CS255259B1

CS255259B1 - A method of obtaining genotype embryos of pomegranate

Info

Publication number: CS255259B1
Application number: CS849516A
Authority: CS
Inventors: Antonin Sasek; Jiri Cerny; Josef Dostal; Alena Hanisova
Original assignee: Antonin Sasek; Jiri Cerny; Josef Dostal; Alena Hanisova
Priority date: 1984-12-07
Filing date: 1984-12-07
Publication date: 1988-02-15
Also published as: CS951684A1

Abstract

Řešení se týká způsobu získávání genotypů embryí pšenice pomocí bílkovin ných - gliadinových markérů, což umožňuje získání žádaných potomstev rostlin ve šlechtitelské praxi. Způsob výroby pod statně zkracuje dobu mezi vývojem nové odrůdy pšenice a zavedením odrůdy do praxe.The solution concerns a method of obtaining wheat embryo genotypes using protein-gliadin markers, which enables obtaining desired plant progeny in breeding practice. The production method significantly shortens the time between the development of a new wheat variety and its introduction into practice.

Description

Předmětem vynálezu je způsob získávání genotypů embryí pšenice bílkovinnými-gliadinovými markéry k určení, rozlišení a využití homozygotních a heterozygotních genotypů u hybridizáčních programů, v programech mutačních šlechtění a při výběru z odrůd - populací pšenice.The subject of the invention is a method of obtaining wheat embryo genotypes with protein-gliadin markers for determining, distinguishing and using homozygous and heterozygous genotypes in hybridization programs, mutation breeding programs and in selection from wheat varieties - populations.

K tvorbě nových výkonnějších a jakostnějších odrůd pšenice se využívá především metody kříženi, umožňující vhodně kombinovat stávající genetické dispozice rodičovských forem.To create new, more efficient and higher quality wheat varieties, the main method used is crossbreeding, which allows for the appropriate combination of existing genetic dispositions of parental forms.

Pokud nejsou k dispozici žádané genetické zdroje, vyvolávají se v procesu mutačního šlechtění. Cenné genetické zdroje, pro potřebu hybridizačního programu, lze získat vyčleněním žádaných genů výběrem z odrůd- populací. Výběrové postupy dosud používané ve šlechtění obilovin jsou založeny na fenotapovém výběru rostlin generace F 2 a na prověrce jejich semenného potomstva v následných generacích F 3 až F 7. Kvantitativní vlastnosti, např. pekařská jakost pšenice, mrazuvzdornost aj. se v této počáteční fázi šlechtění, tj. generacích F 2 až F 3 nedají hodnotit. Tyto vlastnosti lze určit pouze v pozdějších generacích na základě víceletých zkoušek a na více lokalitách. Současný způsob výběru a hodnocení šlechtitelských materiálů neumožňuje rozlišit v ranných etapách šlechtitelského procesu, tj. v generaci F2 nebo F 3 homozygotní nebo heterozygotní genotypy. Geneticky stabilizované linie se stabilizovanými hospořářskými vlastnostmi poskytují pouze homozygotní genotyp. Při současném způsobu výběrU'je jejich zjištění a potvrzení až F 8. Tento způsob neumožňuje výběr žádaných genotypů, tj. rekombinantů, mutantů v první štěpící generaci ani jejich urychlené rozmnožování např. ve skleníku. Stávající systém výběru a hodnocení šlechtitelských materiálů umožňuje proto vytvoření a povolení odrůdy v časovém rozpětí 10 až 15 let. Zmíněný způsob se vyznačuje vysokou spotřebou energií, se značnou náročností na pracovní síly a větší plošnou výměru na pokusnou plochu.If the desired genetic resources are not available, they are generated in the process of mutation breeding. Valuable genetic resources, for the needs of a hybridization program, can be obtained by isolating the desired genes by selecting from varieties-populations. Selection procedures used so far in cereal breeding are based on phenotypic selection of plants of the F 2 generation and on the screening of their seed progeny in the subsequent F 3 to F 7 generations. Quantitative properties, e.g. baking quality of wheat, frost resistance, etc., cannot be evaluated in this initial stage of breeding, i.e. in the F 2 to F 3 generations. These properties can only be determined in later generations on the basis of multi-year trials and in multiple locations. The current method of selecting and evaluating breeding materials does not allow distinguishing homozygous or heterozygous genotypes in the early stages of the breeding process, i.e. in the F2 or F 3 generation. Genetically stabilized lines with stabilized economic properties provide only the homozygous genotype. With the current selection method, their detection and confirmation is limited to F 8. This method does not allow the selection of desired genotypes, i.e. recombinants, mutants in the first splitting generation, nor their accelerated reproduction, e.g. in a greenhouse. The existing system of selection and evaluation of breeding materials therefore allows the creation and approval of a variety within a time span of 10 to 15 years. The mentioned method is characterized by high energy consumption, considerable labor intensity and a larger area per experimental area.

