CS253567B2 - Column for liquid chromatography and method of its preparation - Google Patents

Description

Vynález se týká kolony pro kapalinovou chromatografií, 8 gelovým ložem z pórovitých obsahujících vinylalkoholové jednotky. V užším symslu se vynález týká kolony s vysokou dělící schopnoosí pro vysokogychUostní kapalinovou chrgmahograhii, kterážto kolona zahrnuje rovnoměrné gelové lože s vysokým poměrem plnění pórovitých gelů obsah^ících vinylano^-olové jednotky a majících vysokou ^ddroilnost a zlepšenou mmel-hnidou pevnoot, již se má dosáhnout gelové permeační chromahcogafické separace při pov^žtí vodného elučního činidla; dále se vynález týká způsobu přípravy této kolony a metody jejího pOL^žií pro frakci-onaci.

Výraz pcrGoitý, jak se jej zde používá, znamená, ie jemné póry jsou rozptýleny v celé hrotě zrn gelu. Výrazem vinyl.jednotky se r^ozuimijí skupiny vzorce

- CH - CH I ² OH

Kapalinová chromaacoraaie ummoňuje rozdělení kapalné smii v její jednodivé kapalné složky, přieemž se zachovává kapalný stav. Není nutné přemmint zpracovávané vzorky v páry, jako je tomu u plynové chrgmahogrrjie, a požadované látky se od sebe mohou oddděit, aniž by doznaly jakoukoliv změnu nebo degraddai. Proto se kapalinové chrgmahograaie používá v různých oborech, jako je chemie, biochemie a farmacie. Podle mechanismu dělení složek se kapalinová ihrcmahocraaie dělí na gelovou permeační ihromaholrajfi (GPC), rozdělovači iUromaholrajii, adsorpční ihrlmaholrajfi, iUrcmahocrajfi na bázi výměny iontů a jiné.

V souladu s nedávnými výraznými pokroky v oblassi vysokolychUostní iUrcaahocrraie a rozšířeného používání v různých oborech existuje značný požadavek na zlepšení, pokud jde o účinnost, kolony pro gelovou permeační iUrlmaholrajfi pouužvvaicí vodného rozpouštědla, které se používá k vzá^mninému oddělování vodorozpustných látek na základě různé velikossi jejích mooekul pouuitím vody nebo vodného roztoku jakožto eluiního činidla.

Největšího rozšíření z gelových permeačních kolon, pouužvaaících vodného rozpouštědla, doznaly kolony plněné dextranovým nebo agarózovým gelem. Tyto gely obsažené v takovýchto kolonách jsou měkké, a je tudíž uysokloycCUostní analýza nemožná.

Měkké gely jsou popsány v britské zveřejněné patentové přihlášce i. 2 061 954A. Ze zlepšených kolon ve srovnání s výše uvedenými lze uvést kolony plněné polyltyllnglyllldialthlryláloýýa gelem, které však stále ještě dostatečně nevyhooují, pokud jde o dělicí schopnost a průtokovou rychlost el-učního činidla.

V Japonské zveřejněné patentové přiháášce č. 138 077/1977 se navrhuje pouužt vodného gelu, získaného zmmclelněním zrnitého kopolymeru dietylenglyklldiaethkrylltu nebo pod.

s uίnylaietátea a příčným zesítěním zaatlelněUo kopolymeru pomocí epiiUllrUydrínu. V uvedené přiUlášie však není zmínka o dostatečně účinném oddělování při vysoké průtokové rychlossi. Nedootatečné oddělení je zčááti zaviněno velikostí zrn gelu v rozmezí 46^um až 37

Jako kolony, zajištujíií poměrně velmi rychlou analýzu a zlepšené oddělování, byly navrženy kolony plněné pórovitým siilhrgeeea, jehož povrch byl podroben chemické úpravě, k zabránění adsorpce rozpuštěných látek. Pouuívání kolon tohoto typu je vskutku velmi rozšířené. · Avšak struktura těchto gelů je anorganická a proto je obtížné reprodukovatelně konnrolouht průměr pórů gelu, což je důležitým parametrem gelů pro gelovou permeační chromato^rě^afiÍ, čímž se rozmezí optimální průměru pórů zmmnnuue.

