CS254644B1 - Způsob přípravy enzymové elektrody - Google Patents

Abstract

Řešení se týká způsobu přípravy enzymové elektrody. Způsob spočívá v tom, že se enzym nebo směs enzymů imobilisuje na předem aktivovanou kolagenovou membránu reakcí s glutaraldehydem nebo s isokyanidem a glutaraldehydem, načež se kolagenová membrána s imobilisovaným eznzymem či enzymy fixuje na povrch elektrochemického čidla. Aktivace kolagenové membrány se provede částečnou desintegrací kolagenových vláken a/nebo rozštěpením určitého podílu peptidových vazeb účinkem proteolytických enzymů (např. pepsinu) nebo denaturačních činidel (např. močoviny) nebo krátkodobým působením minerálních kyselin nebo dlouhodobým působením organických kyselin a/nebo opakovaným zmražením a rozmražením kolagenové membrány ve vodných roztocích.

Description

Vynález se týká způsobu přípravy enzymové elektrody.

Využití enzymů v analytické chemii je podmíněno jejich vlastnostmi, které jsou neobyčejně vhodné pro analytické účely. Jde o vysokou substrátovou a účinkovou specifitu, stereospecifitu, mírné reakčni podmínky a značnou rychlost enzymových procesů. Použití volných enzymů naráží v některých případech na technické či ekonomické problémy jejich získávání, obtížnou regeneraci z reakčni směsi, poměrně malou stabilitu volných enzymů atd. Tyto problémy jsou postupně řeSeny náhradou rozpustných enzymů imobilisovanými enzymy použitelnými pro velký počet analys.

Jednou z možností použití imobilisovaných enzymů jsou biosensory, z nichž je značná pozornost věnována zejména enzymovým elektrodám. Enzymové elektrody jsou realisovány spojením imobilisovaného enzymu a vhodného elektrochemického senzoru. Tímto způsobem je možno detegovat velký počet enzymových reakcí, teoreticky všech, při kterých dochází ke změně koncentrace elektrochemicky detegovatelných látek. Velkou výhodu enzymových elektrod je rychlost, přesnost a reprodukovatelnost stanovení a dále možnost analysy roztoků barevných, kalných či fluoreskujících, kde jsou jiné způsoby detekce obtížné. Tato skutečnost umožňuje jejich použití v nejrůznějších oblastech chemie, chemické technologie, farmaceutického a potravinářského průmyslu, v moderních biotechnologiích a v klinické biochemii.

Enzymové elektrody je možno připravit:

1. Použitím rozpustného enzymu, který se oddělí v blízkosti elektrochemického čidla od.okolního prostředí semípermeabilní membránou (tzv. pseudolmobllisace).

2. Enzym se zachytí ve struktuře gelu (polyakrylamldového gelu, želatiny, alginátů apod.) na povrchu senzoru.

3. Enzym je sorbován na povrch senzoru či membrány obklopující senzor a tato fixace sorpcí je zvýšena vzájemným prokřížením enzymových molekul bifunkčnimi činidly.

4. Enzym je kovalentně vázán některou z imobilisačních technik na přírodní nebo syntetické membrány, které jsou v těsném styku se senzorem.

Analytická využitelnost enzymových elektrod je podstatně ovlivněna jejich stabilitou.

Mezi hlavní faktory, které ovlivňují stabilitu enzymových elektrod, je možno uvést způsob imobilisace, množství navázaného enzymu, čistotu enzymu, podmínky enzymové reakce a stabilitu senzoru (elektrochemického čidla). Z uvedených faktorů je způsob imobilisace nejsnáze ovlivnitelným faktorem, kterému je věnována náležitá pozornost.

Způsobem podle vynálezu je enzymová elektroda připravena Imobillsacl enzymu na předem aktivovanou kolagenovou membránu následnou reakci s glutaraldehydem nebo čtyřkomponentní reakcí mezi přidaným isokyanidem a glutaraldehydem s karboxylovými a aminoskupinami enzymu a kolagenové membrány.

Způsobem podle vynálezu se kolagenová membrána aktivuje částečnou dezintegrací kolagenových vláken a/nebo rozštěpením určitého podílu peptidových vazeb a tím zvýšení kapacity vazebných míst pro Imobilisaci enzymů. Aktivace kolagenové membrány je způsobem podle vynálezu dosaženo krátkodobým působením minerálních kyselin nebo dlouhodobým působením organických kyselin, působením denaturačních činidel (např. močoviny), proteolytických enzymů (např. pepsinu) nebo i pouhým opakovaným zmražováním a rozmražováním kolagenových membrán ve vodných roztocích.

Způsobem podle vynálezu se na aktivovanou kolagenovou membránu aplikuje enzym či směs enzymů určených k imobilisaci a poté se přidá bud samotný roztok glutaraldehydu, nebo v kombinaci s přidaným isokyanidem. Vlastní enzymová elektroda se poté připraví fixací kolagenové membrámy s imobilisovaným enzymem či enzymy na povrchu elektrochemického čidla.

