o pH 4,0 až 9,0, jako jsou například tlumiče oitrátové, malonátové, fosfátové, tlumiče na bázi tris(hydroxymethyl)-aminomethanu a podobně.In addition to these major components, however, the strips of the present invention may advantageously contain a number of other excipients to provide suitable conditions for the conduct of all reactions that occur when determining the respective portion of biological fluids on the strip. First of all, it is a silencer whose task is not only to create an optimum pH for all the above-described enzyme reactions, but also for the actual end-color reaction, ie the oxidative coupling of the chromogenic system color-forming components. Any of the commonly known non-interfering buffers at pH 4.0 to 9.0 can be used for this purpose, such as, for example, oitrate, malonate, phosphate, tris (hydroxymethyl) -aminomethane based buffers and the like.

Dalši účinnou složkou proužků podle vynálezu mohou být s výhodou tzv. zahuštovadla, což jsou přirozené nebo syntetické polymerní látky, jako například želatina, karagenan, alginát, polyvinylpyrrolidon, polyvinylalkohol, kopolymer maleinanhydridu s methylvinyléterem, étery nebo estery celulózy nebo jejich směsi. Tato zahuštovadla celý reakční systém proužků stabilizují a vedle toho mají i pozitivní vliv na zvýraznění barevné reakce proužků při pozitivní reakci.The other active components of the strips according to the invention may preferably be so-called thickeners, which are natural or synthetic polymeric substances, such as gelatin, carrageenan, alginate, polyvinylpyrrolidone, polyvinyl alcohol, maleic anhydride copolymer with methyl vinyl ether, cellulose ethers or esters or mixtures thereof. These thickeners stabilize the entire strip reaction system and, in addition, have a positive effect on enhancing the color reaction of the strips in a positive reaction.

Dále je výhodné, jestliže proužky obsahují i vhodná smáčedla, jako například laurylsulfát, dioktylsulfojantaran nebo polyethylenglykol, které zvyšují smáčivost proužků a usnadňují tak proniknuti vyšetřované kapaliny k činidlům a tím urychlují průbSh reakce proužků. Navíc přispívají tyto látky i ke zvýšení čistoty odstínu a brilance zabarvení vzniklého při pozitivní reakci proužků.It is further preferred that the strips also contain suitable wetting agents, such as lauryl sulfate, dioctylsulfosuccinate, or polyethylene glycol, which increase the wettability of the strips and thereby facilitate penetration of the test liquid to the reagents and thereby accelerate the reaction of the strips. In addition, these substances also contribute to enhancing the purity of the shade and the brilliance of the coloration resulting from the positive reaction of the strips.

V některých případech je výhodné, jestliže proužky obsahují ještě také vhodné indiferentní barvivo, které koriguje výsledný barevný odstín proužků při pozitivní reakci a zvýrazňuje rozdíl v intenzitě zabarvení při reakci proužků s rozdílnými kocentracemi peroxidu vodíku, případně výchozího analytu, z něhož tento peroxid vznikl. I když zásadně lze pro tento účel použít nejrůznější barviva, ve většině případů se nejlépe osvědčují barviva žlutá, jako například tartrazin, fluorescein nebo kyselina pikrová.In some cases it is preferred that the strips also contain a suitable indifferent dye which corrects the resulting hue of the strips in a positive reaction and highlights the difference in color intensity when the strips react with different concentrations of hydrogen peroxide or the starting analyte from which the peroxide was formed. While a wide variety of dyes can basically be used for this purpose, yellow dyes, such as tartrazine, fluorescein or picric acid, are in most cases the best.

Diagnostické proužky podle tohoto vynálezu se připravuji o sobě známým a pro přípravu diagnostických proužků obecně používaným způsobem spočívajícím v tom, že se všechny výše ií uvedené složky rozpustí ve vhodných rozpouštědlech jako například ve vodě, alkoholu, acetonu a tento tzv. impregnační roztok se nanese na nasákavou podložku, jako je filtrační papír nebo rouno ze syntetických vláken a vysuší.The diagnostic strips according to the invention are prepared in a manner known per se and for the preparation of diagnostic strips by a method generally used in that all the above-mentioned components are dissolved in suitable solvents such as water, alcohol, acetone and this so-called impregnating solution is applied. an absorbent pad, such as filter paper or synthetic fiber web, and dried.

