CS255356B1 - Method of blood styptic mammalian gamma globulin preparation for intervascular application - Google Patents

Description

3 4 253356 din imunoglobulínov podáváním homológ-nych imunoglobulínov prevažne i. m. ces-tou. Při podávání homológneho gamaglobulí-nového preparátu i. m. cestou si musíme u-vedomiť, že preparáty tohoto typu majúzpravidla vysokú antikomplementárnu akti-vitu, ktorá může ovplyvňovať nešpecifickúimunitu blokováním komplementového sy-stému, v dósledku čoho může byť ohrozenýterapeutický efekt tých imunoglobulínov,ktoré ku svojej činnosti potrebujú komple-ment. Táto skutočnosť by dokázala vysvětlit po-pisovaný kladný terapeutický účinok ho-vádzieho i. m. gamaglobulínu ako ho popi-suje Tlučhoř a Komárek (Tlučhoř V., Komá-rek J.: Veterinářství 33, 5, 221, 1983) a niecelkom terapeuticky přesvědčivý účinokgamaglobulínového i. m. preparátu od to-ho istého výrobců ako ho popisuje Jílek aspol. (Jílek F., Dobšinský O., Novotný B.:Veterinářství 33, 5, 218, 1983), ktorí použilidvojnásobná dávku ako Tlučhoř a Komá-rek. Až doposial' sa realizuje příprava zviera-cích savčích gamaglobulínov pre terapeu-tické účely prevažne podl'a kritérií pre in-tramuskulárne podanie t. j. kladie sa dorazna výťažnosť, elektroforetickú čistotu a naobsah látok so schopnosťou vyvolať pyre-tickú reakciu. Preparáty tohoto typu majúdlhú dobu vstrebatefnosti a zpravidla vy-kazujú antikomplementárnu a hypetenzív-nu aktivitu.

Na precipitáciu gamaglobulínu zo zmesizvieracích plazmatických alebo sérovýchbielkovín može byť použitý síran amonný ahydroxid hlinitý (Schultze Η. E., MathekaH. D.: Behringwerke Mitt. 28, 9, 1954; Schul-tze Η. E., Schonenberger M., Matheka H. D.:Behringwerke Mitt. 26, 21, 1952), rivanol(Hořejší J., Smetana R.: Acta Med. Scand.155, 65, 1956), síran sodný (Amiraian K.,Leikhim E. J.: J. Immunol. 87, 301, 1961),chlorid hlinitý (Lewin J.: Therapie 9, 523,1954), DEAE celulóza (Sober H. A., Peter-son E. A.: Fed. Proč. 17, 1 116, 1958; Peter-son E. A., Sober H. A.: J. Am. Chem. Soc. 78,756, 1956; Fahey J. L., Herbett A. P.: J. Biol.Chem. 234, 2 645, 1959; Stanworth D. H.: Ná-tuře 188, 156, 1960), kyselina kaprylová(Steinbuch M., Audran R.: Rev. Franc. D‘-etud. Clin. Biol. 14, 1054, 1969), ionty Zn+ +a Al+ + + (Rejnek J., Svařil F.: Coll. Cze-choslov. Chem. Commun. 22, 1 489, 1957;Rejnek J., Škvařil F.: Coll. Czechoslov.Chem. Commun. 23, 773, 1958; Krauze R.,Naimski K., Zakrewski K.: Acta Biochim.Pol. 8, 209, 1961), polymetafosfát (Nitsch-man H. S., Rickli R., Kistler P.: Vox Sang.5, 232, 1969), éter (Pennell R. B. v PutnámF. W.) ed (The Plasma Proteine vol I Aca-demie Press New York 1960, str. 3) a eta-nol (Cohn (E. J., Gurd F. N. R., Surgenor D. M., Barnes B. A., Brown R. K., Derounaux G.,Gillespie J. M., Kahnt F. W., Lever W. F., Liu C. H., Mittelman D., Mouton R. F., SchmidK., Uroma E.: J. Am. Chem. Soc. 72, 465,1950; Deutsch H. F., Gostling G. L., AlbertyR. A., Williams J. W.: J. Biol. Chem. 164,109, 1946; Oncley J. L., Melin M., Rickert D. A., Cameron J. W., Gross P. M.: J. Am. Chem.Soc. 71, 541, 1949; Nitschman H. S., KistlerP., Lergier W.: Helv. Chim. Acta 37, 866,1954; Kistler P., Nitschman H. S.: Vox Sang.7, 414, 1962; Taylor H. L., Bloom F. C., Mc-Call K. B., Hydman L. A., Anderson H. D.: J.Am. Chem. Soc. 78, 1 356, 1956).