Výhodou způsobu přípravy enzymové elektrody podle vynálezu je jednoduchost provedení, vysoká stabilita získané elektrody, dostatečně rychlá odezva a šíře lineární odezvy enzymové elektrody na koncentraci přidaného substrátu.

Vynález je dokumentován příklady použití, aniž by se jimi omezoval:

Příklad 1 _3

Kolagenová membrána byla podrobena 24 h působení 6 mol.dm močoviny. Poté byla promyta dest. vodou a 0,1 mol.dm amonnofosfátovým pufrem pH 7,0. Kovovým dutým válečkem byl vyříznut terčík o průměru 8 mm. Na částečně vysušený povrch vyříznutého terčíku bylo aplikováno 20 /il glukosaoxidasy a 2,5 /ul 2,5% glutaraldehydu. Po 96 hodinách imobilisace při 4 °C byla _3 membrána důkladně promyta 0,1 mol.dm amonno-fosfátovým pufrem pH 7,0. Kolagenový terčík s imobilisovanou glukosaoxidasou byl fixován na povrchu kyslíkového čidla Clarkova typu.

-5 -3

Spodní hranice objektivně stanovitelné koncentrace D-glukosy činila 1,7.10 mol.dm

Horní hranice lineárního rozsahu kalibrační křivky činila 2,0.10 mol.dm D-glukosy

-1-3 v reakční směsi, tj. 1.10 mol.dm v nástřiku. S takto připravenou enzymovou elektrodou bylo provedeno přibližně 500 analys během 30 dnů, aktivita imobilisované glukosaoxidasy během této doby poklesla o pouhá 3 %.

Příklad2

Kolagenová membrána byla podrobena 24 hodinovému působení 1% roztoku pepsinu v 0,01 — 3 -3 mol.dm kyselině chlorovodíkové. Poté byla promyta vodou a 0,1 mol.dm amonno-fosfátovým pufrem pH 7,0. Kovovým dutým válečkem byl vyříznut terčík o průměru 8 mm. Na částečně vysušený povrch vyříznutého terčíku bylo aplikováno 20 yul askorbátoxidasy, 2,5 .411 2,5% glutaraldehydu a 1,0 Jul cyklohexylisokyanidu. Po 48 h imobilisace při 4 °C byla membrána důkladně promyta 0,1 mol.dm amonno-fosfátovým pufrem pH 7,0. Kolagenový terčík s imobilisovanou askorbátoxidasou byl fixován na povrchu kyslíkového článku Clarkova typu. Získaná enzymová -4 -3 -3 elektroda byla použita ke stanovení vitaminu C v rozsahu koncentrací 10 až 10 mol.dm

Příklad 3

Kolagenová membrána byla podrobena 6 měsíčnímu působení 1 mol.dm kyseliny mléčné při 4 °C. Shodným postupem jako v příkladu 1 byla připravena enzymová elektroda na stanovení D-glukosy vykazující srovnatelné parametry z hlediska linearity odezvy i stability imobilisovaného enzymu.

Přiklad 4

Kolagenová membrána byla podrobena opakovanému zmražení a rozmražení (celkem 5krát) ve vodném roztoku. Shodným způsobem jako v příkladu 1 byla na vykrojený terčík imobilisována galaktosaoxidasa. Po fixaci kolagenového terčíku s navázanou galaktosaoxidasou na kyslíkový článek byla připravena enzymová elektroda s lineární odezvou na D-galaktosu v koncentraci 5.10^-5 až 10^-3 mol.dm^-3.

Příklad 5

Kolagenová membrána aktivovaná postupem dle příkladu 4 byla podrobena následnému působení močoviny dle příkladu 1. Na vykrojený terčík byla aplikována beta-galaktosidasa (15 /il), glukosaoxidasa (15 /ul) a 2,5% glutaraldehyd (4 /ul) . Dalším postupem dle příkladu 1 byla —5 -3 připravena enzymová elektroda na stanovení laktosy v koncentračním rozsahu 2.10 mol.dm až -3 -3

5.10 mol.dm v reakční směsi.

Claims (2)

1. Způsob přípravy enzymové elektrody vyznačující se tím, že se enzym nebo směs enzymů imobilisuje na předem aktivovanou kolagenovou membránu reakci s glutaraldehydem nebo s glutaraldehydem za přítomnosti isokyanidu a kolagenová membrána s imobilisovaným enzymem se fixuje na povrch elektrochemického senzoru.

2. Způsob podle bodu 1 vyznačující se tím, že se kolagenová membrána aktivuje částečnou desintegrací kolagenových vláken a/nebo rozštěpením určitého podílu peptidových vazeb účinkem proteolytických enzymů nebo denaturačních činidel nebo krátkodobým působením minerálních kyselin nebo dlouhodobým působením organických kyselin a/nebo opakovaným zmražením kolagenových membrán ve vodných roztocích.