V některých případech je pak výhodné část uvedených součástí rozpustit v jednom roztoku a část pak odděleně na druhý impregnační roztok a tyto roztoky nanést na nasákavý nosič postupně, přičemž po každé této impregnaci se nosič důkladně vysuší, například proudem horkého vzduchu. Tento způsob přípravy diagnostických proužků je blíže popsán v níže uvedených příkladech provedení vynálezu. Je však možné také všechny výše uvedené složky inkorporovat do vhodné polymerni vrstvy, která se pak ve formě tenkého filmu nanese na podložku z plastické hmoty, jak popisuje například americký patent 3 630 957. Tuto polymerni vrstvu a chromogennlm systémem podle vynálezu lze vedle toho použít i jako reakční vrstvu v tzv. Integrálním analytickém elementu popsaném podrobně například v americkém patentu 3 992 158.In some cases, it is preferable to dissolve a portion of the components in one solution and separate them separately onto the other impregnating solution and apply the solutions successively to the absorbent carrier, after which the carrier is thoroughly dried after each impregnation, for example with a hot air stream. This method of preparing diagnostic strips is described in more detail in the Examples below. However, it is also possible to incorporate all of the above components into a suitable polymer layer, which is then applied as a thin film onto a plastic backing, as described, for example, in U.S. Pat. No. 3,630,957. as a reaction layer in the so-called Integral Analytical Element described in detail, for example, in U.S. Patent 3,992,158.

Proti dříve známým řešením jsou proužky podle tohoto vynálezu charakteristické tím, že použitím vhodného množství pyrazolonu I v jejich reakčním systému je možné podle potřeby měnit hranici jejich citlivosti vůči peroxidu vodíku a tím vůči stanovované součásti vyšetřované biologické kapaliny. Tato přednost proužků podle vynálezu se uplatňuje ve všech případech, kdy je třeba zachytit stanovovanou ·součást biologické kapaliny teprve od jisté koncentrace, jako je například horní hranice tzv. normální hodnoty.In contrast to the previously known solutions, the strips according to the invention are characterized in that by using a suitable amount of pyrazolone I in their reaction system it is possible to vary the limit of their sensitivity to hydrogen peroxide and thus to the component of the biological fluid under investigation. This advantage of the strips according to the invention applies in all cases where it is necessary to capture the determined component of the biological liquid only from a certain concentration, such as the upper limit of the so-called normal value.

Příklad 1Example 1

Proužky ke stanovení glukosy v močiUrine glucose test strips

Impregnační roztok AImpregnating solution

oitrátový tlumič o pH 5,3 želatina, 1,5% vodný roztok glukosaoxidasa, 24 U/mg peroxidasa, 100 U/mg, 1,8% vodný roztok oitrate buffer at pH 5.3 gelatin, 1.5% aqueous solution glucose oxidase, 24 U / mg peroxidase, 100 U / mg, 1.8% aqueous solution 62,00 ml 33,00 ml 1,65 g 4,85 ml 62,00 ml 33,00 ml 1.65 g 4.85 ml Impregnační roztok B Impregnating solution metanol methanol 27,00 ml 27,00 ml voda destilovaná distilled water 20,30 ml 20.30 ml l-fenyl-3-methyl-5-pyrazolon 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone 1,45 g 1,45 g 1-(4-sulfofenyl)-3,4-dimethyl-5-pyrazolon 1- (4-Sulfophenyl) -3,4-dimethyl-5-pyrazolone 0,41 g 0.41 g 4-aminoantipyrin 4-aminoantipyrine 0,62 g 0,62 g o-dianisidin o-dianisidine 0,62 g 0,62 g polyvinylpyrrolidon K 90, 5% vodný roztok polyvinylpyrrolidone K 90, 5% aqueous solution 20,30 ml 20.30 ml laurylsulfát sodný sodium lauryl sulfate 0,41 g 0.41 g

hydroxypropylcelulóza, 2% vodný roztok ve směsi metanol-voda 1 ku 1 30,00 ml tartrazin, 1% vodný roztok 2,40 mlhydroxypropylcellulose, 2% aqueous solution in 1: 1 methanol-water 30.00 ml tartrazine, 1% aqueous solution 2.40 ml