Rovněž je obtížné dosáhnout vysokého plnicího poměru gelového lože, což způsobuje, že životnost kolony je nízká. Dsaší nevýhodou je, že při poouítí kolony z gelu kysličníku křemičitého musí být hodnota pH použitého elučního činidla v rozmezí 3 až 9. A i když je pH v tomto rozmezí, přechá^^í stopová aaoCiSví kysličníku křemičitého do vyték^ící kapa^ny, což nepříznivě ovlivňuje výsledky chrcaahocrrfické analýzy.

Pro získání plněné kolony o vysoké άσ^ηο^ί je rozhodujícím činitenem, v jakém stavu se vytvoří gelové lože. To znamená, že je podstatné, aby se vytvo^l rovnoměrný vysoký plnicí poměr gelového lože. V souladu s tímto cílem se ve zveřejněné japonské patentové přihlášce č. 60 290/1978 navrhuje rovnom^imě místit gely o velkých zrnech s gely o malých zrnech k dosažení vysokého plnicího poměru gelového lože.

Nevýhodou tohoto postupu je, že je nevyhnuuelně dopriváznn zvýšením výškového ekvivalentu teoretického patra (v dalším VETT'’', plynoucím z přimíšení gelů o velké velikosti zrn. Výškový ekvivalent teoretického patra je definován jako taková délka kolony, která skýtá vytékáíící kapalinu, jež je v rovnováze s průměrnou konneenrací po uvedené délce ve stacionární fázi. Nevýhody výše uvedených běžných kolon souvisejí s povahou gelů a se stavem vytvořeného gelového lože. Je proto důležité zjistit optimální hodnoty těchto parametrů, aby se získala odsokalydCholtní kolona vysoké oddělovací schopnc^si a dlouhodobé životnosti. ,

Byly proto podniknuty rozsáhlé podrobné studie jednotlivých výše zmíněných param^t^rů, které přispívájí k účinnostί plněných genových permeacních chromaiografίckýeh kolon; výsledkem těchto prací bylo zjištění optimální kombinace těchto parametrů a podmínek, které je zapotřebí k vytvoření oysokolycCloltní kapalinové chromaioolafieké kolony s vysokou dělící schopnnotí a dlouhou životn^tí. Tento vynález se právě opírá pracc.

o výsledky těchto výzkumných kapalinovou chromaaooraaií nosič z takových gelů, které

Je proto účelem vynálezu poskytnout zlepšenou kolonu pro s vysokým plnicím zahrnu jící rovnoměrné lože jakožto neadsorbují rozpuštěné látky, což by vedlo k nedostatečnému dělení složek (jinými slovy, které maíi nniontooou, avšak vysoce hydrfilní chemickou strukturu), maj regulovanou velikost pórů a pórovótost v optimálním rozm^5^:í a jsou v podobě jemných zrn k zaústění vysokého stupně dělení, přičemž se zároveň vyznac^í dobrou mechanickou pevnoosí, umolňujjcí vysokorychlostní chromatografickou analýzu.

Dalším účelem vynálezu je poskytnout způsob přípravy takovéto zlepšené kolony pro kapalinovou chromatooraifi.

Jiným účelem vynálezu je poskytnout analytickou metodu, při níž se používá této zlepšené kolony pro kapalinovou chromaioolaifi.

popisu

Výše uvedené a další účely, znaky a výhody vynálezu budou zřejmé z dalšího podrobného a připojené definice předmětu vynálezu s přihlédnutím k přiloňnným výkresům, kde na obr. 1 je znázorněn diagram, v němž jsou na ose X vyneseny hodnoty elučního píku a na ose Y je vynesena konccnnrace, kterýžto diagram jak stano^J^t objem píku Ve (jak bude definován pozddji) a šířku píku W (jak bude definován pozddji), objemu eluční na jejichž základě se vypočte výškový ekvivalent teoretického patra,

