CS259211B1

CS259211B1 - Method of ampholytic buffers production

Info

Publication number: CS259211B1
Application number: CS855672A
Authority: CS
Inventors: Tomas Dobransky; Oto Sova
Original assignee: Tomas Dobransky; Oto Sova
Priority date: 1985-08-02
Filing date: 1985-08-02
Publication date: 1988-10-14
Also published as: CS567285A1

Abstract

Očelom spósobu výroby amfolytických pufrov na báze bielkovín je ich rozloženie na základné stavebné kamene - aminokyseliny a ich torza minerálnou hydrolýzou. Uvedeného účelu sa dosiahne použitím štandardného odstředěného mlieka s 6 molárnou kyselinou chlorovodíkovou pri teplote 105 °C po dobu 40 hodin. Po hydrolýze sa kyselina chlorovodíková z roztoku odpaří a zostavajúci roztok sa podrobí autofokusácii. Zo získaných frakcií sa pre konečný produkt vyberajú tie, ktoré sa najviac bližia svojimi hodnotami požadovanému rozsahu. Spósob výroby amfolytických pufrov móže nájst široké praktické použitie vo výskumných pracoviskách, v priemysle farmaceutickom, chemickom, potravinárskom a pri všetkých využitiach elektromigračných technik.The basis of the production method of ampholytic buffers based on proteins is their breakdown into basic building blocks - amino acids and their torso by mineral hydrolysis. The stated purpose is achieved by using standard skimmed milk with 6 molar hydrochloric acid at a temperature of 105°C for 40 hours. After hydrolysis, the hydrochloric acid is evaporated from the solution and the assembling solution is subjected to autofocus. From the obtained fractions, those that come closest in their values to the required range are selected for the final product. The method of producing ampholytic buffers can find wide practical use in research workplaces, in the pharmaceutical, chemical, food industry and in all applications of electromigration techniques.

Description

Vynález sa týká spůsobu přípravy amfolytických pufrov, vhodných pre elektromigračné metody, ako izoelektrické fokusovánie.The present invention relates to a process for the preparation of ampholytic buffers suitable for electromigration methods such as isoelectric focusing.

Doteraz sa pre izoelektrické fokusovánie a iné elektromigračné metodiky ako amfolytické pufre používali syntetické látky. Příprava týchto látok je velmi zložitá a nákladná. Préto sú uvedené výrobky ťažko dostupné a vylučujú ich použitie v preparatívnom meradle pri priemyselnom použití. Výroba amfolytických pufrov podía ČSSR AO č. 187 104 má tú nevýhodu, že východzia surovina obsahuje až 40 % solí, čo komplikuje spůsob výroby, pretože vyžaduje odsolovanie gélovou filtráciou.Until now, synthetic substances have been used for isoelectric focusing and other electromigration methods such as ampholytic buffers. The preparation of these substances is very complex and expensive. These products are difficult to obtain and exclude their use on a preparative scale for industrial use. The production of ampholytic buffers according to CSSR AO No. 187 104 has the disadvantage that the starting material contains up to 40% of salts, which complicates the production process because it requires desalting by gel filtration.

Uvedené nevýhody odstraňuje vypAlez, ktorého podstata spočívá v tom, že bielkoviny získané z odstrodeného mlieka Standardného zloženia sa podrobia minerálnej hydrolýze kyselinou chlorovodíkovou. Táto sa zo vzniknutého roztoku odstráni odpařením a zostávajúcim roztokom sa po přefiltrovaní naplní autofokusačná aparatúra, kde působením jednosměrného prúdu sa získá gradient pH. Zmiešaním vybraných frakcií sa ziskavajú amfolytické pufre požadovaného rozsahu.The above disadvantages are eliminated by the fact that the proteins obtained from the skim milk of the standard composition are subjected to mineral hydrolysis with hydrochloric acid. This is removed from the resulting solution by evaporation and the remaining solution is filled with an autofocusing apparatus after filtration, whereby a one-way flow gives a pH gradient. By mixing the selected fractions, ampholytic buffers of the desired range are obtained.