Oba impregnační roztoky se připraví odděleně smícháním, popřípadě rozpuštěním všech 2 složek v uvedeném pořadí. Na filtrační papír o plošné hmotnosti 180 g/m se nanese impregnační roztok A a papír se dokonale vysuší proudem teplého vzduchu. Na tento papír se pak nanese impregnační roztok B a vysuší stejným způsobem. Vysušený papír se poté rozřeže na čtverečky o rozměru 6x6 mm a nalepí - například pomocí oboustranné samolepící pásky - na podložku z bílé plastické hmoty. Ve srovnání s proužky připravenými stejným způsobem, avšak bez 1-(4-sulfofenyl)-3,4—dimethyl-5-pyrazolonu, poskytují proužky podle tohoto vynálezu vizuálně podstatně lépe rozlišitelné zbarvení v oblasti nejnižších patologických koncentrací glukosy v moči (0,35 až 1,0 g/1), i silnějších glykosurií (10 až 30 g/1). Vedle toho jsou tyto proužky i stabilnější vůči vzdušné vlhkosti.The two impregnating solutions are prepared separately by mixing or dissolving all 2 components, respectively. The impregnating solution A is applied to filter paper of 180 g / m @ 2 and the paper is completely dried with a stream of warm air. The paper is then coated with impregnating solution B and dried in the same manner. The dried paper is then cut into 6x6 mm squares and adhered - for example with double-sided self-adhesive tape - onto a white plastic backing. Compared to strips prepared in the same manner but without 1- (4-sulfophenyl) -3,4-dimethyl-5-pyrazolone, the strips of the present invention provide a visually significantly better distinguishable color at the lowest pathological glucose concentration in the urine (0.35 up to 1.0 g / l), even stronger glycosuria (10 to 30 g / l). In addition, these strips are more stable to air humidity.

Příklad 2Example 2

Proužky ke stanovení glukosy v kapilární krviStrips for determination of glucose in capillary blood

Impregnační roztok AImpregnating solution

citrátový tlumič o pH 5,3 želatina, 1,5% vodný roztok glukosaoxidasa, 20 U/mg peroxidasa, 100 U/mg, 1,8% vodný roztok citrate buffer at pH 5.3 gelatin, 1.5% aqueous solution glucose oxidase, 20 U / mg peroxidase, 100 U / mg, 1.8% aqueous solution 58,20 ml 38,80 ml 4.20 g 3.20 ml 58,20 ml 38.80 ml 4.20 g 3.20 ml Impregnační roztok B Impregnating solution metanol methanol 65,00 ml 65,00 ml voda destilovaná distilled water 32,60 ml 32.60 ml 1-(4-sulfofenyl)-3-methyl-5-pyrazolon 1- (4-Sulfophenyl) -3-methyl-5-pyrazolone 2,90 g 2,90 g l-fenyl-3-methyl-4-butyl-5-pyrazolon 1-phenyl-3-methyl-4-butyl-5-pyrazolone 0,15 g 0.15 g 4-aminoantipyrin 4-aminoantipyrine 0,80 g 0,80 g tartrazin, 1% vodný roztok tartrazine, 1% aqueous solution 2,30 ml 2,30 ml dioktylsulfojantaran sodný, 3% roztok v etanolu sodium dioctylsulfosuccinate, 3% solution in ethanol 14,00 ml 14,00 ml Impregnační roztok C Impregnating solution etanol ethanol 33,00 ml 33,00 ml toluen toluene 29,00 ml 29,00 ml diohlormetan diohlormetan 19,00 ml 19,00 ml metanol methanol 19,00 ml 19,00 ml methylhydroxypropylcelulóza methylhydroxypropylcellulose 2,30 g 2,30 g ethylcelulóza ethylcellulose 1,20 g 1,20 g polyvinylbutyral B 20 H polyvinyl butyral B 20 H 1,70 g 1,70 g