Uvedené nevýhody jsou v podstatné míře odstraněny způsobem výroby genotypů pšenice bílkovinnými - gliadinovými markéry, jehož podstata spočívá v tom, že obilky získané ze štěpících populací se mechanicky rozdělí na část embryonální a část endospermální. Část embryonální tvoří z celé obilky 25 až 45 %. Obě části se shodně označí. Všechny endospermální části rozdělených obilek se elektroforeticky testují pomocí bílkovinných - gliadinových markérů a z nich se vybírají pouze homozygotní genotypy se žádanými markerovými znaky. Příslušné embryonální části se za účelem získání potomstva kultivují při teplotách 18 až 22 °C, inte^ivě umělého osvětleni 8 000 až 12 000 luxů po dobu 8 až 12 dnů v aseptických podmínkách při použití 0,5 až 2 % fungicidu a 1 až 10 % protiplisňový a protibakterálni roztok antibiotik.The above disadvantages are largely eliminated by the method of producing wheat genotypes with protein-gliadin markers, the essence of which is that grains obtained from splitting populations are mechanically divided into an embryonic part and an endospermic part. The embryonic part makes up 25 to 45% of the whole grain. Both parts are marked identically. All endospermic parts of the divided grains are electrophoretically tested using protein-gliadin markers and only homozygous genotypes with the desired marker characters are selected from them. In order to obtain offspring, the relevant embryonic parts are cultivated at temperatures of 18 to 22 °C, intensive artificial lighting of 8,000 to 12,000 lux for 8 to 12 days in aseptic conditions using 0.5 to 2% fungicide and 1 to 10% antifungal and antibacterial antibiotic solution.

Způsob výroby genotypů embryi obilovin bílkovinnými markéry podle vynálezu přináší řadu výhod z nichž nejpodstatnější spočívá v tom, že umožňuje nahradit nevyhovující stávající způsoby výběru rostlin podle fenotypu výběrem embryií podle genotypu. To znamená, že pomocí elektroforezou získaných bílkovinných - gliadinových markérů lze elektroforeticky rozlišit homozygotní a heterozygotní genotypy již v první štěpící generaci. Tlm lze již na počátku šlchtitelského procesu vybrat a urychleně vyrobit požadované rekombinace, transgrese a mutace. Další výhodou způsobu podle vynálezu je skutečnost, že geneticky určená embrya podle bílkovinných - gliadinových markérů umožňují výběr homozygotních genotypů již v první štěpící generaci, což intenzifikuje tvorbu odrůdy. Způsob podle vynálezu umožňuje při stejných hodnotách rodičovských forem markerových vlastností jako je pekařská jakost, nebo mrazuvzdornost, stanovit zda genetická determinance u rodičů je stejná nebo odlišná. V případě <' odlišné genetické výbavy lze záměrně křížením a výběrem v hybridním potomstvu získat linii s vyšší hodnotou znaků. Analogicky lze vybrat vhodně kombinující rodiče, doplňující se ve vlastnostech značených bílkovinnými-gliadinovými markéry. Tak lze záměrně kombinovat v hydbridním potomstvu pšenice rezistenci k mrazu s vyšší pekařskou jakostí. Značnou výhodou je možnost posouzeni kvantitativních znaků jako např. pekařská jakost podle gliadinového spektra jedné obilky v generaci F 2. Nespornou výhodou je možnost posuzování šlechtitelského materiálu z hlediska poznatků molekulární genetiky, což intenzifikuje šlechtitelský proces.The method of producing genotypes of cereal embryos with protein markers according to the invention brings a number of advantages, the most significant of which is that it allows replacing the unsatisfactory existing methods of selecting plants by phenotype with selecting embryos by genotype. This means that using protein - gliadin markers obtained by electrophoresis, homozygous and heterozygous genotypes can be electrophoretically distinguished already in the first splitting generation. Tlm can be selected at the beginning of the breeding process and the required recombination, transgression and mutation can be rapidly produced. Another advantage of the method according to the invention is the fact that genetically determined embryos according to protein - gliadin markers allow the selection of homozygous genotypes already in the first splitting generation, which intensifies the creation of a variety. The method according to the invention allows, with the same values of the parental forms of marker properties such as baking quality or frost resistance, to determine whether the genetic determination in the parents is the same or different. In the case of <' different genetic makeup, a line with a higher trait value can be obtained by intentionally crossing and selecting in the hybrid offspring. Similarly, suitably combining parents can be selected, complementing each other in the traits marked by protein-gliadin markers. Thus, frost resistance can be intentionally combined with higher baking quality in the hybrid offspring of wheat. A significant advantage is the possibility of assessing quantitative traits such as baking quality according to the gliadin spectrum of one grain in the F 2 generation. An indisputable advantage is the possibility of assessing breeding material from the point of view of molecular genetics, which intensifies the breeding process.

