CS254645B1 - Způsob přípravy enzymové, resp. hybridní elektrody - Google Patents

Abstract

Řešení se týká přípravy enzymové, resp. hybridní elektrody, jejíž podstata spočívá v tom, že se enzym nebo směs enzymů a/nebo celých buněk nebo jejich fragmentů, imobilisuje do kolagenové hmoty rozmícháním v této hmotě s následným prokříženim pomocí bifunkčních činidel a vytvořený kolagenový gel se fixuje na povrch elektrochemického sensoru například přetažením a upevněním membrány propustné pro nízkomolekulární sloučeniny.

Description

Vynález se týká způsobu přípravy enzymové, resp. hybridní elektrody.

Použití enzymů i celých biochemických systémů v analytické chemii znamená výrazný pokrok především z hlediska vysoké substrátové a účinkové specifity enzymů a tím i probíhájících reakcí, čímž je dána i vysoká selektivnost prováděných analýz. Reakce katalysované enzymy probíhají při velmi nízkých koncentracích substrátu s vysokou reakční rychlostí, aniž by vyžadovaly extrémní hodnoty teploty, tlaku pH reakční směsi. Z těchto důvodů je snížena na minimum možnost ovlivnění výsledku analýz tvorbou vedlejších produktů reakce, případně reakcemi jiných složek analyzované směsi látek.

Použití volných enzymů naráží v některých případech na technické či ekenomické problémy jejich získávání, obtížnou regeneraci z reakčni směsi, poměrně malou stabilitu volných enzymů atd. Tyto problémy jsou postupně řešeny náhradou rozpustných enzymů imobilizovanými enzymy použitelnými pro velký počet analýz.

Výrazné uplatnění nalezly imobilizované enzymy ve formě enzymových elektrod. Enzymové elektrody jsou realisovány spojením iraobilisovaného enzymu a vhodného elektrochemického senzoru. Tímto způsobem je možno detegovat průběh všech enzymových reakcí, při kterých dochází ke změně koncentrace elektrochemicky detegovatelných látek. Velkou výhodou enzymových elektrod je rychlost, přesnost a reprodukovatelnost stanovení a dále možnost analýzy roztoků barevných, kapalných či fluoreskujících, kde jsou jiné způsoby detekce obtížné.

Tato skutečnost umožňuje jejich použití v nejrůznějších oblastech chemie, chemické technologie farmaceutického a potravinářského průmyslu, v moderních biotechnologiích a v klinické biochemii.

Analýtická využitelnost enzymových elektrod je podstatně ovlivněna jejich stabilitou.

K hlavním faktorům, které ovlivňují stabilitu enzymových elektrod, patří způsob imobilisace, množství navázaného enzymu, čistota enzymu, podmínky enzymové reakce a stabilita senzoru /elektrochemického čidla/. Z uvedených faktorů je způsob imobilisace nejsnáze ovlivnitelným faktorem, kterému je věnována náležitá pozornost.

Vzhledem k tomu, že isolace některých enzymů je technicky či ekonomicky velmi náročná a dále s přihlédnutím ke skutečnosti, že některé isolované enzymy jsou málo stabilní i v imobilisované formě, byla vyvinuta technika přípravy buněčných a hybridních elektrod.

Tyto elektrody jsou připravovány za obdobných podmínek jako enzymové elektrody s tím rozdílem, že místo enzymu jsou na povrchu elektrochemického senzoru zachyceny celé buňky, případně buňky společně s přidanými enzymy. Pro analytické účely se pak využívá analyticky významných enzymů, které jsou u použitých buněk v nadprodukci /a které jsou díky fysiologickému prostředí, v němž se nalézají, podstatně stabilnější než v isolovaném stavu/ nebo se analyticky využívá spřažených enzymových reakcí či celých komplexů metabolických pochodů, nejčastěji buněčné respirace.

K přípravě buněčných nebo hybridních elektrod se běžně používají buňky mikrobiální, především kvasničné a bakteriální. Mohou být však použity i isolované buňky živočišné či rostlinné nebo různé suboelulárni částice, jako např. mitochondrie.

Z jednotlivých imobilizačních postupů se pro přípravu beněčných či hybridních elektrod nejčastěji používá zabudování do gelu at již přírodního /želatina, agar, algináty/ či synthetického /polyakrylamid/.

Způsobem podle vynálezu je enzymová, resp. hybridní elektroda připravena imobilisací enzymů, buněk či jejich fragmentů, případně jejich směsi do kolagenového gelu. Biologický, enzymově aktivní materiál se suspenduje v kolagenové hmotě, načež se vytvořená hustá suspenze prokříží a zpevní pomocí bifunkčních činidel (např. glutaraldehydu/. Vytvořený gel se poté fixuje na povrch elektrochemického sensoru a s výhodou se od reakčního prostoru oddělí membránou propustnou pro nízkomolekulární látky /např. celofánovou membránou/.