- na obr. 2 je znázorněn chromátogram, kde ' na ose X je vynesena retenční doba a na ose Y absorbance ul·trafial·ového záření, kterýžto chromátogram se vztahuje na směs komerčního thyroglobulinu, albuminu, myyglobinu a fe^^lani-nu (detekce absorpcí vltrafίaSového záření při 254 nm; byl získán použitím kolony pro kapalinovou rozdělovači chromaioolaifi, jak popsáno v dále uvedeném příkladu 1, na obr. 3 (a) a (b) jsou znázorněny chromatogramy, kde na ose X je vynesena retenční ose Y absorbance ultrafialového záření; byly získány rozdělením lidského séra doba a na (detekce absorpcí ultrafialového záření při 254 nm), jak popsáno v příkladu 3. Obr. 3 (a) se týká normálního lidského séra, obr. 3 (b) se týká séra při selhání ledvin,

- na obr. 4 je znázorněn chromatogram, kde na ose X je vynesena retenční doba a na ose Y absorbance ultrafialvvého záření; byl získán rozdělením séra při selhání ledvin (detekce absorpcí ultraΙ^^ννό^ záření 254 nm) , jak je popsáno ve srovnávacím příkladu 1,

- na obr. 5 (a) a (b) jsou znázorněny chromatogramy, kde na ose X je vynesena retenční doba a na ose Y absorbance ultrafii^vého záření; byly získány rozdělením séra při selhání ledvin (detekce absorpcí ultrafik^vého záření při 254 nm) v koloně pro kapalinovou rozdělovači chromalogralΐi, jak je popsáno v příkladu 4. Chromatogramem na obr. 5 (a) byl získán při ^průto^kov^é rychlosttⁱ l,⁰ ml.min , c^hromatogram na obr. ⁵ (^{b) p}ř^{i p}růtokov^é rychlosti

2,0 ml.min ³, a

- na obr. 6 je znázorněn chrom^ltogrl^m_/ kde na ose X je vynesena retenční doba a na ose Y lbsorblnce žltrαflslvvéllt záření; týká se směsí (detekce absorpcí uStraflslivélt záření při 254 nm) vzniklé v průběhu výroby chemikálie, určené pro použití v zeměědlssví, kterýžto chromatogram byl získán pomocí kolony pro kapalinovou rozdělovači clrtmolotrαlfi, jak je popsáno v příkladu 5.

Předmětem vynálezu je tedy kolona pro kapalinovou ^гилоРодго^ i s gelovým ložem z pórovitých gelů obsah^ících vinylllksloIsvé jednotky, jejíž podstata spočívá v tom, že gely ooíí ^ооНинЫ střední průměr zrn 4 až 20 ,um, přičemž gelové lože má hodnotu plnicího poměru v rozm^^íí 0,66 až 0,78 a stupeň rovnм?mlnost:L v rozmezí 2,0 až 4,0 definovaný poměrem ve kterém

HETP znamená výškový ekvivalent teoretického patra kolony a

Dp znamená lmoSnostní střední průměr zrn gelů.

Gely, obsažené jako nosič v kolonách pro kapalinovou rozdělovači chromαlotrrlii podle vynálezu, jsou zesítěné, pórovité polym^i^:^:! gely a maj •dostatečnou lyddrSilnsst vyp^yv^cí z přítoonooti patřičného moSit^’^:í vknylllkshslsvých skupin. Jak již bylo uvedeno, rozumí se výrazem pórovitý taková struktura gelu, při níž jsou jemné póry rozptýleny v celé hmotě zrna polymerního gelu. Pevné gely takovéto struktury maj v suchém stavu velký specifický povrch, zpravidla v r^ozm^i^í 5 az 1 000 a .g , a při přechodu gelu ze suchého do vlhkého stavu se struktura pórů téměř nemění. Tyto tuhé gely jsou popsány ve zveřejněné britské patentové přihlášce č. 2 061 954A.