Preparáty gamaglobulínu z homolognejsavčej krvnej plazmy alebo séra připrave-né podl'a doterajších kritérií pre i. m. poda-nie majú zpravidla hypotenzívny a antikom-plementárny účinok čo je pre kvality intra-venóznych preparátov nepřípustné. Poda-nie preparátu týchto kvalit intravenóznemože v důsledku náhlého poklesu krvnéhotlaku zviera ohrozit a v důsledku antikom-plementárnej aktivity oslabit jeho nešpeci-fickú obranu.

Napriek tomu, že hypotenzívny účinok priintramuskulárnom podaní nemá taký prie-beh ako pri intravenóznom podaní, možnoho označit spolu s vysokým antikomple-mentárnym účinkom za vlastnosti nežiadu-ce pre preparáty savčieho gamaglobulínu,ktoré sú určené pre terapeutické účely čiuž pre intramuskulárne alebo pre intrave-nózne podanie.

Na odstraňovanie antikomplementárnejaktivity gamaglobulínu, ktorý bol připra-vený zo zmesi savčích p’azmatických ale-bo sérových bielkovín pri zachovaní homo-lógnosti může byť použitá úprava hodnotypH na 4,0 pri 24 hodinovej inkubácii pri 37stupňoch Celzia (Barandun S., Kistler P.,Jeunet F., Isliker H.: Vox Sang. 7, 157, 1962).

Pokles antikomplementárnej aktivity ga-maglobulínu bol zaznamenaný po přidaníaktívneho uhlia (Steinbuch M., Audran R.,Amouch P., Blatrix C.: Vox Sang. 13, 103,1967), po přidaní trikalciumfosfátu (Stein-buch M., Audran R., Amouch P., Blatrix C.:Rev. med Tours, suppl. No 3, 1968) a po při-daní albuminu (Auerswald W., KiesewetterE.: Wien. med. Wschr. 115, 690, 1965).

Znižovanie antikomplementárnej aktivitygamaglobulínového roztoku pomocou pro-teolytického štiepenia bolo realizované pep-sínom (Schultze Η. E., Schwick G.: Dtsch.med. Wschr. 87, 1 643, 1962) a plazmínom(Sgouris J. T.: Vox Sang. 13, 71, 1967; Ba-randun S., Castel F., Makula M. F., Morell A., Pian R., Škvařil F.: 28, 157, 1975).

Antikomplementárnu aktivitu gamaglobu-línovej molekuly je možné znížiť jej che-mickou redukciou beta merkaptoetanolom(Wiedermann G., Miescher P. A., FranklinE. C.: Proč. Soc. exp. Biol. Med. 113, 609,1963), modifikáciou beta propiolaktonom(Stephan W.: Z. kliň. Chem. 7, 262, 1969;Stephan W.: Vox Sang. 28, 422, 1975), re-dukciou s dithioerythritolom (Isenman D. 5

