CS253138B1

CS253138B1 - Diagnostic strips to determine the components of biological fluids

Info

Publication number: CS253138B1
Application number: CS858529A
Authority: CS
Inventors: Eva Hrboticka; Vlastimil Svoboda
Original assignee: Eva Hrboticka; Vlastimil Svoboda
Priority date: 1985-11-26
Filing date: 1985-11-26
Publication date: 1987-10-15
Also published as: CS852985A1

Abstract

Předmětem jsou diagnostické proužky pro stanovení množství peroxidu vodíku v moči, určené pro využití v lékařství. Podle vynálezu proužky navíc proti známému stavu obsahují pyrazolon obecného vzorce I s pěti radikály, z nichž první dva jsou alkyly o počtu uhlíků 1 až 6 nebo vodík a zbývající tři jsou stejné nebo rozdílné substítuenty jako vodík, halogen, nitroskupina, sulfoskupina nebo fenoxyskupina. Při zachování barevných vlastností tak dochází ke snížení citlivosti reakce tak, že proužky reaguji na množství peroxidu vodíku až do určité hranice koncentrací.The subject is diagnostic strips for determining the amount of hydrogen peroxide in urine, intended for use in medicine. According to the invention, the strips, in addition to the known state, contain a pyrazolone of the general formula I with five radicals, the first two of which are alkyls with a carbon number of 1 to 6 or hydrogen and the remaining three are the same or different substituents such as hydrogen, halogen, nitro group, sulfo group or phenoxy group. While maintaining the color properties, the sensitivity of the reaction is reduced so that the strips react to the amount of hydrogen peroxide up to a certain concentration limit.

Description

Předmětem vynálezu jsou diagnostické proužky ke stanovení diagnosticky významných součástí biologických kapalin, které pomocí vhodných pomocných reakcí generují peroxid vodíku.The subject of the invention are diagnostic strips for determining diagnostically significant components of biological fluids which generate hydrogen peroxide using suitable auxiliary reactions.

V klinicko-biochemické laboratorní diagnostice je velmi často potřeba stanovit peroxid vodíku vzniklý in sítu při některých enzymových reakcích. Je tomu tak například při stanovení glukosy nebo kyseliny močové v biologických kapalinách, jako například v moči nebo krvi; glukosa nebo kyselina močová se při tomto stanovení převádějí pomoci specifických enzymů, oxidoreduktas, na své oxidační produkty, kyselinu glukonovou, případně allatonin, za současného vzniku ekvivalentního množství peroxidu vodíku. Pomocí další specifické reakce se takto vzniklý peroxid vodíku stanoví tak, že za přítomnosti vhodného katalyzátoru nejčastěji enzymu peroxidasy, oxiduje bezbarvý chromogen na barvivo, jehož množství - úměrné množství peroxidu vodíku - se pak zjistí podle intenzity vzniklého zbarvení. Obdobným způsobem, i když s použitím poněkud složitějších pomocných reakcí, lze stanovit např. i cholesterol nebo triglyceridy.In clinical-biochemical laboratory diagnostics, it is very often necessary to determine hydrogen peroxide formed in situ during some enzyme reactions. This is the case, for example, when determining glucose or uric acid in biological fluids, such as urine or blood; in this determination, glucose or uric acid are converted with the help of specific enzymes, oxidoreductases, into their oxidation products, gluconic acid or allatonine, with the simultaneous formation of an equivalent amount of hydrogen peroxide. Using another specific reaction, the hydrogen peroxide thus formed is determined by oxidizing a colorless chromogen into a dye in the presence of a suitable catalyst, most often the enzyme peroxidase, the amount of which - proportional to the amount of hydrogen peroxide - is then determined according to the intensity of the resulting color. In a similar way, although using somewhat more complex auxiliary reactions, cholesterol or triglycerides can be determined, for example.

Druh a vlastnosti chromogenu, používaného pro tato stanovení jsou obzvláště důležité u tzv. diagnostických proužků, u nichž veškerá činidla potřebná pro průběh uvedených pomocných enzymových reakcí i koncové barevné reakce jsou obsažena v pevné fázi ní. vhodném nasákavém nosiči.The type and properties of the chromogen used for these determinations are particularly important in so-called diagnostic strips, in which all reagents necessary for the course of the aforementioned auxiliary enzyme reactions and the final color reaction are contained in a solid phase, in a suitable absorbent carrier.

V minulosti byly pro tento účel užívány prakticky výlučně chromogeny benzidinového typu, jako o-toluidin, 2,7-diaminofluoren nebo 3,3¹,5,5'-tetrametylbenzidin. V poslední době jsou však tyto chromogeny nahrazovány vhodnějším chromogenním systémem, založeným na tzv. Trinderově reakci, tj. na oxidační kopulaci vhodné nukleofilní organické sloučeniny jako aktivní barvotvorné komponenty s vhodnou pasivní barvotvornou komponentou za vzniku intenzívně zbarveného chinoniminového nebo diazaraerocyartinového barviva.In the past, benzidine-type chromogens such as o-toluidine, 2,7-diaminofluorene or 3,3 ¹ ,5,5'-tetramethylbenzidine were used for this purpose practically exclusively. However, recently these chromogens have been replaced by a more suitable chromogenic system based on the so-called Trinder reaction, i.e. on the oxidative coupling of a suitable nucleophilic organic compound as an active color-forming component with a suitable passive color-forming component to form an intensely colored quinoneimine or diazaraerocyartin dye.