Příklad 1Example 1

K získání homozygotních hybridních linií pomocí vynálezu byla použita generace B.C.1-F2 kombinace SLAVIA/2 x ODÉSKA - JA 16. Celkem bylo hodnoceno 1 450 zrn v plné zralosti generace B.C.1-F2. Zrna byla rozdělena příčným řezem na embryonální a endospermální části. Endospermální části zrn byly použity k elektroforetické analýze gliadinů ve škrobovém gelu. Zjištěná gliadinová spektra byla použita k určení homo a heterozygotního stavu gliadinových bloků 1A1-1A2, 1B1-1B4, 1D1-1D5, 6A1-6A3, 6B1-6B2 a 6D1-6DN1. Z analyzových 1 450 endospermálních částí zrn generace B.C.1-F2 bylo vyloučeno 1 175 zrn, heterozygotních ve většině gliadinových bloků, tj. celkem 81,03 % jedinců štěpicí populace. Vybrané homozygotní, embryonální části 275 zrn byly skladovány při teplotě 5 °C po dobu 1 až 3 měsíců a dále kultivována v aseptických podmínkách s přidáním růstových stimulátorů při teplotě 20 °C při umělém osvětlení s intenzitou 10 000 luxů po dobu 10 dnů. Naklíčené rostliny byly jarovizovány na světle při intenzitě světla 10 000 luxů v jarovizační komoře při teplotě 5 °C po dobu 42 dnů. Jarovizované rostliny byly vysazeny do pole s kořenovými bály. v generaci B.C.1-F3 byla vybrány podle gliadinových bloků-markerů celkem 64 genotypy, rostliny homozygotní ve většině gliadinových bloků. Kupříkladu v gliadinovém bloku - markéru vysoké pekařské jakosti 1B1 bylo získáno ze 180 sklizených rostlin generace B.C.1-F3 celkem 39 rostlin (homozygotních v daném bloku). V následné generaci B.C.1-F4 byla,opakovaně stanovena gliadinová spektra získaných homozygotních linií. V 33 případech z hodnocených 39 linií byla prokázána identita homozygotní konstituce gliadinového bloku 1B1 rostlin generace B.C.1-F3 a jejich potomstev B.C.1-F4. Homozygotní konstituce bloku 1B1 byla tak potvrzena 84,60 %. Současně bylo identifikováno 22 rostliny generace B.C.1-F3 homozygotních v alternujícím gliadinovém bloku - markéru nižší pekařské jakosti 1B4. V generaci B.C.1-F4 byla potvrzena identita homozygotní konstituce bloku 1B4 u 19 potomstev tj. v 86,36 % analyzovaných linií. V generaci B.C.1-F3 byly rovněž zjištěny 2 rostliny heterozygotní s genotypem 1B1/1B4. Zmíněná heterozygotnost byla potvrzena v potomstvu B.C.-F4 obou zmíněných linií. Celková identita mohozygotních _y a heterozygotních konstitucí bloků 1B1, 1B4 a 1B1/1B4 obou sledovaných generacích B.C.1-F3 a B.C.1-F4 byla zjištěna u 60 linií z celkového počtu 64 linií, tj. dosáhla 93,75 %. Z celkového počtu 384 alelických gliadinových bloků, zjištěných u vybraných 64 linií generace B.C.1-F3 byla potvrzena identita genetické konstituce analyzovaných bloků /1A1-1A2, 1B1-1B4, 1D1-1D5, 6A1-6A3, 6B1-6B2 a 6D1-6DN1/ v generaci B.C.1-F4 a 306 bloků, tj. v 79,69 %. Použitím vynálezu bylo tak dosaženo v štěpicí generaci B.C.1-F2 úspor na rozsahu analýz, potřeby pracovních sil, materiálové krytí atd.To obtain homozygous hybrid lines using the invention, the BC1-F2 generation of the combination SLAVIA/2 