2S535S E., Dorrington K. J., Painter R. H.: J. Imraun.114, 1 726, 1975], sulfonáciou (Masuho Y.,Tomibe K., Matsuzawa K., Ohtsu A.: VoxSang. 32, 175, 1977), amidňciou (Schidtbcr-ger R.: US Patent No 4 118 379 — 1978), rc-dukciou s dithiothreitolom a alkyláciou sjodacetamídom (Fernandes P. M., Lund-blad J. L.: Vox Sang. 39, 101, 1980) a reduk-cíou s dithiothreitolom v kombinácii s di-thioerythritolom s následnou alkyláciou po-mocou jodacetamidu alebo metyljodidu, ak-rylonitrilu, benzylbromidu připadne etylén -oxidu (Schroeder D. D,, Tankersley D. L.,Lundblad J. L.: Vox Sang. 40, 373 1931).

Antikomplementárna aktivita savčiebo gít-inaglobuínu súvisí jednak so vznikom po-lymerov gamaglobulíuu, ktoré móžu vzni-kat v procese technologické] izolácie a jed-nak vzniká v procese lyofilizácie v dosíed-ku interakcie nízkomolekulárnych látok smolekulami gamaglobulínu. Použitie deštilovanej apyrogennej vody pri separácii níz-komolekulárnych látok z gamaglobulínujednak spdsobuje precipitáciu najma vyšších polymerov gamaglobulínu a jednak od-stránenie nízkomolekulárnych látok v dů-sledku čoho pri lyoiilizácii nemůže dójs!'ku ich interakcii s molekulami gamaglobu-línu, číže nedochádza ani ku vzniku anti-komplementárnej aktivity. Použitie vodnéhoroztoku chloridu sodného, v koncsntráciido 30 g na liter, zaručuje polymérom varnaglobulínu v roztoku potřebná stabilitu adochádza len ku separácii nízkomolekulár-nych látok, ktoré sposobujú vznik antikom-plementárnej aktivity v procese izolácie.

Antikomplementárna aktivita bola testo-vaná na základe úbytku aktivity komple-mentu. Úbytok známej hodnoty aktivitykomplementu po přidaní známého množstvaroztoku lyofilizovaného gamaglobulínovéhopreparátu bol stanovený metodou pódia Ka-bata a Mayera (Kabat E. A., Mayer Μ. M.:Experimentální imunochemie ČSAV, Praha1965 str. 180).

Efekt dešti1 ovanej apyrogennej vody priodstráňovaní antikomplementárnej aktivityje možné dokumentovat u 5 experimentál-nych šarží gamaglobulínu, ktorý bol izolo-vaný z frakcie III pódia Cohna a Oucleya.Pokial' bola použitá samotná destilovanávoda, bolo dosiahnuté zníženie antikomple-mentárnej aktivity gamaglobulínu po lyofi-lizácii o 80 až 95 °/o. Použitie vodného roz-toku chloridu sodného, za použitia toho is-tého gamaglobulínového materiálu, v kon-centrácii do 30 g na liter spósobio zníženieantikomplementárnej aktivity gamaglobulí-nu po lyoiilizácii iba o 30% až 45%. Pokiai niesu v roztoku gamaglobulínu přítom-né jeho vyššie polyméry, sú výsledky testo-ván ia antikomplementárnej aktivity v lyo-filizovanom gamaglobulínovom preparáte, zkterého bolí odstráňované nízkomolekulár-ne látky za použitia destilovanej apyrogén-nej vody alebo za použitia vodného rozto- ku chloridu sodného do 30 gramov na literprakticky rovnaké.