Jako aktivní komponenty jsou pro tento účel používány vesměs aminosloučeniny, z nichž se nejlépe osvědčily aromatické nebo heterocyklické aminy se šestičlenným kruhem (viz DOS 3 032 421 a NDR patent 135 243) nebo 4-aminoantipyrin a/nebo heterocyklické hydrazony, jako například 3-methyl-2-benzthiazolinon-hydrazon (viz US patent 4 427 770; 4 119 405 nebo čs.The active components used for this purpose are mostly amino compounds, of which aromatic or heterocyclic amines with a six-membered ring have proven to be the best (see DOS 3,032,421 and NDR patent 135,243) or 4-aminoantipyrine and/or heterocyclic hydrazones, such as 3-methyl-2-benzthiazolinone-hydrazone (see US patent 4,427,770; 4,119,405 or Czech patent no.

Jako pasivní barvotvorné kopulační komponenty byly pak použity různé aromatické aminy (viz Clin. Chem. 17, 1 154 (1971), Clin. Chem. 18, 943 (1972) nebo DOS 3 124 594), substituované fenoly popřípadě naftoly (Ann. Clin. Biochem. 6, 24 (1969); US patent 4 119 504; US patent 4 427 770; DOS 2 744 812; DOS 3 000 380; DOS 2 838 877; NDR patent 135 243), substituovaný 8-hydroxychinolin, obecně známý pod názvem primachin-difosfát (DOS 2 855 433) nebo substituované 5-pyrazolony (DOS 3 032 421).Various aromatic amines were then used as passive color-forming coupling components (see Clin. Chem. 17, 1 154 (1971), Clin. Chem. 18, 943 (1972) or DOS 3 124 594), substituted phenols or naphthols (Ann. Clin. Biochem. 6, 24 (1969); US patent 4 119 504; US patent 4 427 770; DOS 2 744 812; DOS 3 000 380; DOS 2 838 877; NDR patent 135 243), substituted 8-hydroxyquinoline, generally known as primaquine diphosphate (DOS 2 855 433) or substituted 5-pyrazolones (DOS 3 032 421).

Diagnostické proužky, jejichž barevná odezva na peroxid vodíku, popřípadě na látky, které tento peroxid vodíku v průběhu vhodné pomocné enzymové reakce generují, je založena na tomto chromogenním systému, vynikají výbornými vlastnostmi: např. glukosu v moči lze pomocí těchto proužků stanovit v extrémně širokém rozmezí od mírně zvýšených glykosurií od 0,35 až 0,50 g/1 glukosy až po neobyčejně vysoké patologické hodnoty, přesahující 30 až 50 g/1. Obdobně se tyto proužky osvědčují i pro vyšetřování séra nebo krve, kde je možné pomocí nich stanovit s poměrně vysokou přesností obsah glukosy od hypoglykémií v rozsahu 0,20 až 0,40 g/1 glukosy až po, poměrně těžké hyperglykémie, při nichž koncentrace glukosy v séru dosahuje až 8,0 g/1 a více.Diagnostic strips, whose color response to hydrogen peroxide, or to substances that generate this hydrogen peroxide during a suitable auxiliary enzyme reaction, is based on this chromogenic system, stand out with excellent properties: for example, glucose in urine can be determined using these strips in an extremely wide range from slightly increased glycosuria from 0.35 to 0.50 g/l glucose to unusually high pathological values, exceeding 30 to 50 g/l. Similarly, these strips are also suitable for examining serum or blood, where they can be used to determine with relatively high accuracy the glucose content from hypoglycemia in the range of 0.20 to 0.40 g/l glucose to relatively severe hyperglycemia, in which the glucose concentration in serum reaches up to 8.0 g/l and more.

V některých případech je však žádoucí, aby tyto proužky indikovaly pouze koncentrace glukosy, zvýšené nad určitou hranici. Je to zejména u proužků, obsahujících dvě indikační zóny, z nichž pomocí prvé je možno stanovit nižší koncentraci glukosy např. do 1,1 g/1 (což je horní hranice tzv. normální hodnoty), pomocí druhé pak koncentrace ležící nad touto hodnotou. Při tom je výhodné použít pro nižší koncentrační rozsah zónu s chromogenem benzidino3 pis takovýchto dvouzónových pružků a výhody jejich použití jsou uvedeny například v již čito váném US patentu 4 427 770.In some cases, however, it is desirable for these strips to indicate only glucose concentrations above a certain limit. This is especially the case for strips containing two indication zones, the first of which can be used to determine lower glucose concentrations, e.g. up to 1.1 g/l (which is the upper limit of the so-called normal value), and the second to determine concentrations above this value. In this case, it is advantageous to use a zone with the chromogen benzidino3 pis of such two-zone strips for the lower concentration range, and the advantages of their use are given, for example, in the already cited US patent 4,427,770.

