CS255259B1 - Způsob získávání genotypů embryí pienice - Google Patents

Abstract

Řešení se týká způsobu získávání genotypů embryí pšenice pomocí bílkovin ­ ných - gliadinových markérů, což umožňuje získání žádaných potomstev rostlin ve šlechtitelské praxi. Způsob výroby pod ­ statně zkracuje dobu mezi vývojem nové odrůdy pšenice a zavedením odrůdy do praxe.

Description

Předmětem vynálezu je způsob získávání genotypů embryí pšenice bílkovinnými-gliadinovými markéry k určení, rozlišení a využití homozygotních a heterozygotních genotypů u hybridizáčních programů, v programech mutačních šlechtění a při výběru z odrůd - populací pšenice.

K tvorbě nových výkonnějších a jakostnějších odrůd pšenice se využívá především metody kříženi, umožňující vhodně kombinovat stávající genetické dispozice rodičovských forem.

Pokud nejsou k dispozici žádané genetické zdroje, vyvolávají se v procesu mutačního šlechtění. Cenné genetické zdroje, pro potřebu hybridizačního programu, lze získat vyčleněním žádaných genů výběrem z odrůd- populací. Výběrové postupy dosud používané ve šlechtění obilovin jsou založeny na fenotapovém výběru rostlin generace F 2 a na prověrce jejich semenného potomstva v následných generacích F 3 až F 7. Kvantitativní vlastnosti, např. pekařská jakost pšenice, mrazuvzdornost aj. se v této počáteční fázi šlechtění, tj. generacích F 2 až F 3 nedají hodnotit. Tyto vlastnosti lze určit pouze v pozdějších generacích na základě víceletých zkoušek a na více lokalitách. Současný způsob výběru a hodnocení šlechtitelských materiálů neumožňuje rozlišit v ranných etapách šlechtitelského procesu, tj. v generaci F2 nebo F 3 homozygotní nebo heterozygotní genotypy. Geneticky stabilizované linie se stabilizovanými hospořářskými vlastnostmi poskytují pouze homozygotní genotyp. Při současném způsobu výběrU'je jejich zjištění a potvrzení až F 8. Tento způsob neumožňuje výběr žádaných genotypů, tj. rekombinantů, mutantů v první štěpící generaci ani jejich urychlené rozmnožování např. ve skleníku. Stávající systém výběru a hodnocení šlechtitelských materiálů umožňuje proto vytvoření a povolení odrůdy v časovém rozpětí 10 až 15 let. Zmíněný způsob se vyznačuje vysokou spotřebou energií, se značnou náročností na pracovní síly a větší plošnou výměru na pokusnou plochu.

Uvedené nevýhody jsou v podstatné míře odstraněny způsobem výroby genotypů pšenice bílkovinnými - gliadinovými markéry, jehož podstata spočívá v tom, že obilky získané ze štěpících populací se mechanicky rozdělí na část embryonální a část endospermální. Část embryonální tvoří z celé obilky 25 až 45 %. Obě části se shodně označí. Všechny endospermální části rozdělených obilek se elektroforeticky testují pomocí bílkovinných - gliadinových markérů a z nich se vybírají pouze homozygotní genotypy se žádanými markerovými znaky. Příslušné embryonální části se za účelem získání potomstva kultivují při teplotách 18 až 22 °C, inte^ivě umělého osvětleni 8 000 až 12 000 luxů po dobu 8 až 12 dnů v aseptických podmínkách při použití 0,5 až 2 % fungicidu a 1 až 10 % protiplisňový a protibakterálni roztok antibiotik.

Způsob výroby genotypů embryi obilovin bílkovinnými markéry podle vynálezu přináší řadu výhod z nichž nejpodstatnější spočívá v tom, že umožňuje nahradit nevyhovující stávající způsoby výběru rostlin podle fenotypu výběrem embryií podle genotypu. To znamená, že pomocí elektroforezou získaných bílkovinných - gliadinových markérů lze elektroforeticky rozlišit homozygotní a heterozygotní genotypy již v první štěpící generaci. Tlm lze již na počátku šlchtitelského procesu vybrat a urychleně vyrobit požadované rekombinace, transgrese a mutace. Další výhodou způsobu podle vynálezu je skutečnost, že geneticky určená embrya podle bílkovinných - gliadinových markérů umožňují výběr homozygotních genotypů již v první štěpící generaci, což intenzifikuje tvorbu odrůdy. Způsob podle vynálezu umožňuje při stejných hodnotách rodičovských forem markerových vlastností jako je pekařská jakost, nebo mrazuvzdornost, stanovit zda genetická determinance u rodičů je stejná nebo odlišná. V případě <' odlišné genetické výbavy lze záměrně křížením a výběrem v hybridním potomstvu získat linii s vyšší hodnotou znaků. Analogicky lze vybrat vhodně kombinující rodiče, doplňující se ve vlastnostech značených bílkovinnými-gliadinovými markéry. Tak lze záměrně kombinovat v hydbridním potomstvu pšenice rezistenci k mrazu s vyšší pekařskou jakostí. Značnou výhodou je možnost posouzeni kvantitativních znaků jako např. pekařská jakost podle gliadinového spektra jedné obilky v generaci F 2. Nespornou výhodou je možnost posuzování šlechtitelského materiálu z hlediska poznatků molekulární genetiky, což intenzifikuje šlechtitelský proces.