Hypotenzívny účinok bol testovaný nazáklade poklesu krvného tlaku králíka pria-mou krvnou metodou podl'a ČSL 3 (ČSL 3,svazok I, vydanie III, Avicenum Praha 1970str. 149) s tým, že králíkovi o hmotnosti 2až 3 kg sa aplikujú 2 ml gama globulíno-vého roztoku na kg hmotnosti. Obsah ga-ma globulínu v aplikovanom roztoku je 50gramov na 1 000 ml roztoku. U preparátovpřipravených pódia navrhovaného postupusa hypotenzívna aktivita nevyskytovala vtak výraznej intenzitě, čo je možné doku-mentovat údajom, že z 5 připravených ex-perimentálnych šarží pódia předloženéhovynálezu bol stanovený pokles systolickéhotlaku maximálně o 4 až 8 % v porovnaní stým istým materiálom v tej istej dávke bezseparácie nízkomolekulárnych zlúčenín, kdebol stanovený pokles systolického prvuéhotlaku od 20 do 30 %.

Podstatou vynálezu je odstranenie balast-ných negamaglobulínových příměsí, ktorémajú vzhiadom ku gamaglobulíuu nižšiumolekulárnu hmotnost. Za hraničně liodno-hy možno považovat údaje okolo 50 000 mo-lekulárnej hmotnosti.

Odstranenie balastných negaraaglobu'lno-vých příměsí je možné previest: A. Gélovou filtráciou B. Dialýzou C. Ultrafiltráciou D. Diafiltráciou A. V súčasnosti existuje celá rada ko-merčných materiálov pre gélovou filtráciuna báze dextranových gélov, pod označe-ním Sephadex, polyakry amidových gélov,pod označením Biogel, hydroxyalkylmeta-krylátových gélov, pod označením Spheron,polystyrénových gélov, pod označením Sty-ragel, polyvinylacetátových gélov, pod o-značením Merskogel,. poréznych silikátov,pod označením Porasi', a poréznych skielpod označením Bioglas, ktoré majú odstup-ňované velkosti pórov v gélových časticiacha umožňujú gélovou filtráciu v poměrněširokých rozmedziacli molekulárnych hmot-ností. B. Dialýza sa v poslednom desateočí zno-vu začína uplatňovat najma pri výrobě lie-čiv ako technologická metoda separácietých zmesí prírodných alebo syntetickýchlátok, ktorých molekuly majú podstatnérozdielnú hmotnost. V súčasnosti existuje celá rada komerč-ných membrán pre dialýzu či už v podoběrovinnej membrány a'ebo v podobě potru-bia o menlivom priemere a menlivej velkos-ti pórov na báze regenerovanej celulózy a-lebo jej derivátov, připadne na báze kolódiaa taktiež na báze vinylových polymérov. C. Separácia nízkomolekulárnych zlúče-nín do molekulové) hmotnosti 50 000 sa mó- 255356 7 8 že uskutočniť aj pomocou ultrafiltrácie, kto-rú možno realizovať v podobě dutých nitípričom gamaglobulínový roztok preteká podtlakom do 800 kP vo vnútri niťovej mem-brány a cez póry v stene niťovej membrányprestupujú nízkomolekulárne látky v vodnom roztoku do zbernej nádoby.

Ultrafiltráciu je možno realizovať aj v po-době kazetového systému kde v rovinnomusporiadaní je alebo vyměnitelná membrá-na alebo doska z umelej hmoty s definova-nými vefkosťami pórov. Gamaglobulínovýroztok pod tlakom do 800 kP preteká na-příklad nad membránou a cez póry v ste-ne rovinnej membrány alebo došky z umelej hmoty prestupujú relativné nízkomole-kulárne látky vo vodnom roztoku do zber-nej nádoby. D. Odstráňovanie relativné nízkomoleku-lárnych zlúčenín do molekulárnej hmotnos-ti 50 000 je možno uskutočniť aj pomocoudiafiltrácie, čo jě kombinácia dialýzy a ul-trafiltrácie. Diafiltráciu je možné realizo-vať jednak v podobě dutých nití pričom ga-maglobulínový roztok preteká pod tlakomdo 200 kP vo vnútri niťovej membrány acez póry v stene niťovej membrány prestu-pujú reálne nízkomolekulárne látky do zvonkajšiej strany pretekajúceho roztoku,ktorý relativné nízkomolekulárne látky od-plavuje od niťovej membrány do odpadu.