Chromogenní systémy na bázi oxidační kopulace uvedené výše však pro tento účel nejsou zcela vhodné, nebot dik své poměrně vysoké citlivosti indikují přítomnost a množství glukosy již od jejích velmi nízkých koncentrací, což ovšem při použití na těchto dvouzónových proužcích není žádoucí. Obdobně však i např. u proužků pro stanovení glukosy v moči indikují proužky s tímto chromogenním systémem i nejnižší nadfyziologické vylučování glukosy nadměrně intenzívní pozitivní reakci, což někdy znesnadňuje přesnější diferenciaci pozitivních nálezů v oblasti 0,35 až 1,0 g/1 glukosy, která je ovšem z hlediska diagnostického velmi důležitá. Bylo proto třeba vyvinout diagnostické proužky, u nichž by při zachování vynikajících barevných vlastností uvedeného chromogenního systému byla citlivost reakce snížena tak, aby prouž ky reagovaly první zřetelně pozitivní reakcí na množství peroxidu vodíku - a tím tedy na množství látky tento peroxid generující - teprve od určité hranice koncentrací.The chromogenic systems based on oxidative coupling mentioned above are not entirely suitable for this purpose, because due to their relatively high sensitivity they indicate the presence and amount of glucose already from its very low concentrations, which is not desirable when used on these two-zone strips. Similarly, however, for example in strips for determining glucose in urine, strips with this chromogenic system indicate even the lowest supraphysiological excretion of glucose with an excessively intense positive reaction, which sometimes makes it difficult to more accurately differentiate positive findings in the range of 0.35 to 1.0 g/1 glucose, which is, however, very important from a diagnostic point of view. It was therefore necessary to develop diagnostic strips in which, while maintaining the excellent color properties of the mentioned chromogenic system, the sensitivity of the reaction would be reduced so that the strips would react with the first clearly positive reaction to the amount of hydrogen peroxide - and thus to the amount of the substance generating this peroxide - only from a certain concentration limit.

Tento úkol se podařilo vyřešit předloženým vynálezem, jehož předmětem jsou diagnostické proužky ke stanovení součástí biologických kapalin obsahující chromogenní systém na bázi oxidační kopulace aromatického nebo heterocyklického aminu s fenolem, naftolem nebo 1,3-disubstituovaným 5-pyrazolonem, vyznačené tím, že obsahují pyrazolon obecného vzorce IThis task has been solved by the present invention, the subject of which are diagnostic strips for determining components of biological fluids containing a chromogenic system based on the oxidative coupling of an aromatic or heterocyclic amine with phenol, naphthol or 1,3-disubstituted 5-pyrazolone, characterized in that they contain a pyrazolone of the general formula I

v němž R^ je alkyl o počtu uhlíků 1 až 6, R^ je vodík nebo alkyl o počtu uhlíků 1 až 6 a R^ až Rj jsou stejné nebo rozdílné substituenty jako vodík, halogen, nitroskupina, sulfoskupina nebo fenoxyskupina.wherein R1 is alkyl of 1 to 6 carbons, R2 is hydrogen or alkyl of 1 to 6 carbons, and R3 to R4 are the same or different substituents such as hydrogen, halogen, nitro, sulfo or phenoxy.

Tento nový chromogenní systém vyniká proti dosud známým systémům tím, že pomocí pyrazolonu I je možné libovolně regulovat spodní hranici citlivosti proužků vzhledem k množství původního analytu, při jehož enzymové transformaci vzniká peroxid vodíku. Tato skutečnost je dána pravděpodobně tím, že v tomto novém systému dochází přednostně k oxidační kopulaci aktivní kopulačni komponenty s pyrazolonem I za vzniku bezbarvého produktu. Teprve po spotře bování veškerého pyrazolonu I, což odpovídá spotřebování ekvivalentní části peroxidu vodíku, dojde k reakci aktivní kopulačni komponenty s vlastní barvotvornou komponentou, tj. aromatickým nebo heterocyklickým aminem, fenolem, naftolem nebo 5-pyrazolonem, majícím však - na rozdíl od pyrazolonu I - volnou, nesubstituovanou methylenovou skupinu v poloze 4.This new chromogenic system stands out from the previously known systems in that it is possible to arbitrarily regulate the lower limit of the sensitivity of the strips with respect to the amount of the original analyte, during the enzymatic transformation of which hydrogen peroxide is formed. This fact is probably due to the fact that in this new system the active coupling component preferentially undergoes oxidative coupling with pyrazolone I to form a colorless product. Only after the consumption of all pyrazolone I, which corresponds to the consumption of an equivalent part of hydrogen peroxide, does the active coupling component react with its own color-forming component, i.e. an aromatic or heterocyclic amine, phenol, naphthol or 5-pyrazolone, which, however, has - unlike pyrazolone I - a free, unsubstituted methylene group in position 4.