Přítomnost vknySalkoholovýcl skupin vzorce

- CH - CH„

I ² OH je možno dokázat spektroskopicky z absorpce infračerveného záření. Žádoucí obsah vinyl·llks^lových skupin v polymeru může koSíslt podle druhu rozpuštěné látky, která se má podrobit chroaalografkcké analýze. Například může kDo-ísat mezi hodnotou vhodnou pro sacharidy, které jsou méně ldssrbovatelné na gelech, a hodnotou, vhodnou pro proteiny, aainokkselkny apod., které jsou vysoce ldsorbsvateSné na gelech.

Žádoucí obsah vioylalkoholovýil skupin, vyjádřený koncenOrací hydroxylových skupin, je zpravidla v rozm^;^^ od 3 do 15 mev./g, s výhodou od 4 do 10 oiew/g. V polymeru mohou být přísaany i jiné iontové hydrooflní skupiny, jako jsou karboxylové skupiny, pokud jen jsou přítomny v takovém mnolžtví, které nevyvolá Kdsorpci rozpuštěných látek nebo které nebude oit jiný nepříznivý účinek. Kooncentaci hydroxylových skupin je možno stanovit, tak, že se gel obsahnuící hydroxylové skupiny nechá reagovat s рп1уГо;^г^(^о kyseliny octové v pyridinu, načež se zjistí опо^Ьу! anhydridu kyseliny octové, které se spotřebovalo reakcí s hydroxidovými skupinami. Vyyadřuje se hmotnostním onotstvío ekvivalentu na 1 g suchého gelu.

Gely, tvořící nosič v koloně podle vynálezu, by měly být zesítěny v dostatečné míře, aby se udržela jemná pórovitá struktura a aby gely měly dostatečnou pevnost umooňuuící chromaaoograii při vysoké průtokové rychlosti elučního činidla. Zesilující čáj^“t má mít strukturu odooávapcí hydrolýze. Výhodné gely podle éterové vazby, isokyanurátový kruh nebo kyanurátový vynálezu obsahuuí v zesilující části kruh.

Pokud jde o vlastnosti gelů podle vynálezu, je též dů1ežité regulovat pórovítost nebo zádrž vody (označované v dalším symbolem Wr). Zvýšení hodnoty Wr může být vhodné s hlediska rozdělovači schop^os!, avšak může být doprovázeno snížením mechanické povnooti a/nebo tvorbou nerovnoměrného gelového lože. Hodnota W~ gelů podle vy^i^^Lezu by měla být „ -i ^K -1 zpravidla v rozm^;^:L od 0,6 do 2,8 ml.g , s výhodou od 0,8 do 2,0 ml.g , zejména od 1,0 do 1,8 ml.g . Poruití gelu o takovéto hodnotě Wr usnadňuje vytvoření rovnoměrného gelového lože o vysokém plnicím poměru a zajištUís nutnou pro rozdělování, což přispivá k přípravě vysckkioycdootní kolony pro kapalinovou chromatouratii, která se vyznačuje vysokou rozdělovači sclopntoSí. Hodnotu Wr (viz. Tsuguo a Sadao Moři Gelová clroгmtourrtie vyd. Kodansha Κ. K., Japonsko, 1972) je možno určit tak, že se suchý gel o hmoUonoti ponechá v destiUoitté vodě po dostatečně dlouhou dobu k dosaženi rovnováhy, načež se odstře^je ⁶⁰ při ^ts^nlu^oě 7 C r^hloo^ 3 ⁰⁰⁰ otmin. ¹ к odstranění vod^y J-noucí k povrchu gelu. Pak se určí hmoonost W₂ gelu a hodnota Wr gelu se vypočte podle vztahu w - w ^w2 ^W1 ^Wr (ml/g).