Jednotlivé impregnační roztoky se nanesou postupně na filtrační papír o plošné hmotnosti oThe individual impregnating solutions are applied sequentially to filter paper having a basis weight of

180 g/m tak, aby papír byl roztokem právě nasycen. Po nanesení každého roztoku se papír důkladně vysuší proudem horkého vzduchu. Poslední impregnace, provedená pomoci impregnačního roztoku C, slouží k vytvoření semipermeabilní membrány, která zadrží na svém povrchu krevní elementy a propustí k reakčnímu systému proužků pouze krevní plasmu, případně sérum.180 g / m so that the paper is just saturated with the solution. After applying each solution, the paper is thoroughly dried with a stream of hot air. The last impregnation, carried out with the impregnation solution C, serves to form a semipermeable membrane which retains blood elements on its surface and permits only blood plasma or serum to the stripe reaction system.

Takto naimpregnovaný papír se zpracuje na konečné proužky způsobem popsaným v příkladu 1 . Po nakápnutí kapky krve na čtvereček naimpregnovaného papíru (reakční zónu proužků) se po 60 s odstraní krevní elementy otřením ovlhčenou buničitou vatou a vzniklé červené zbarvení reakční zóny. které je úměrné koncentraci glukosy ve vyšetřované krvi, se vyhodnotí bud vizuálně srovnáním se zkusmo zhotoVěneu barevnou srovnávací stupnicí, nebo změřením reflektance při vlnové délce 495 nm na vhodném reflexním fotometru. Tyto proužky slouží ke stáno7 vení glukosy v kapilární krvi v rozmezí koncentrací od 1,20 g do 8,0 g/1; reakčni zónu připravenou popsaným způsobem je vhodné použít na dvouzónovém proužku v kombinaci se zónou určenou pro stanovení glukosy v rozmezí 0,20 až 1,2 g/1, jak popisuje americký patent 4 427 770.The thus impregnated paper is processed to final strips as described in Example 1. After dropping a drop of blood onto a square of the impregnated paper (reaction zone of the strips), the blood elements are removed after 60 seconds by wiping with a damp cellulose wadding and resulting red coloring of the reaction zone. which is proportional to the glucose concentration in the blood to be examined, is evaluated either visually by comparison with an experimentally measured color comparison scale or by measuring reflectance at a wavelength of 495 nm on a suitable reflective photometer. These strips serve to measure glucose in capillary blood at concentrations ranging from 1.20 g to 8.0 g / L; the reaction zone prepared by the process described herein is suitable for use in a dual-zone strip in combination with a glucose determination zone in the range of 0.20 to 1.2 g / L as described in U.S. Patent 4,427,770.

Jestliže se v impregnačním roztoku B nahradí l-fenyl-3-methyl-4-butyl-5-pyrazolon stejným množstvím 1-(2-chlor-4-sulfofenyl)-3,4-diethyl-5-pyrazolonu, získají se proužky prakticky stejných vlastností.If 1-phenyl-3-methyl-4-butyl-5-pyrazolone is replaced with an equal amount of 1- (2-chloro-4-sulfophenyl) -3,4-diethyl-5-pyrazolone in impregnation solution B, strips are obtained practically of the same properties.

Claims

SUBJECT OF THE INVENTION

Diagnostic strips for the determination of components of biological fluids containing a chromogenic system based on the oxidative coupling of an aromatic or heterocyclic amine with phenol, naphthol or 1,3-disubstituted 5-pyrazolone, characterized in that they contain pyrazolone I of the formula The number of carbons 1 to 6, R 1 is hydrogen or alkyl of the number 1 to 6, and R 1 to R 1. are the same or different substituents as hydrogen, halogen, nitro, sulfo or phenoxy.