Z uvedeného nástinu předpokládaných pochodů, které probíhají při pozitivní reakci v chromogenním systému proužků podle vynálezu, vyplývají i potřebné vzájemné poměry jednotlivých složek. Poměr aktivní a pasivní barvotvorné komponenty není kritický a může se pohybovat v poměrně širokých mezích od přebytku komponenty aktivní až po poměrně vysoký přebytek komponenty pasivní. U většiny proužků se však z hlediska výtěžku oxidační kopulace a z toho vyplývajících barevných vlastností proužků ukázal výhodným stechiometrický poměr obou těchto složek až do zhruba trojnásobného molárniho přebytku pasivní kopulačni komponenty. Možnost použití aktivní a pasivní kopulačni komponenty v prakticky zcela libovolných molárních poměrech vyplývá konečně i z popisu výše citovaných vynálezů, jako například z amerických patent· nich spisů 4 119 405 a 4 427 770 nebo DOS 3 032 421.The above outline of the expected processes that occur during a positive reaction in the chromogenic strip system according to the invention also results in the necessary mutual ratios of the individual components. The ratio of the active and passive color-forming components is not critical and can vary within relatively wide limits from an excess of the active component to a relatively high excess of the passive component. However, for most strips, from the point of view of the yield of oxidative coupling and the resulting color properties of the strips, a stoichiometric ratio of both of these components up to a roughly threefold molar excess of the passive coupling component has proven to be advantageous. The possibility of using the active and passive coupling components in practically any molar ratios also results from the description of the above-cited inventions, such as, for example, from U.S. Patents 4,119,405 and 4,427,770 or DOS 3,032,421.

Množství pyrazolonu I (který lze z hlediska předpokládaného mechanismu jeho účinku označit za bezbarvou pasivní kopulačni komponentu) použitého na proužcích podle vynálezu se řídí hranicí koncentrace peroxidu vodíku (případně látky, která tento peroxid v průběhu pří253138 slušné pomocné reakce generuje), při níž mají proužky poskytovat první pozitivní reakci.The amount of pyrazolone I (which, from the perspective of its presumed mechanism of action, can be described as a colorless passive coupling component) used on the strips according to the invention is governed by the concentration limit of hydrogen peroxide (or the substance that generates this peroxide during the appropriate auxiliary reaction) at which the strips should provide the first positive reaction.

Toto množství pyrazolonu I, případně jeho molární poměr například k barvotvorné pasivní komponentě je závislý jak na substituentech Rg až R_g v pyrazolonu I, tak i na použité kombinaci aktivní a pasivní barvotvorné komponenty a hlavně na biologické kapalině, k jejímuž vyšetřování jsou proužky určeny.This amount of pyrazolone I, or its molar ratio, for example, to the color-forming passive component, depends both on the substituents Rg to _Rg in pyrazolone I, as well as on the combination of active and passive color-forming components used, and mainly on the biological fluid for which the strips are intended to be examined.

Tak například u proužků pro stanovení glukosy v moči, které jako chromogenní systém obsahují kombinaci 4-aminoantipyrinu s l-fenyl-3-methyl-5-pyrazolon a jako pyrazolon X l-(4-sulfofenyl)-3,4-dimethyl-5-pyrazolon, a u nichž je nutné potlačit pozitivní reakci do koncentrace glukosy 0,20 g/1 a zeslabit pozitivní reakci pro koncentrace glukosy 0,30 až 0,50 g/1, je nutné použít poměrně vysoké množství pyrazolonu I, vyjádřené molárním poměrem k 1-fenyl-3-methyl-5-pyrazolonu 1 ku 5.For example, in strips for determining glucose in urine, which contain a combination of 4-aminoantipyrine with l-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone as a chromogenic system and l-(4-sulfophenyl)-3,4-dimethyl-5-pyrazolone as pyrazolone X, and in which it is necessary to suppress the positive reaction up to a glucose concentration of 0.20 g/l and to weaken the positive reaction for glucose concentrations of 0.30 to 0.50 g/l, it is necessary to use a relatively high amount of pyrazolone I, expressed as a molar ratio to 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone of 1 to 5.

U proužků pro stanovení glukosy v kapilární karvi, obsahujících chromogenní systém 4-aminoantipyrin s 1-(sulfofenyl)-3-methyl-5-pyrazolonem a jako pyrazolon I 1-(4-sulfofenyl)-3-methyl-4-butyl-5-pyrazolon, u nichž je třeba potlačit pozitivní reakci až do koncentrace glukosy 1,0 až 1,1 g/1, však postačuje molární poměr obou složek pouze 1 ku 100 až 1 ku 140. Obecně se tudíž pyrazolon I používá v diagnostických proužcích podle vynálezu v množství definovaném poměrem k pasivní barvotvorné komponentě 1 ku 2,5 až 1 ku 250, přičemž u proužků pro stanovení glukosy v moči činí tento poměr s výhodou 1 ku 2,5 až 1 ku 25, u proužků pro stanovení glukosy v krvni nebo séru s výhodou 1 ku 50 až 1 ku 150.However, for strips for the determination of glucose in capillary blood containing the chromogenic system 4-aminoantipyrine with 1-(sulfophenyl)-3-methyl-5-pyrazolone and 1-(4-sulfophenyl)-3-methyl-4-butyl-5-pyrazolone as pyrazolone I, in which the positive reaction needs to be suppressed up to a glucose concentration of 1.0 to 1.1 g/l, a molar ratio of only 1 to 100 to 1 to 140 is sufficient. In general, pyrazolone I is therefore used in the diagnostic strips according to the invention in an amount defined by a ratio to the passive color-forming component of 1 to 2.5 to 1 to 250, with this ratio being preferably 1 to 2.5 to 1 to 25 for strips for the determination of glucose in urine, and preferably 1 to 50 to 1 to 150 for strips for the determination of glucose in blood or serum.