x ODESKA - JA 16 was used. A total of 1,450 grains at full maturity of the BC1-F2 generation were evaluated. The grains were divided by cross-section into embryonic and endospermal parts. The endospermal parts of the grains were used for electrophoretic analysis of gliadins in starch gel. The determined gliadin spectra were used to determine the homo and heterozygous state of gliadin blocks 1A1-1A2, 1B1-1B4, 1D1-1D5, 6A1-6A3, 6B1-6B2 and 6D1-6DN1. From the analyzed 1,450 endospermal parts of grains of the BC1-F2 generation, 1,175 grains were excluded, heterozygous in most of the gliadin blocks, i.e. a total of 81.03% of the individuals of the splitting population. Selected homozygous, embryonic parts of 275 grains were stored at 5 °C for 1 to 3 months and further cultivated under aseptic conditions with the addition of growth stimulants at 20 °C under artificial lighting with an intensity of 10,000 lux for 10 days. The germinated plants were vernalized in light at a light intensity of 10,000 lux in a vernalization chamber at 5 °C for 42 days. Vernalized plants were planted in the field with root balls. In the BC1-F3 generation, a total of 64 genotypes were selected according to gliadin blocks-markers, plants homozygous in most gliadin blocks. For example, in the gliadin block - marker of high baking quality 1B1, a total of 39 plants (homozygous in a given block) were obtained from 180 harvested plants of the BC1-F3 generation. In the subsequent BC1-F4 generation, the gliadin spectra of the obtained homozygous lines were repeatedly determined. In 33 cases out of the 39 lines evaluated, the identity of the homozygous constitution of the gliadin block 1B1 of the BC1-F3 generation plants and their BC1-F4 progeny was proven. The homozygous constitution of the 1B1 block was thus confirmed in 84.60%. At the same time, 22 plants of the BC1-F3 generation homozygous in the alternating gliadin block - a marker of lower baking quality 1B4 - were identified. In the BC1-F4 generation, the identity of the homozygous constitution of the 1B4 block was confirmed in 19 progeny, i.e. in 86.36% of the analyzed lines. In the BC1-F3 generation, 2 heterozygous plants with the 1B1/1B4 genotype were also found. The mentioned heterozygosity was confirmed in the BC-F4 progeny of both mentioned lines. The overall identity of the homozygous _and heterozygous constitutions of blocks 1B1, 1B4 and 1B1/1B4 in both BC1-F3 and BC1-F4 generations was found in 60 lines out of a total of 64 lines, i.e. it reached 93.75%. Out of a total of 384 allelic gliadin blocks found in selected 64 lines of the BC1-F3 generation, the identity of the genetic constitution of the analyzed blocks /1A1-1A2, 1B1-1B4, 1D1-1D5, 6A1-6A3, 6B1-6B2 and 6D1-6DN1/ in the BC1-F4 generation and 306 blocks, i.e. in 79.69%, was confirmed. The use of the invention thus achieved savings in the scope of analyses, labor needs, material coverage, etc. in the BC1-F2 cleavage generation.