Diafiltráciu je možné realizovať aj v po-době kazetového systému kde v rovinnomusporiadaní je alebo vyměnitelná membrá-na připadne doska z umelej hmoty s defi-novanou vefkosťou pórov. Gamaglobulíno-vý roztok pod mierným tlakom do 200 kPpreteká například nad membránou a cezpóry v stene rovinnej membrány alebo po-réznej došky prestupujú reálne velmi po-malým prietokom relativné nízkomolekulár-ne látky do pod membránou pretekajúcehoroztoku, ktorý odplavuje relativné nízkomo-lekulárne látky do odpadu. Východziou surovinou može byť pastafrakcie II izolovaná metodou podlá Cohnaa Oncleya z normálnej alebo hyperimunnejsavčej plazmy připadne z normálneho ale-bo retroplacentárneho připadne hyperimun-ného séra savcov. Taktiež však možu byťpoužité bielkovinné gamaglobulínové mate-riály izolované pomocou iných metod.

Bielkovinný materiál sa rozpúšťa v ta-kom množstve destilovanej apyrogénnej vo-dy o teplote 0 °C až +6 °C, aby sa hodno-ta koncentrácie bielkovín nachádzala v roz-medzí 10 až 180 gramov na liter, s optimom60 až 100 gramov na liter. Rozpúšťanie saurýchluje miešaním. Po rozpuštění sa ga-maglobulínový roztok vyčíri například filt-ráciou. V technologických pomeroch sú vyššie uvedené optimálně podmienky zachovanévtedy ak rozpúšťame 1 kg gamaglobulíno-vej pasty v 2 000 ml destilovanej apyrogén-nej vody o teplote 0 °C až -j-6 °C. HodnotapH takto připraveného gamaglobulínového roztoku bývá zpravidla v rozmedzí pH 4,0až 8,0 a koncentrácia bielkovín v rozmedzí60 až 100 gramov na liter. Takto připrave-ný roztok gamaglobulínu sa vyčíri napří-klad filtráciou a nízkomolekulárne zlúčeni-ny do 50 000 molekulárnej hmotnosti sa od-stránia například gólovou filtráciou, dialý-zou, ultrafiltráciou alebo diafiltráciou po-mocou elúcie alebo narieďovania s destilo-vanou apyrogénnou vodou alebo s vodnýmroztokom chloridu sodného o koncentráciimaximálně do 30 gramov na liter, s opti-mom 3,0 až 9,0 gramov na liter, o teplote0 °C až +6 °C s hodnotou pH v rozmedzí 4,0až 8,0. Gamaglobulínový roztok sa po od-dělení nízkomolekulárnych látok sterilizu-je, například filtráciou alebo pomocou i-ných metod, a potom sa zakoncentrovávanapříklad lyofilizáciou a’ebo pomocou mem-brán, vákuovou destiláciou, vymrazovanímalebo inými metodami a v případe potřebysa podrobí ďalšiemu spracovaniu na koneč-ný produkt.