Je samozřejmé, že vedle uvedeného ohromogennlho systému a pyrazolonu X obsahuji proužky podle ₍vynálezu řadu dalších látek a činidel, potřebných pro žádoucí průběh celé indikační reakce. U proužků pro stanovení glukosy, kyseliny močové, cholesterolu nebo triglyoeridů jsou to v prvé řadě specifické enzymy, za jejichž přítomnosti jsou tyto součásti biologických kapalin transformovány za současného vzniku peroxidu vodíku. Při stanovení glukosy a kyseliny močové jsou to pouze příslušné oxidoreduktasy - glukosaoxidasa nebo urikasa. Pro stanoveni cholesterolu nebo triglyceridů však proužky obsahují - vedle příslušné oxidoreduktásy ještě i dalši enzymy, potřebné pro transformaci stanovované látky na produkt, přístupný konečné oxidasové reakci. Tyto enzymy jsou obecně známé a již poměrně dlouhou dobu používané v klinicko-biochemioké analytice. Popis takovýchto složitějších enzymových systémů lze nalézt například v americkém patentním spise 3 983 005 nebo v DOS 2 512 586 a 2 737 286.It goes without saying that in addition to the aforementioned chromogenic system and pyrazolone X, the strips _according to the invention contain a number of other substances and reagents necessary for the desired course of the entire indication reaction. In the case of strips for the determination of glucose, uric acid, cholesterol or triglycerides, these are primarily specific enzymes in the presence of which these components of biological fluids are transformed with the simultaneous formation of hydrogen peroxide. In the determination of glucose and uric acid, these are only the relevant oxidoreductases - glucose oxidase or uricase. However, for the determination of cholesterol or triglycerides, the strips contain - in addition to the relevant oxidoreductase - also other enzymes necessary for the transformation of the substance to be determined into a product accessible to the final oxidase reaction. These enzymes are generally known and have been used in clinical-biochemical analysis for a relatively long time. A description of such more complex enzyme systems can be found, for example, in US patent specification 3,983,005 or in DOS 2,512,586 and 2,737 286.

Vlastní oxidační kopulace obou barvotvorných komponent i kopulace aktivní komponenty s pyrazolonem I působením peroxidu vodíku probíhá značně pomalu. Urychleni této reakce lze dosáhnout celou řadou vhodných katalyzátorů, z nichž se však v praxi nejlépe osvědčil enzym peroxidasa, která tvoři také nezbytnou součást proužků podle vynálezu.The actual oxidative coupling of both color-forming components and the coupling of the active component with pyrazolone I by the action of hydrogen peroxide proceeds very slowly. Acceleration of this reaction can be achieved by a number of suitable catalysts, of which the enzyme peroxidase, which also forms an essential part of the strips according to the invention, has proven to be the best in practice.

Vedle těchto hlavních složek mohou však proužky podle vynálezu s výhodou obsahovat ještě řadu dalších pomocných látek vytvářejících vhodné podmínky pro průběh všech reakcí, které při stanovení příslušné součásti biologických kapalin na proužku probíhají. V prvé řadě je to tlumič, jehož úkolem je nejen vytvářet optimální pH pro všechny výše popsané enzymové reakce, ale i pro vlastní koncovou barevnou reakci, tj. oxidační kopulaci barvotvorných složek chromogenního systému. Pro tento účel může být použit jakýkoliv z obecně známých a pro tento účel běžně užívaných neinterferujících tlumičů o pH 4,0 až 9,0, jako jsou například tlumiče oitrátové, malonátové, fosfátové, tlumiče na bázi tris(hydroxymethyl)-aminomethanu a podobně.In addition to these main components, however, the strips according to the invention may advantageously contain a number of other auxiliary substances creating suitable conditions for the course of all reactions that take place on the strip during the determination of the relevant component of biological fluids. First of all, it is a buffer, the task of which is not only to create an optimal pH for all the above-described enzyme reactions, but also for the final color reaction itself, i.e. oxidative coupling of the color-forming components of the chromogenic system. For this purpose, any of the generally known and commonly used non-interfering buffers with a pH of 4.0 to 9.0 can be used, such as citrate, malonate, phosphate buffers, buffers based on tris(hydroxymethyl)-aminomethane, and the like.