Příklad 2Example 2

K zjištění heterogenity odrůd pšenice typu syntetických populací a k zjištění heteroge-: nity nových šlechtění v procesu jejich udržovacího šlechtění byla použita jako model jugoslávská odrůda pšenice SUPER ZLATNA. Podle vynálezu bylo analyzováno 300 zrn, odebraných ze 75 typových rostlin introdukované odrůdy SUPER ZLATNA ze sklizně 1982 na StOZ OKZOZ Sedlec u Prahy. Bylo zjištěno, že introdukované odrůda SUPER ZLATNA představuje složitou syntetickou populaci, skládající se z 10 odlišných homozygotních linií a z 6,70 % heterozygotních jedinců. Analyzovaná odrůda byla heterogenní v genu lid 1A, kde bylo zjištěno 6 různých alelických gliadinových bloků, v genech Gld 1B, Gld ID a Gld 6B, kde bylo zjištěno po 3 odlišných alelických gliadinových blocích. V genu 6D byly zjištěny 2 gliadinové alelické bloky a v genu 6A pouze 1 alelický gliadinový blok. Ve vyčleněných souborech gliadinových alelických bloků byly zjištěny hospodářsky významné bloky-markery vyšší pekařské jakosti (1B1), vyšší mrazuvzdornosti (1A2, 6D2) a odolnosti ke rzi travní žitného typu (1B3). Jedna ze zjištěných linií nese gliadinový blok - markér vyšší pekařské jakosti 1B1, čtyři linie nesou gliadinové bloky - markéry vyšší mrazuvzdornosti 1A2, 6D2 a dvě linie jsou vybaveny gliadinovým blokem - markérem odolnosti ke rzi travní žitného typu 1B3. U analyzovaných heterozygotních zrn byly zjištěny další významné gliadinové bloky - markéry vyšší mrazuvzdornosti, t j. 1D5 a 1A1. Tyto genotypy lze převést do homozygotniho stavu v další štěpicí generaci pomocí vynálezu (viz přiklad 1). Analýza struktury syntetické populace odrůdy SUPER ZLATNA pomocí vynálezu ná jednotlivá homozygotní linie, genotypy umožňuje racionální využití jednotlivých homozygotních linií této odrůdy jako genetických zdrojů vyšší pekařské jakosti či lepší mrazuvzdornosti nebo odolnosti ke rzi travní žitného typu, respektive ke rzi pšeničné v hybridizačních programech. Metoda tak umožňuje zvýšit účinnost hybridizace až lOnásobně.To determine the heterogeneity of wheat varieties of the synthetic population type and to determine the heterogeneity of new breeding in the process of their maintenance breeding, the Yugoslav wheat variety SUPER ZLATNA was used as a model. According to the invention, 300 grains were analyzed, taken from 75 type plants of the introduced variety SUPER ZLATNA from the 1982 harvest at the StOZ OKZOZ Sedlec near Prague. It was found that the introduced variety SUPER ZLATNA represents a complex synthetic population, consisting of 10 different homozygous lines and 6.70% heterozygous individuals. The analyzed variety was heterogeneous in the gene lid 1A, where 6 different allelic gliadin blocks were found, in the genes Gld 1B, Gld ID and Gld 6B, where 3 different allelic gliadin blocks were found each. In the 6D gene, 2 gliadin allelic blocks were detected and in the 6A gene, only 1 allelic gliadin block was detected. In the separated sets of gliadin allelic blocks, economically significant blocks-markers of higher baking quality (1B1), higher frost resistance (1A2, 6D2) and resistance to ryegrass rust of the ryegrass type (1B3) were detected. One of the detected lines carries the gliadin block - marker of higher baking quality 1B1, four lines carry gliadin blocks - markers of higher frost resistance 1A2, 6D2 and two lines are equipped with a gliadin block - marker of resistance to ryegrass rust of the ryegrass type 1B3. In the analyzed heterozygous grains, other significant gliadin blocks - markers of higher frost resistance were detected, i.e. 1D5 and 1A1. These genotypes can be converted to a homozygous state in the next splitting generation using the invention (see example 1). Analysis of the structure of the synthetic population of the SUPER ZLATNA variety using the invention of individual homozygous lines, genotypes allows for the rational use of individual homozygous lines of this variety as genetic sources of higher baking quality or better frost resistance or resistance to rye grass rust, or to wheat rust in hybridization programs. The method thus allows for an increase in the efficiency of hybridization up to 10-fold.