Výhodou způsobu přípravy enzymové, resp. hybridní elektrody podle vynálezu je především jednoduchost způsobu imobilizace biologicky aktivního materiálu do kolagenové hmoty, kdy není nutná její předchozí aktivace a kdy je možno přímo imobilisovat jak samotné enzymy, tak i celé buňky či jejich fragmenty. Vytvořená tenká vrstva kolagenu, ve kterém je imobilisován enzymově aktivní materiál jednak vlastním zabudováním do vytvořené struktury kolagenového gelu a jednak následným prokřížením pomocí bifunkčních činidel, vytváří pro tento imobilisovaný materiál velmi příznivé podmínky z hlediska jeho stability. Enzymové, resp. hybridní elektrody připravené způsobem podle vynálezu jsou proto velmi stabilní.

Vynález je dokumentován příklady použití, aniž by se jimi omezoval:

Příklad 1 _3

Kolagenová hmota /1 g/ byla rozmíchána ve 2 ml 0,1 mol.dm fosfátového pufru pH 5,8.

Po krátkém zahřátí /2 min/ na 40 °C, kdy došlo ke ztekucení, bylo aplikováno na celofánovou membránu o síle 30 /um 20 yul této hmoty, 0,2 mg lyofilizovaného preparátu glukosaoxidázy a 2 yul neředěného preparátu katalazy. Po promíchání vytvořené směsi bylo přidáno 5 /il 5% vodného roztoku glutaraldehydu a směs byla opět promíchána. Celofánová membrána s gelem byla přiložena na kyslíkové čidlo Clarkova typu a pevně zafixována. Vytvořený kolagenový gel s imobilisovanými enzymy byl zachycen pod touto membránou, čímž byl zároveň chráněn -3 před mechanickým poškozením. Celá elektroda byla uchovávána v 0,1 mol.dm fosfátovém pufru pH 5,8 při 4 °C. Časový interval mezi přípravou enzymové elektrody a prvním stanovením její odezvy, resp. vlastním stanovením D-glukosy byl 24 hodin.

Příklad 2

Ke ztekucené kolagenové hmotě připravené podle příkladu 1 a nanesené na celofánovou membránu bylo přidáno 5 mg buněčných stěn kvasinek Saccharomyces cerevisiae s invertasovou aktivitou, 0 2 mg lyofilisovaného preparátu glukosaoxidasy a 2 jul neředěného preparátu katalasy a mutarotasy. Po promíchání vytvořené směsi bylo přidáno 5 μΐ 5% vodného roztoku glutaraldehydu a směs byla opět promíchána. Celofánová membrána s gelem byla přiložena kolagenovou stranou na kyslíkové čidlo Clarkova typu a pevně zafixována. Celá elektroda byla uchovávána v 0,1 mol.dm ³ fosfátovém pufru pH 5,8 při 4 °C. Časový interval mezi přípravou enzymové elektrody a vlastním stanovením sacharosy byl 24 hodin.

Příklad 3

Ke ztekucené kolagenové hmotě připravené podle příkladu 1 a nanesené na celofánovou membránu bylo přidáno 10 mg vlhkých kvasinek Saccharomyces uvarum kultivovaných v mediu obsahujícím etanol. Po promíchání vytvořené směsi bylo přidáno 5/ul 5% vodného roztoku glutaraldehydu a směs byla opět promíchána. Celofánová membrána s gelem obsahujícím imobiliso váné buňky byla přiložena na kyslíkové čidlo Clarkova typu a pevně zafixována. Celá elektroda byla uchovávána v 0,1 mol.dm ³ fosfátovém pufru pH 5,8 při 4 °C. Časový interval mezi přípravou kvasničné elektrody a vlastním stanovením etanolu byl 24 hodin.

Claims (2)

1. Způsob přípravy enzymové, resp. hybridní elektrody vyznačující se tím, že se enzym či směs enzymů a/nebo celých buněk nebo jejich fragmentů imobilisuje do kolagenové hmoty jejich rozmícháním v této hmotě s následným prokřížením pomocí bifunkčních činidel, s výhodou pomocí glutaraldehydu, a vytvořený kolagenový gel s imobilisovaným enzymově aktivním biologickým materiálem se fixuje na povrch elektrochemického senzoru.

2. Způsob podle bodu 1 vyznačující se tím, že se fixace kolagenového gelu s imobilisovaným enzymově aktivním biologickým materiálem provede přetažením a upevněním membrány propustné pro nízkomolekulární sloučeniny.