Dalši účinnou složkou proužků podle vynálezu mohou být s výhodou tzv. zahuštovadla, což jsou přirozené nebo syntetické polymerní látky, jako například želatina, karagenan, alginát, polyvinylpyrrolidon, polyvinylalkohol, kopolymer maleinanhydridu s methylvinyléterem, étery nebo estery celulózy nebo jejich směsi. Tato zahuštovadla celý reakční systém proužků stabilizují a vedle toho mají i pozitivní vliv na zvýraznění barevné reakce proužků při pozitivní reakci.Another active ingredient of the strips according to the invention may preferably be so-called thickeners, which are natural or synthetic polymeric substances, such as gelatin, carrageenan, alginate, polyvinylpyrrolidone, polyvinyl alcohol, maleic anhydride-methyl vinyl ether copolymer, cellulose ethers or esters or mixtures thereof. These thickeners stabilize the entire reaction system of the strips and, in addition, have a positive effect on enhancing the color reaction of the strips in the event of a positive reaction.

Dále je výhodné, jestliže proužky obsahují i vhodná smáčedla, jako například laurylsulfát, dioktylsulfojantaran nebo polyethylenglykol, které zvyšují smáčivost proužků a usnadňují tak proniknuti vyšetřované kapaliny k činidlům a tím urychlují průbSh reakce proužků. Navíc přispívají tyto látky i ke zvýšení čistoty odstínu a brilance zabarvení vzniklého při pozitivní reakci proužků.It is also advantageous if the strips also contain suitable wetting agents, such as lauryl sulfate, dioctyl sulfosuccinate or polyethylene glycol, which increase the wettability of the strips and thus facilitate the penetration of the examined liquid to the reagents and thus accelerate the reaction of the strips. In addition, these substances also contribute to increasing the purity of the shade and brilliance of the coloration resulting from a positive reaction of the strips.

V některých případech je výhodné, jestliže proužky obsahují ještě také vhodné indiferentní barvivo, které koriguje výsledný barevný odstín proužků při pozitivní reakci a zvýrazňuje rozdíl v intenzitě zabarvení při reakci proužků s rozdílnými kocentracemi peroxidu vodíku, případně výchozího analytu, z něhož tento peroxid vznikl. I když zásadně lze pro tento účel použít nejrůznější barviva, ve většině případů se nejlépe osvědčují barviva žlutá, jako například tartrazin, fluorescein nebo kyselina pikrová.In some cases, it is advantageous if the strips also contain a suitable indifferent dye, which corrects the resulting color shade of the strips in the event of a positive reaction and highlights the difference in color intensity when the strips react with different concentrations of hydrogen peroxide, or the starting analyte from which this peroxide was formed. Although in principle various dyes can be used for this purpose, in most cases yellow dyes, such as tartrazine, fluorescein or picric acid, are best.

Diagnostické proužky podle tohoto vynálezu se připravuji o sobě známým a pro přípravu diagnostických proužků obecně používaným způsobem spočívajícím v tom, že se všechny výše ií uvedené složky rozpustí ve vhodných rozpouštědlech jako například ve vodě, alkoholu, acetonu a tento tzv. impregnační roztok se nanese na nasákavou podložku, jako je filtrační papír nebo rouno ze syntetických vláken a vysuší.The diagnostic strips according to the present invention are prepared in a known manner and generally used for the preparation of diagnostic strips, consisting in dissolving all the above-mentioned components in suitable solvents such as water, alcohol, acetone, and this so-called impregnation solution is applied to an absorbent substrate such as filter paper or synthetic fiber fleece and dried.

V některých případech je pak výhodné část uvedených součástí rozpustit v jednom roztoku a část pak odděleně na druhý impregnační roztok a tyto roztoky nanést na nasákavý nosič postupně, přičemž po každé této impregnaci se nosič důkladně vysuší, například proudem horkého vzduchu. Tento způsob přípravy diagnostických proužků je blíže popsán v níže uvedených příkladech provedení vynálezu. Je však možné také všechny výše uvedené složky inkorporovat do vhodné polymerni vrstvy, která se pak ve formě tenkého filmu nanese na podložku z plastické hmoty, jak popisuje například americký patent 3 630 957. Tuto polymerni vrstvu a chromogennlm systémem podle vynálezu lze vedle toho použít i jako reakční vrstvu v tzv. Integrálním analytickém elementu popsaném podrobně například v americkém patentu 3 992 158.In some cases, it is advantageous to dissolve part of the components in one solution and part separately in a second impregnation solution and apply these solutions to the absorbent carrier in sequence, with the carrier being thoroughly dried after each impregnation, for example by a stream of hot air. This method of preparing diagnostic strips is described in more detail in the examples of embodiments of the invention below. However, it is also possible to incorporate all of the above-mentioned components into a suitable polymer layer, which is then applied in the form of a thin film to a plastic substrate, as described, for example, in US patent 3,630,957. This polymer layer and the chromogenic system according to the invention can also be used as a reaction layer in the so-called Integral Analytical Element described in detail, for example, in US patent 3,992,158.