Vynález umožňuje jednoduchú výrobu velkého množstva amfolytických pufrov so štandardnými vlastnosťami, bez obsahu sacharózy pre analytické i priemyselné použitie izoelektrickej separácie, expedovatelné aj v lyofilizovanom stave, čo predlží expiračnú dobu pufrov. Příklad K príprave amfolytických pufrov z odstředěného mlieka s maximálnym obsahom tuku 0,05 objem, percent, ktoré obsahuje 26 až 30 g kazeínu v litri. Prvým krokom je izoláoia mliečnej bielkoviny vyzrážaním v izoelektrickom bode pri pH 4,7 jednomolárnym roztokom 4 -2 kyseliny chlorovodíkovéj. Po naslednom odstředění pri 10 m.s 20 minút sa na izolovaný kazeín působí šesťmolárnym roztokom kyseliny chlorovodíkovéj v pomere 1:50 k množstvu bielkoviny, ktorá sa Sálej hydrolyzuje pod spatným chladičom pri teplote 105 °C 40 hodin.The invention allows for the simple production of a large number of ampholytic buffers with standard sucrose-free properties for analytical and industrial uses of isoelectric separation, also disposable in lyophilized form, extending the buffer expiration time. Example For the preparation of ampholytic buffers from skimmed milk with a maximum fat content of 0.05% by volume, which contains 26 to 30 g of casein in liters. The first step is to isolate the milk protein by precipitation at an isoelectric point at pH 4.7 with a one-molar solution of 4-2 hydrochloric acid. After subsequent centrifugation at 10 m.s. for 20 minutes, the isolated casein is treated with a 1 M hydrochloric acid solution of 1:50 to a quantity of protein which is hydrolyzed under reflux at 105 DEG C. for 40 hours.

Do roztoku sa přidává 10 ml/1 kyseliny mravenčej, aby sa zabránilo vzniku huminových látok, ktoré sú produktami rozkládájúceho sa tryptofánu v přítomnosti cukorných zložiek.To the solution is added 10 ml / l formic acid to prevent the formation of humic substances which are products of tryptophan decomposing in the presence of sugar components.

Préd započetím hydrolýzy sa do roztoku přidává 1 % hmot. aktivného uhlí, ktorý už behom hydrolýzy vlaže na seba vMčšinu látok obsahujúcich ultrafialové světlo a roztok vyčiruje. Po skončení hydrolýzy sa roztok ochladí na teplotu 20 °C a po filtrácii-sa z filtrátu odpaří kyselina chlorovodíková za zníženého tlaku najvhodnéjšie v rotačnom odparováku pri teplote 40 °C tak, aby výsledný roztok vykazoval měrnou elektrickou vodivost 2 až 3 mS.cm Potom sa roztok naleje do autofokusera, kde prebieha autofokusácia pri 4 °C po dobu 48 až 72 hodin tak, aby příkon elektrického prúdu nepřesahoval 3 W. Napatie sa postupné zvyšuje z počiatočných 100 W až na 100 W. Po ukončeni autofokusovánia, kéS klesne prúd pod 0,5 mA sa z fokusačnej aparatúry zhromaždia tie frakcie, ktoré sú najbližšie v gradiente pH k hodnotám, žiadúcim po projekci! potřebného rozsahu pH pre výsledný produkt.When starting the hydrolysis, 1 wt. activated charcoal, which is already emitting during the hydrolysis of the lukewarm on most of the ultraviolet light-containing substances and solution. Upon completion of the hydrolysis, the solution is cooled to 20 ° C and, after filtration, the hydrochloric acid is evaporated from the filtrate under reduced pressure, preferably in a rotary evaporator at 40 ° C, so that the resulting solution has a specific electrical conductivity of 2 to 3 mS.cm. the solution is poured into an autofocuser, where autofocusing takes place at 4 ° C for 48 to 72 hours so that the power input does not exceed 3 W. The voltage gradually increases from the initial 100 W to 100 W. After autofocusing, when the current drops below 0 , 5 mA collects those fractions that are closest to the pH gradient to those desired after projection from the focusing apparatus! the required pH range for the final product.

Zvolená zmes sa podía potřeby může ešte raz refokusovať. Výsledná vodivost pufrov sa upraví na 1 mS.cm a obsah sušiny na 40 % hmot. Získaný produkt sá pre izoelektrickú fokusáciu použije v 2 až 3 objemových % koncentrácii v pomere k médiu.The selected mixture can be refocused once more as needed. The resulting buffer conductivity is adjusted to 1 mS.cm and the dry matter content to 40% by weight. The obtained product is used for isoelectric focusing in 2-3 volume% concentration relative to the medium.

Vynález může nájsť široké praktické použitie vo výskumných pracoviskách, v priemysle farmaceutickorn, chemickom, potravinárskom a pri všetkých využitiach elektromigračných technik.The invention can find widespread practical use in research workplaces, in the pharmaceutical, chemical, food, and all uses of electromigration techniques.

Claims

OBJECT OF THE INVENTION Process for the production of protein-based ampholytic buffers characterized in that the skimmed milk is hydrolysed with hydrochloric acid, preferably with 6 mol / L hydrochloric acid, then evaporated to a solution conductivity of 2 to 3 mS.cm and the solution autofocused for at least 48 hours.