Vynález je ďalej objasněný na príkladochprevedenia, ktorými jeho rozsah nieje aniobmedzený ani vyčerpaný. Příklady prevedenia Příklad 1 Východziou surovinou móže byť pistafrakcie II izolovaná metodou pódia Cohnaa Oncleya z normálnej alebo hyperimunnejsavčej plazmy připadne z normálneho ale-bo retroplacentárneho připadne hyperimun-ného séra savcov s antibakteriálnou, anti-toxickou alebo antivirovou protilátkovou ak-tivitou. Bielkovinný gamaglobulínový ma-teriál sa rozpúšťa v takom množstve desti-lovannej apyrogénnej vody o teplote 0 °C až+6 °C aby hodnota koncentrácie bielkovínsa nachádzala v rozmedzí 10 až 180 gramovna liter, s optimom 60 až 100 gramov na li-ter. Rozpúšťanie sa urýchluje miešaním. Porozpuštění sa gamaglobulínový roztok vyčí-ri například filtráciou. V technologických pomeroch sú vyššie u-vedené podmienky optima zpravidla zacho-vané vtedy ak rozpúšťame 1 kg gamaglobu-línovej pasty v 2 000 ml destilovanej apy-rogénnej vody o teplote 0 CC až -j-6 °C. Hod-nota pH gamaglobulínového roztoku bývázpravidla v rozmedzí 4,0 až 8,0 a koncen-trácia bielkovín v rozmedzí 60 až 100 gra-mov na liter. Takto připravený roztok pu-rifikovaného savčieho gamaglobulínu sa vy-číri například filtráciou a nízkomolekulár-ne zlúčeniny sa zo savčieho gamaglobulí-nového roztoku odstránia: A. Gélovou filtráciou B. Dialýzou C. Ultrafiltráciou D. Diafiltráciou 255356 10 A. Odstránenie nízkomolekulárnych zlúče-nín sa prevádza elučnou gélovou chromatografiou s destilovanou apyrogénnou vodoualebo s roztokom chloridu sodného v des-tilované] apyrogénnej vodě o koncentráciido 30 gramov na liter pri teplote 0 °C až+6°C pri pH 4,0 až 8,0 s vylučovacou me-dzou gélu vyjádřenou raoleku’árnou hmot-nosťou do 50 000 pričom je potřebné uve-dené materiály používat v optimálnom zr-nění zaručujúcom prietok v technologickýchpodmienkách.

Ko kolóny naplnenej s napučaným gélovým materiálom necháme nasávat gamaglo-bulínový roztok takou rýchlosťou, aby prie-tok spodnou plochou kolóny sa pohybovalmedzi 0,01 ml až 3,0 ml za minutu na plo-chu 1 cm2. Množstvo savčieho gamaglobu-línového roztoku nasadeného na kolonu ne-má překročit 25 až 30 % objemu gélovejČasti kolóny. Účinnost delenia je možnésledovat podfa stupňa oddelenia etylalko-holu, chloroformu a ninhydrin pozitívnycblátok z gamaglobulínového roztoku. Pokiafby nedošlo ku dokonalému oddeleniu je potrebné zmenšit objem vkládaného gamaglo-bulínového roztoku na kolonu a spoma iťprietok. Po separácii nízkomolekulárnychzlúčenín zo savčieho zvieracieho gamaglo-bulínového roztoku sa tento ďalej spraco-váva. B. Sterilný roztok purifikovaného gama-globulínu sa opatrné přesaje do sterilnéhodialyzačného potrubia, ktoré sa před zahajením presavania v spodnej časti uzatvoríuzlom a po přesátí sa vrchná část uzatvoríuzlom so smyčkou za ktorú sa naplněné potrubie zavěsí na háčik, ktorý je tak umiestnený, aby roztok gamaglobulínu v dia yzač-nom potrubí bol v stálom styku s preteka-júcou destilovanou apyrogénnou vodou a-lebo s roztokom chloridu sodného v dešti-lovanej apyrogénnej vodě o koncentráciido 30 gramov na liter pri teplote 0 "C až+6 °C pri pH 4,0 až 8,0 pričom velkost pórov v dialyzačnej membráně by mala byttak velká, aby umožnila separáciu nízkomolekulárnych látok vyjádřená moleku árnouhmotnosťou do 50 000.