Proti dříve známým řešením jsou proužky podle tohoto vynálezu charakteristické tím, že použitím vhodného množství pyrazolonu I v jejich reakčním systému je možné podle potřeby měnit hranici jejich citlivosti vůči peroxidu vodíku a tím vůči stanovované součásti vyšetřované biologické kapaliny. Tato přednost proužků podle vynálezu se uplatňuje ve všech případech, kdy je třeba zachytit stanovovanou ·součást biologické kapaliny teprve od jisté koncentrace, jako je například horní hranice tzv. normální hodnoty.Compared to previously known solutions, the strips according to the present invention are characterized by the fact that by using a suitable amount of pyrazolone I in their reaction system, it is possible to change the limit of their sensitivity to hydrogen peroxide and thus to the determined component of the examined biological fluid as needed. This advantage of the strips according to the invention is applied in all cases where it is necessary to capture the determined component of the biological fluid only from a certain concentration, such as the upper limit of the so-called normal value.

Příklad 1Example 1

Proužky ke stanovení glukosy v močiUrine glucose test strips

Impregnační roztok AImpregnation solution A

oitrátový tlumič o pH 5,3 želatina, 1,5% vodný roztok glukosaoxidasa, 24 U/mg peroxidasa, 100 U/mg, 1,8% vodný roztok oitrate buffer of pH 5.3 gelatin, 1.5% aqueous solution glucose oxidase, 24 U/mg peroxidase, 100 U/mg, 1.8% aqueous solution 62,00 ml 33,00 ml 1,65 g 4,85 ml 62.00 ml 33.00 ml 1.65 g 4.85 ml Impregnační roztok B Impregnation solution B metanol methanol 27,00 ml 27.00 ml voda destilovaná distilled water 20,30 ml 20.30 ml l-fenyl-3-methyl-5-pyrazolon 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone 1,45 g 1.45 grams 1-(4-sulfofenyl)-3,4-dimethyl-5-pyrazolon 1-(4-Sulfophenyl)-3,4-dimethyl-5-pyrazolone 0,41 g 0.41 grams 4-aminoantipyrin 4-aminoantipyrine 0,62 g 0.62 grams o-dianisidin o-dianisidine 0,62 g 0.62 grams polyvinylpyrrolidon K 90, 5% vodný roztok polyvinylpyrrolidone K 90, 5% aqueous solution 20,30 ml 20.30 ml laurylsulfát sodný sodium lauryl sulfate 0,41 g 0.41 grams

hydroxypropylcelulóza, 2% vodný roztok ve směsi metanol-voda 1 ku 1 30,00 ml tartrazin, 1% vodný roztok 2,40 mlhydroxypropylcellulose, 2% aqueous solution in a 1 to 1 methanol-water mixture 30.00 ml tartrazine, 1% aqueous solution 2.40 ml

Oba impregnační roztoky se připraví odděleně smícháním, popřípadě rozpuštěním všech 2 složek v uvedeném pořadí. Na filtrační papír o plošné hmotnosti 180 g/m se nanese impregnační roztok A a papír se dokonale vysuší proudem teplého vzduchu. Na tento papír se pak nanese impregnační roztok B a vysuší stejným způsobem. Vysušený papír se poté rozřeže na čtverečky o rozměru 6x6 mm a nalepí - například pomocí oboustranné samolepící pásky - na podložku z bílé plastické hmoty. Ve srovnání s proužky připravenými stejným způsobem, avšak bez 1-(4-sulfofenyl)-3,4—dimethyl-5-pyrazolonu, poskytují proužky podle tohoto vynálezu vizuálně podstatně lépe rozlišitelné zbarvení v oblasti nejnižších patologických koncentrací glukosy v moči (0,35 až 1,0 g/1), i silnějších glykosurií (10 až 30 g/1). Vedle toho jsou tyto proužky i stabilnější vůči vzdušné vlhkosti.Both impregnation solutions are prepared separately by mixing or dissolving all 2 components in the order listed. Impregnation solution A is applied to filter paper with a surface weight of 180 g/m and the paper is dried thoroughly with a stream of warm air. Impregnation solution B is then applied to this paper and dried in the same way. The dried paper is then cut into squares measuring 6x6 mm and glued - for example using double-sided adhesive tape - to a white plastic backing. Compared to strips prepared in the same way, but without 1-(4-sulfophenyl)-3,4-dimethyl-5-pyrazolone, the strips according to the present invention provide a visually significantly better distinguishable coloration in the range of the lowest pathological glucose concentrations in urine (0.35 to 1.0 g/l), as well as in stronger glycosuria (10 to 30 g/l). In addition, these strips are also more stable to atmospheric humidity.

