CS258818B1 - Způsob výroby koproporfyrinu kultivaci kvasinek Saccharomyces - Google Patents

Abstract

Řešení se týká výroby koproporfyrinu kvasinkami Saccharomyces v anaerobním nebo semi-aerobním prostředí. Pro kontinuální produkci jsou využity kvasinky zabudované do gelu tvořící náplň průtokového reaktoru, ve kterém je koproporfyrin kontinuálně vytvářen z média obsahujícího glukosu a mo-' dovinu. Porfyrin je z eluátu isolován sorpční technikou kapalina, pevná fáze.

Description

Vynález řeší způsob výroby koproporfyrinu pomocí kvasinek.

Dosavadní způsob získávání prekursorů syntesy hernu spočívá v jejich isolací z přirozených zdrojů, jako je stolice a moč pacientů s porfyrickou chorobou. Takový nahodilý zdroj je nevhodný pro výrobu, protože tato choroba se vyskytuje jen ojediněle. Jiný způsob je získávání porfyrinů z kultivačního média bakterií (Arthrobacter). Uvedený způsob výroby porfyrinů vyžaduje kultivační médium značně složité (minimálně 13 komponentů), doba kultivace je dlouhá (15 až 30 dnů) a probíhá ve sterilních podmínkách.

Popsané nevýhody se odstraňují biotechnologickým způsobem výroby koproporfyrinu podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že k výrobě se používají kvasinky se zvýšenou schopnosti biosyntetisovat prekursor hernu. Vyznačeným způsobem výroby se kultivují kvasinky v jednoduchém a nesterilním médiu, které obsahuje alespoň zdroj uhlíku popřípadě zdroj dusíku. Biosyntetisovaný koproporfyrin je v kvasinkách shromažďován a vylučován do média, přičemž může být získán jak z kvasinek, tak z média.

Vynález využívá vázaných (imobilisovaných) kvasinek (agar, kolagen, alginát, carrageenan, polystyren atd.), které jsou zejména výhodné z technologického hlediska. Vázané kvasinky lze využívat dlouhodobě s možností kontinuální produkce prekursorů hernu. Imobilisace kvasinek nevyžaduje sterilní podmínky, což vylučuje nebezpečí kontaminace kmene v průběhu kultivace.

Zvýšenou biosyntézu porfyrinů lze dosáhnout např. semiaerobní kultivací. V těchto podmínkách kvasinky produkují násobně větší množství koproporfyrinu. V anaerobních podmínkách je inhibován oxygen-dependentní enzym koproporfyrinogenoxygenása, jehož substrát koproporfyrinogen je hromaděn a vylučován do média. Zvýšenou biosyntézu ostatních prekursorů hernu jako 8, 7, 6, 5 a 2 karboxylových porfyrinů, porfobilinogenu, kyseliny beta-aminolevulové lze dosáhnout mutací užitého kmene známými způsoby, jako např. ultrafialovým zářením, CO⁰⁰ isotopovým ozářením nebo působením činidel jako N-methyl-N-nitro-N-nitroguanosin.

Prekursory hernu se používají jako standardy nebo substráty v metodách klinické biochemie, i dále jsou využívány pro diagnostiku a farmakoterapii nebo jako přirozená barviva v potravinářském průmyslu.

Příklad 1

Kvasinky imobilisované v 3% alginátovém gelu se kontinuálně kultivovaly v průtokovém náplňovém reaktoru o objemu 2 000 ml při zředovací rychlosti 0,20 hod^-'''. Medium připravené z užitkové vody obsahující jako zdroj uhlíku glukosu (5 g/1) a jako zdroj dusíku močovinu (0,25 g/1) bylo do reaktoru přiváděno bez vzdušnění odspodu pomocí peristaltické pumpy při laboratorní teplotě. Poífyriny se z eluátu okyseleného kyselinou chlorovodíkovou (výsledná koncentrace byla 0,5M) isolovaly technikou extrakce kapalina, pevná fáze pomocí sorbentu SEPARON SIX C18 (velikost částic 60 až 80/um). Zachycené porfyriny (sorbce je 100 Ϊ) se ze sorbentu vymyly metanolem a esterifikovaly přidáním koncentrované HjSO^ (výsledná koncentrace byla 5 %).

Estery porfyrinů se dále čistily sloupcovou chromatografií na silikagelu. Jako mobilní fázi se použila směs chloroformu a etylacetátu v poměru 1:1. Posledním stupněm purifikace byla krystalisace ze směsi chloroform, metanol. Tímto purifikačním postupem se získal čistý koproporfyrin (analysa metodou vysokoúčinhé kapalinové chromatografie a tenkovrstevné chromatografie) bez jakékoliv příměsi dalších porfyrinů. K vyprodukování 3 519 nmol (2 300 >ug) koproporfyrinu se spotřebovalo 350 g glukosy a 17,5 g močoviny.

Příklad 2

Postup je stejný jako v příkladu 1, ale jako zdroj uhlíku lze použít kterýko-li zkvasitelný sacharid, meziprodukt Krebsova cyklu nebo aminokyseliny, zdroj dusíku bud vynechat nebo použít NH^Cl, aminokyseliny a zvláště porfyrinogenní glycin. Z 11 g glukosy, 11 g glycidu a 11 g jantaranu sodného se vyprodukovalo 70 nmol koproporfyrinu, z 55 g glukosy se vyprodukovalo 500 nmolu koproporfyrinu a 22 g glukosy a z 11 g močoviny se vyprodukovalo 720 nmolu koproporfyrinu.

Příklad 3

Vázané kvasinky jsou kultivovány stacionárně v mediu uvedeném v příkladě 1 nebo 2 v baňkách obsahujících 50 ml kultivačního media. Z glukosy (5 g/1) se získalo 1,5 nmol koproporfyrinu, ze sacharosy (5 g/1) se získalo 1,2 nmol koproporfyrinu.

Příklad 4

Kvasinky se kultivovaly jako v příkladě 3, ale použilo se 10 různých zástupců kmene Saccharomyces uvarum a 5 zástupců kmene Saccharomyces cerevisiae. V případě Saccharomyces uvarum se produkce pohybovala od 12,9 do 39,3 nmol koproporfyrinu na g suché váhy, v případě Saccharomyces cerevisiae od 23,3 do 126,0 nmol koproporfyrinu na g suché váhy.

Claims (3)

1. Způsob výroby koproporfyrinu kultivaci kvasinek Saccharomyces v anaerobním nebo semi-aerobním prostředí vyznačující se tím, že se použijí vázané kvasinky zabudované do gelu, které se kultivuji ve vodním médiu při minimální koncentraci 10 mg suché váhy kvasinek na 1 1 média, při teplotě media minimálně 4 °C, s obsahem kvasinkami využitelného zdroje uhlíku v minimálním množství 5 mg na 1 média bez vzdušnění, načež se koproporfyrin isoluje.

2. Způsob dle bodu 1 vyznačující se tím, že produkce koproporfyrinu probíhá v průtokovém reaktoru, který je alespoň z 1/20 objemu naplněn vázanými kvasinkami a do něhož je medium přiváděno pod tlakem o minimální zřeďovací rychlosti 0,002 hod meďium obsahující vyprodukovaný koproporfyrin a další produkty je z reaktoru průběžně odváděno.

3. Způsob dle bodu 1 a 2 vyznačující se tím, že koproporfyrin je z media isolován technikou extrakce kapalina, pevná fáze s využitím silikagélu potaženého nepolární fází jako sorbentu, z něhož je koproporfyrin eluován vhodným rozpouštědlem.