Přiklad 3Example 3

Při gliadinovou analýzu jsou obilky půleny na část endospermální, která je použita k elektroforetické analýze a část embryonální, ze které jsou vypěstovány rostliny s vhodnými vlastnostmi. Ve statisticky hodnotitelných pokusech byly porovnány klíční rostliny vyrostlé z poloviny a celých obilek u odrůdy Grana, Vala, UR 750, Mironovská a Jara.In gliadin analysis, the grains are halved into the endosperm part, which is used for electrophoretic analysis, and the embryonic part, from which plants with suitable properties are grown. In statistically evaluable experiments, germinated plants grown from half and whole grains of the varieties Grana, Vala, UR 750, Mironovská and Jara were compared.

Výsledky byly následující:The results were as follows:

e. e. Varianta Variant Délka listu v mm Leaf length in mm Rozdíl průměrů Difference of diameters 1. 1. Grana-polov. obilky Grana-half grains 43,2 43.2 2. 2. Grana-celá obříka Grana-whole giant 29,0 29.0 14,2 14.2 3. 3. Vala - polov, obilky Vala - halves, grains 47,5 47.5 4. 4. Vala - celá obilka Vala - whole grain 38,0 38.0 9,5 9.5 5. 5. UH 750 - polov, obilky UH 750 - halves, grains 50,8 50.8 6. 6. UH 750 - celá obilka UH 750 - whole grain 42,3 42.3 8,5 8.5 7. 7. Mironovská - polov, obilky Mironovská - halves, grains 52,5 52.5 8. 8. Mironovská - celá obilka Mironovská - whole grain 52,1 52.1 0,4 0.4 9. 9. Jara - polov, obilky Spring - half, grains 43,6 43.6 10. 10. Jara - celá obilka Spring - the whole grain 41,0 41.0 2,6 2.6

Bylo zjištěno, že v žádném případě není negativně ovlivněn růst klíčních rostlin rozdělením obilky na dvě části, ale že u některých odrůd dochází ke stimulaci růstu. Ke zhoršení klíčivosti dochází při delším skladování v nevhodných podmínkách.It was found that the growth of sprouts is not negatively affected by dividing the seed into two parts, but that in some varieties growth is stimulated. Germination deteriorates with prolonged storage in unsuitable conditions.

PřikládáAttached

Při ověřování aseptických podmínek uvedeného způsobu výroby podle vynálezu bylo použito 0,5procentního roztoku 1-(4-chlorfenoxy)-3,3-dimethyl-l- 1,2,4-triazol-l-yl -2-butanonu a 2% roztoku Ampicilinu a Nystativa bylo zjištěno, že úhyn kultivovaných embryí a rostlin byl do 15 % sledovaného souboru v ojedinělém případě, při nedodržení techniky přesazování rostlin činil úhyn rostlin 34,54 %. Při nedodržení výše uvedených aseptických podmínek dochází nejméně k 95% úhynu embryí a rostlin následkem jejich zničení bakteriálními a houbovými kulturami. Při kultivaci embryí in vitro bylo dosaženo v pokusech prováděných ve VŮRV Ruzyně, kde aseptické podmínky byly zajištěny sterilací obilek běžnými technikami, úhyn kultivovaných embryí nepřesahoval 10 % sledovaného souboru.When verifying the aseptic conditions of the above-mentioned production method according to the invention, a 0.5% solution of 1-(4-chlorophenoxy)-3,3-dimethyl-1- 1,2,4-triazol-1-yl -2-butanone and a 2% solution of Ampicillin and Nystat were used, it was found that the death of cultured embryos and plants was up to 15% of the monitored set in a rare case, when the plant transplanting technique was not followed, the death of plants was 34.54%. When the above-mentioned aseptic conditions are not followed, at least 95% of the embryos and plants die as a result of their destruction by bacterial and fungal cultures. When cultivating embryos in vitro, it was achieved in experiments carried out at VŮRV Ruzyně, where aseptic conditions were ensured by sterilization of grains using conventional techniques, the death of cultured embryos did not exceed 10% of the monitored set.

Claims

A method for obtaining wheat embryo genotypes, characterized in that the caryopses of the digesting populations are mechanically separated into an embryonic portion and an endospermal portion, wherein the embryonic portion constitutes 10% to 45% of all broken caryopses are electrophoretic tested by protein gliadin markers and selected homozygous genotypes with the desired markers, the respective embryonic portions of which are cultured in vitro or in vivo at 18 to 22 ° C for 8 to 12 days under aseptic conditions using a solution of 0.5 to 2% by volume, fungicide and 1% up to 10% by volume of antifungal and antibacterial antibiotic agents.