Příklad 2Example 2

Proužky ke stanovení glukosy v kapilární krviStrips for determining glucose in capillary blood

Impregnační roztok AImpregnation solution A

citrátový tlumič o pH 5,3 želatina, 1,5% vodný roztok glukosaoxidasa, 20 U/mg peroxidasa, 100 U/mg, 1,8% vodný roztok citrate buffer of pH 5.3 gelatin, 1.5% aqueous solution glucose oxidase, 20 U/mg peroxidase, 100 U/mg, 1.8% aqueous solution 58,20 ml 38,80 ml 4.20 g 3.20 ml 58.20 ml 38.80 ml 4.20 g 3.20 ml Impregnační roztok B Impregnation solution B metanol methanol 65,00 ml 65.00 ml voda destilovaná distilled water 32,60 ml 32.60 ml 1-(4-sulfofenyl)-3-methyl-5-pyrazolon 1-(4-Sulfophenyl)-3-methyl-5-pyrazolone 2,90 g 2.90 grams l-fenyl-3-methyl-4-butyl-5-pyrazolon 1-phenyl-3-methyl-4-butyl-5-pyrazolone 0,15 g 0.15 grams 4-aminoantipyrin 4-aminoantipyrine 0,80 g 0.80 grams tartrazin, 1% vodný roztok tartrazine, 1% aqueous solution 2,30 ml 2.30 ml dioktylsulfojantaran sodný, 3% roztok v etanolu sodium dioctyl sulfosuccinate, 3% solution in ethanol 14,00 ml 14.00 ml Impregnační roztok C Impregnation solution C etanol ethanol 33,00 ml 33.00 ml toluen toluene 29,00 ml 29.00 ml diohlormetan dichloromethane 19,00 ml 19.00 ml metanol methanol 19,00 ml 19.00 ml methylhydroxypropylcelulóza methylhydroxypropylcellulose 2,30 g 2.30 grams ethylcelulóza ethylcellulose 1,20 g 1.20 grams polyvinylbutyral B 20 H polyvinyl butyral B 20 H 1,70 g 1.70 grams

Jednotlivé impregnační roztoky se nanesou postupně na filtrační papír o plošné hmotnosti oThe individual impregnation solutions are applied sequentially to filter paper with a basis weight of

180 g/m tak, aby papír byl roztokem právě nasycen. Po nanesení každého roztoku se papír důkladně vysuší proudem horkého vzduchu. Poslední impregnace, provedená pomoci impregnačního roztoku C, slouží k vytvoření semipermeabilní membrány, která zadrží na svém povrchu krevní elementy a propustí k reakčnímu systému proužků pouze krevní plasmu, případně sérum.180 g/m so that the paper is just saturated with the solution. After applying each solution, the paper is thoroughly dried with a stream of hot air. The last impregnation, carried out with impregnation solution C, serves to create a semipermeable membrane that retains blood elements on its surface and allows only blood plasma or serum to pass through to the reaction system of the strips.

Takto naimpregnovaný papír se zpracuje na konečné proužky způsobem popsaným v příkladu 1 . Po nakápnutí kapky krve na čtvereček naimpregnovaného papíru (reakční zónu proužků) se po 60 s odstraní krevní elementy otřením ovlhčenou buničitou vatou a vzniklé červené zbarvení reakční zóny. které je úměrné koncentraci glukosy ve vyšetřované krvi, se vyhodnotí bud vizuálně srovnáním se zkusmo zhotoVěneu barevnou srovnávací stupnicí, nebo změřením reflektance při vlnové délce 495 nm na vhodném reflexním fotometru. Tyto proužky slouží ke stáno7 vení glukosy v kapilární krvi v rozmezí koncentrací od 1,20 g do 8,0 g/1; reakčni zónu připravenou popsaným způsobem je vhodné použít na dvouzónovém proužku v kombinaci se zónou určenou pro stanovení glukosy v rozmezí 0,20 až 1,2 g/1, jak popisuje americký patent 4 427 770.The impregnated paper is processed into final strips in the manner described in Example 1. After a drop of blood is placed on a square of impregnated paper (reaction zone of the strips), the blood elements are removed after 60 s by wiping with a moistened cellulose cotton wool and the resulting red color of the reaction zone, which is proportional to the concentration of glucose in the blood being examined, is evaluated either visually by comparison with an experimentally prepared color comparison scale, or by measuring the reflectance at a wavelength of 495 nm on a suitable reflection photometer. These strips are used to determine glucose in capillary blood in the concentration range from 1.20 g to 8.0 g/l; The reaction zone prepared in the described manner is suitable for use on a two-zone strip in combination with a zone designed for glucose determination in the range of 0.20 to 1.2 g/l, as described in US Patent 4,427,770.

Jestliže se v impregnačním roztoku B nahradí l-fenyl-3-methyl-4-butyl-5-pyrazolon stejným množstvím 1-(2-chlor-4-sulfofenyl)-3,4-diethyl-5-pyrazolonu, získají se proužky prakticky stejných vlastností.If 1-phenyl-3-methyl-4-butyl-5-pyrazolone is replaced in impregnation solution B by the same amount of 1-(2-chloro-4-sulfophenyl)-3,4-diethyl-5-pyrazolone, strips with practically the same properties are obtained.

Claims

SUBJECT OF THE INVENTION

Diagnostic strips for the determination of components of biological fluids containing a chromogenic system based on the oxidative coupling of an aromatic or heterocyclic amine with phenol, naphthol or 1,3-disubstituted 5-pyrazolone, characterized in that they contain pyrazolone I of the formula The number of carbons 1 to 6, R 1 is hydrogen or alkyl of the number 1 to 6, and R 1 to R 1. are the same or different substituents as hydrogen, halogen, nitro, sulfo or phenoxy.