Příklad 1

K získání homozygotních hybridních linií pomocí vynálezu byla použita generace B.C.1-F2 kombinace SLAVIA/2 x ODÉSKA - JA 16. Celkem bylo hodnoceno 1 450 zrn v plné zralosti generace B.C.1-F2. Zrna byla rozdělena příčným řezem na embryonální a endospermální části. Endospermální části zrn byly použity k elektroforetické analýze gliadinů ve škrobovém gelu. Zjištěná gliadinová spektra byla použita k určení homo a heterozygotního stavu gliadinových bloků 1A1-1A2, 1B1-1B4, 1D1-1D5, 6A1-6A3, 6B1-6B2 a 6D1-6DN1. Z analyzových 1 450 endospermálních částí zrn generace B.C.1-F2 bylo vyloučeno 1 175 zrn, heterozygotních ve většině gliadinových bloků, tj. celkem 81,03 % jedinců štěpicí populace. Vybrané homozygotní, embryonální části 275 zrn byly skladovány při teplotě 5 °C po dobu 1 až 3 měsíců a dále kultivována v aseptických podmínkách s přidáním růstových stimulátorů při teplotě 20 °C při umělém osvětlení s intenzitou 10 000 luxů po dobu 10 dnů. Naklíčené rostliny byly jarovizovány na světle při intenzitě světla 10 000 luxů v jarovizační komoře při teplotě 5 °C po dobu 42 dnů. Jarovizované rostliny byly vysazeny do pole s kořenovými bály. v generaci B.C.1-F3 byla vybrány podle gliadinových bloků-markerů celkem 64 genotypy, rostliny homozygotní ve většině gliadinových bloků. Kupříkladu v gliadinovém bloku - markéru vysoké pekařské jakosti 1B1 bylo získáno ze 180 sklizených rostlin generace B.C.1-F3 celkem 39 rostlin (homozygotních v daném bloku). V následné generaci B.C.1-F4 byla,opakovaně stanovena gliadinová spektra získaných homozygotních linií. V 33 případech z hodnocených 39 linií byla prokázána identita homozygotní konstituce gliadinového bloku 1B1 rostlin generace B.C.1-F3 a jejich potomstev B.C.1-F4. Homozygotní konstituce bloku 1B1 byla tak potvrzena 84,60 %. Současně bylo identifikováno 22 rostliny generace B.C.1-F3 homozygotních v alternujícím gliadinovém bloku - markéru nižší pekařské jakosti 1B4. V generaci B.C.1-F4 byla potvrzena identita homozygotní konstituce bloku 1B4 u 19 potomstev tj. v 86,36 % analyzovaných linií. V generaci B.C.1-F3 byly rovněž zjištěny 2 rostliny heterozygotní s genotypem 1B1/1B4. Zmíněná heterozygotnost byla potvrzena v potomstvu B.C.-F4 obou zmíněných linií. Celková identita mohozygotních _y a heterozygotních konstitucí bloků 1B1, 1B4 a 1B1/1B4 obou sledovaných generacích B.C.1-F3 a B.C.1-F4 byla zjištěna u 60 linií z celkového počtu 64 linií, tj. dosáhla 93,75 %. Z celkového počtu 384 alelických gliadinových bloků, zjištěných u vybraných 64 linií generace B.C.1-F3 byla potvrzena identita genetické konstituce analyzovaných bloků /1A1-1A2, 1B1-1B4, 1D1-1D5, 6A1-6A3, 6B1-6B2 a 6D1-6DN1/ v generaci B.C.1-F4 a 306 bloků, tj. v 79,69 %. Použitím vynálezu bylo tak dosaženo v štěpicí generaci B.C.1-F2 úspor na rozsahu analýz, potřeby pracovních sil, materiálové krytí atd.