Koniec dialýzy je indikovaný negativnoureakciou na etanol, chloroform a na ninhyd-rin pozitivně látky v pretekajúcej dialyzač-nej tekutině ako aj negativnou reakciou naetanol a chloroform v gamaglobulínovomroztoku. Po skončení dialýzy sa dialyzačnepotrubie zvesí z háčika, opatrné sa vyberiea po rozstrihnutí sa gamaglobulínový roz-tok preleje do zbernej nádoby a ďalej saspracováva. C. Odstraňovanie re!atívne nízkomoleku-lárnych zlúčenín do molekulárnej hmotnos-ti 50 000 je možné uskutočniť pomocou ul-trafiltrácie, pričom relativné nízkomoleku-lárne látky v podobě roztoku odtekajú dozbernej nádoby. Ultrafiltráciu je možné re-alizovat jednak v podobě dutých nití alebov podobě kazetového systému, kde sa po- užívajú došky alebo membrány s definova-nými vefkosťami pórov.

Vzhfadom na to, že roztok gamaglobulí-nu sa pri ultrafiltrácii zakoncentrováva pre-vedieme opatovné nariedenie s destilovanouapyrogénnou vodou alebo s roztokom chlo-ridu sodného v destilovanej apyrogénnejvodě v koncentrácii do 30 gramov na litera toto zakoncentrovávanie například na po-lovičný objem a narieďovanie na póvodnýobjem prevádzame dovtedy pokiaf je reak-cia gamaglobulínového roztoku na přítom-nost chloroformu a etanolu pozitivna.

Sterilizácia ultrafiitračného zariadeniasa prevádza alebo parou alebo chemickoucestou například prepláchnutím aparatúryvodným roztokom formalínu o koncentrá-cii do 50 g na liter a následným vymytímformalínu destilovanou vodou. D. Odstráňovanie relativné nízkomoleku-lárnych látok do molekulárnej hmotnosti50 000 je možné uskutočniť pomocou dia-filtrácie pričom reatívne nízkomolekulár-ne látky prestupujú do roztoku apyrogén-nej vody alebo do roztoku chloridu sodné-ho v destilovanej apyrogénnej vodě o kon-centrácii do 30 gramov na liter pri teplote0 °C až -j-6 °C pri pH 4,0 až 8,0, ktoré rela-tivné nízkomolekulárne látky odplavujú doodpadu. Diafiltráciu je možné realizovatjednak v podobě dutých nití alebo v podo-bě kazetového systému kde sa používajúdošky alebo membrány s definovanými vef-kosťami pórov.

Vzhfadom na to, že roztok gamaglobulí-nu sa pri diafiltrácii zakoncentrováva, pre-vedieme opatovné nariedenie s destilova-nou apyrogénnou vodou alebo s roztokomchloridu sodného v destilovanej apyrogén-nej vodě o koncentrácii do 30 gramov naliter a toto zakoncentrovávanie napříkladna polovičný objem a narieďovanie na pó-vodný objem prevádzame dovtedy, pokiafje reakcia gamaglobulínového roztoku napřítomnost chloroformu a etanolu pozitiv-na. Savčí gamaglobulínový roztok sa prele-je do zbernej nádoby a ďalej sa spracová-va.

Sterilizácia diafiltračného zariadenia saprevádza alebo parou alebo chemickou ces-tou naprík ad prepláchnutím aparatúry vod-ným roztokom formalínu o koncentrácii do50 gramov na liter a následným vymytímformalínu sterilnou destilovanou vodou.

Dokaž chloroformu sa prevádza Fujiwa-rovou reakciou (Fujiwara: Sitzber. Naturw.Ges. Rostock 6, 33 1916] či už v póvodnomusporiadaní, alebo v novších aplikáciach po-dlá Seta a Schultzeho (Seto T., Schultze M.O.: Anal. Chem. 28, 1 625, 1956), Hildebrech-ta (Hildebrecht C. D.: Anal. Chem. 29, 1037,1957), Friedmana a Coopera (Friedman P.J., Cooper J. R.: Anal. Chem. 30, 1 674, 1958).

Ninhydrin pozitivně látky stanovujeme spósobom podfa Ruhemana (Ruhemann S.: J. Chem. Soc. 97, 1438, 1910). Stanovenie

Claims (4)

1. 255356 11 12 etanolu sa prevádza Agulhonovou reakcion(Agulhon H.: Bull. soc. chim. France[4], 9,881,’ 1911) či už v původnom usporiadauí,alebo v novějších aplikáciach podl'a Kellct-ta (Kellett E. G.: Analyst 62, 728 1937), a-lebo Webba (Webb D. A.: Sci. Proč. RoyDublin Soc. 21, 281, 1936). Gamaglobulínový roztok po oddělení níz-komolekulárnych látok sa sterilizuje na-příklad fftráciou alebo Inými metodami, apotom sa zakoncentrováva například lyofi-lizáciou alebo pomocou membrán, vakuo-vou destiláciou, vymrazovaním alebo inýmimetodami, a v případe potřeby sa podrobíďalšiemu spracovaniu. Příklad 2 Východziou surovinou móže byť bielko- vinná pasta alebo bielkovinný roztok sav-čieho gamaglobulínu izolovaný aj pomocouiných metod. Bielkovinná pasta alebo bie -kovinný roztok savčieho zvieracieho gama-globulínu sa spracováva v ďalšom postupepodobné ako v příklade 1 s tým rozdielom,že kritérium odstránenia nízkomolekulár-nych zlúčenín z roztoku gamaglobulínu nesúvisí s prítomnosťou etanolu alebo chlo-roformu, ale s prítomnosťou precipitačnejlátky, ktorá bola na precipitáciu gamaglobu-línu alebo jeho imobilizovanie použitá. Kri-térium ninhydrin pozitívnych látok je za-chované pri akejkolvek metóde, pričom pro-ces oddelovania sa opakuje dovtedy pokiaí'nieje reakcia v negamaglobulínovom podie-le negativna. I’ R E D Μ E T

   1. SpĎsob přípravy krvného zvieraciehosavčieho gamaglobulínu pře i. v. podanievyznačujúci sa tým, že sa bielkovinný ma-teriál obsahujúci purifikovaný savčí gama-globulín suspenduje za aseptických podmienok v takom nmožstve apyrogénnej des-tilovanej vody o teplote 0°C až -j-6 C, abyhodnota koncentrácie bielkovín sa nachůdzala v rozmedzí 10 až 180 gramov na liter, gamaglobulínový roztok sa vyčíri na-příklad filtráciou a oddelia sa nízkomole-kulárne látký, vyjádřené molekulovou hmot-nosťou do 50 000, potom sa gamaglobulí-nový roztok sterilizuje například filtrácioua následné sa zakoncentrováva napříkladlyofilizáciou alebo pomocou membrán, vákuovou destiláciou, vymrazením a v přípa-de potřeby sa podrobí ďalšiemu spracova-niu na konečný produkt.
2. 2. Spůsob přípravy podl'a bodu 1 vyznaču-júci sa tým, že oddelenie relativné nízko VYNALEZU molekulárnych látok do molekulárně) hmotnosti 50 000 sa prevádza elúciou alebo na-riedením s destilovanou vodou alebo rozto-kom chloridu sodného v destilovanej apy-rogénnej vodě o koncentrácii do S0 g naliter, pri teplote 0 °C až -j-6 °C pri pH 4,0 až8,0.
3. 3. Spósob přípravy podlá bodu 1 vyznaču-júci sa tým, že oddelovanie nízkomolekulár-nych látok sa prevedie pomocou gélovejfi trácie, dialýzy, ultrafiltrácie a diafiltrá-cie.
4. 4. Spůsob přípravy podlá bodu 1 vyznaču-júci sa tým, že ako materiál z ktorého safrakcia obsahujúca gamaglobulín izoluje sapoužije savčia zvieracia normálna alebohyperimunná plazma připadne normálně,retroplacentárné alebo hyperimunné sérums definovanou antibakteriálnou, antitoxic-kou alebo antivirovou protilátkovou akti-vitou.