Příklad 2

K zjištění heterogenity odrůd pšenice typu syntetických populací a k zjištění heteroge-: nity nových šlechtění v procesu jejich udržovacího šlechtění byla použita jako model jugoslávská odrůda pšenice SUPER ZLATNA. Podle vynálezu bylo analyzováno 300 zrn, odebraných ze 75 typových rostlin introdukované odrůdy SUPER ZLATNA ze sklizně 1982 na StOZ OKZOZ Sedlec u Prahy. Bylo zjištěno, že introdukované odrůda SUPER ZLATNA představuje složitou syntetickou populaci, skládající se z 10 odlišných homozygotních linií a z 6,70 % heterozygotních jedinců. Analyzovaná odrůda byla heterogenní v genu lid 1A, kde bylo zjištěno 6 různých alelických gliadinových bloků, v genech Gld 1B, Gld ID a Gld 6B, kde bylo zjištěno po 3 odlišných alelických gliadinových blocích. V genu 6D byly zjištěny 2 gliadinové alelické bloky a v genu 6A pouze 1 alelický gliadinový blok. Ve vyčleněných souborech gliadinových alelických bloků byly zjištěny hospodářsky významné bloky-markery vyšší pekařské jakosti (1B1), vyšší mrazuvzdornosti (1A2, 6D2) a odolnosti ke rzi travní žitného typu (1B3). Jedna ze zjištěných linií nese gliadinový blok - markér vyšší pekařské jakosti 1B1, čtyři linie nesou gliadinové bloky - markéry vyšší mrazuvzdornosti 1A2, 6D2 a dvě linie jsou vybaveny gliadinovým blokem - markérem odolnosti ke rzi travní žitného typu 1B3. U analyzovaných heterozygotních zrn byly zjištěny další významné gliadinové bloky - markéry vyšší mrazuvzdornosti, t j. 1D5 a 1A1. Tyto genotypy lze převést do homozygotniho stavu v další štěpicí generaci pomocí vynálezu (viz přiklad 1). Analýza struktury syntetické populace odrůdy SUPER ZLATNA pomocí vynálezu ná jednotlivá homozygotní linie, genotypy umožňuje racionální využití jednotlivých homozygotních linií této odrůdy jako genetických zdrojů vyšší pekařské jakosti či lepší mrazuvzdornosti nebo odolnosti ke rzi travní žitného typu, respektive ke rzi pšeničné v hybridizačních programech. Metoda tak umožňuje zvýšit účinnost hybridizace až lOnásobně.

Přiklad 3

Při gliadinovou analýzu jsou obilky půleny na část endospermální, která je použita k elektroforetické analýze a část embryonální, ze které jsou vypěstovány rostliny s vhodnými vlastnostmi. Ve statisticky hodnotitelných pokusech byly porovnány klíční rostliny vyrostlé z poloviny a celých obilek u odrůdy Grana, Vala, UR 750, Mironovská a Jara.

Výsledky byly následující:

e.	Varianta	Délka listu v mm	Rozdíl průměrů
1.	Grana-polov. obilky	43,2
2.	Grana-celá obříka	29,0	14,2
3.	Vala - polov, obilky	47,5
4.	Vala - celá obilka	38,0	9,5
5.	UH 750 - polov, obilky	50,8
6.	UH 750 - celá obilka	42,3	8,5
7.	Mironovská - polov, obilky	52,5
8.	Mironovská - celá obilka	52,1	0,4
9.	Jara - polov, obilky	43,6
10.	Jara - celá obilka	41,0	2,6

Bylo zjištěno, že v žádném případě není negativně ovlivněn růst klíčních rostlin rozdělením obilky na dvě části, ale že u některých odrůd dochází ke stimulaci růstu. Ke zhoršení klíčivosti dochází při delším skladování v nevhodných podmínkách.

Přikládá

Při ověřování aseptických podmínek uvedeného způsobu výroby podle vynálezu bylo použito 0,5procentního roztoku 1-(4-chlorfenoxy)-3,3-dimethyl-l- 1,2,4-triazol-l-yl -2-butanonu a 2% roztoku Ampicilinu a Nystativa bylo zjištěno, že úhyn kultivovaných embryí a rostlin byl do 15 % sledovaného souboru v ojedinělém případě, při nedodržení techniky přesazování rostlin činil úhyn rostlin 34,54 %. Při nedodržení výše uvedených aseptických podmínek dochází nejméně k 95% úhynu embryí a rostlin následkem jejich zničení bakteriálními a houbovými kulturami. Při kultivaci embryí in vitro bylo dosaženo v pokusech prováděných ve VŮRV Ruzyně, kde aseptické podmínky byly zajištěny sterilací obilek běžnými technikami, úhyn kultivovaných embryí nepřesahoval 10 % sledovaného souboru.

Claims (1)

1. Způsob získáváni genotypů embryí pšenice vyznačující se tím, že obilky štěpících ' populací se mechanicky rozdělí na část embryonální a část endospermální, přičemž část embryonální tvoří 10 % až 45 % části všech rozdělených obilek se elektroforetioky testují pomocí bílkovinných - gliadinových markérů a vybírají se pouze homozygotní'genotypy se žádanými markerovanými znaky, k nim příslušné embryonální části se kultivuji in vitro nebo in vivo při teplotách 18 až 22 °C po dobu 8 až 12 dní v aseptických podmínkách při použití roztoku 0,5 až 2 % objem, fungicidu a 1 % až 10 % objem, protiplísňových a protibakteriálnich antibio tik.