^W1 koloně pro kapalinovou chromattogafii se příznivě zvýší

Zvýšením průměru zrn gelů v činidla, avšak nepříznivě sníží rozdělovači schopnoot. Naopak, příznivě vzroste rozdělovači schopnost avšas nepříznivě poklesne činidla. Žádoucí hInoUnt>utní střední průměr zrn gelů, kterých vynálezu, 'je v rOzm^:z:í od 4 do 20/um, s výhodou od 6 do 20 ,um, průtoková rychlost elučního snížením zrn gelů průtoková rychlost elučního se používá v kolonách podle zejména od 8 do 15 /^um. Podle vynálezu se kolona plní zrny gelů o poměrně malém průměru, aby se dosáhlo co největší rozdělovači schopnnosi. Nadto se podle vynálezu dosahuje zvýšení průtokové rychlooti elučního činidla vytvořením vysokého plnicího poměru gelového lože. Z toho vyplývá, že kolona podle vynálezu splňuje oba výše uvedené požadavky, tj. vysokou rozdělovači schopnost a vysokou průtokovou rychlost elučního činidla. ·

Hmmonnosní střední průměr zrn gelů (v dalším označovaný smybolem Dp) se měří pomocí přístroje Coouter Couuter” (výrobce Coouter Electronics lne., USA). Hodnota Dp se vypočte podle vztahu

Σ ⁿd⁴

Dp = -----Σ ⁿd³ kde d znamená průměr zrna a n znamená četnost výskytu tohoto průměru zrna.

Kromě výše uvedené hodnoty Dp je nutno brát v úvahu distribuci průměrů zrn jakožto parametr ovlivňující přípustnou průtokovou rychlost el-učního činidla. Doporučená distribuce průměru zrn, definovaná hInoUnostním středním průměrem zrna (Dp) děleným čísenným středním průměrem výš 1,2.

zrna (Dp), má u kolony podle vynálezu mít hodnotu nanejvýš 1,5, s výhodou nanejCíselný střední průměr zrna (Dn) se vypočte podle vztahu

Σ nd

Dn = -----S n kde nad maaí výše uvedený význam.

б

Relativním kritériem stupně rovnoměrnosti gelového lože je redukovaný výškový ekvivalent teoretického gelového lože je redukovaný výškový ekvivalent teoretického patra, deeinovaný vztahem HETP/Dp. HETP te určí tak, že te chromaatggafuje za předem stanovených podmínek chromaaografování v každé z gelsvých permeačních ihromatoogafickýih kolon různých typů, poněvadž hodnoty HETP te liší, když te mění podmínky chromaoggafování, jakými jsou například rychlost průtoku elučního činidla nebo druh rozpuštěné látky. Výsledkem těchto pokusů bylo zjištění, že použitím běžné plnicí metody za konstantního ta aCu^vzniká velmi nerovnoměrné gelové lože; při této metodě te suspenze gelu najednou načerpá do kolony pomocí vysokotlakého čerpadla.

V koloně, plněné použitím této běžné plnicí mmtody, te ta část gelového lože, která te nachází na výtokové straně kapal, iny p^x^2^ž.t^é pro plnění, vyznačuje velmi vysokou hodnotou redukovaného výškového ekvivalentu teoretického patra (HETP/Dp) ve srovnání s jičástmi ^ge^lov^^ého ls^že. Dokud pL^^c^í poměr ^gelov^ého lo^, ja^c je v dal^ším definsv^án^, nedotáhne hodnoty přibližně 0,6, je možno pomocí běžně plnicí metody₄za konstantního taaCu vytvošit poměrně rovnoměrné gelové lože. Když však plnicí pom^r gelového lože te dále zvyšuje, stupeň nerovnommrnnsSi gelového lože výrazně stoupá.

Pro řešení tohoto problému se zkoumání zanořilo na studium vlivu jak vlastností gelu, tak techniky přípravy kolony; Výsledkem tohoto úsilí bylo vytvoření rovnoměrného gelového lože o vysokém plnicím poměru podle vynálezu. Hodnota re^kovaného výškového ekvivalentu teoretického patra (HETP/Dp) kolony podle vynálezu je v rozm^e^Jí od 2,0 do 4,0, s výhodou od 2,5 do 3,5. Je-li hodnota HETP/Dp větší než 4,0, děěíií schopnost kolony te výrazně snižuje. Je-li hodnota HETP/Dp nižší než 2,0, bude te kolona vyznačovat vysokou děěiií schopnost, bude však velmi obtížné jL reprsdukovatelně připravit.

Výškový ekvivalent tesnetickéhs patra dosahuje různých hodnot podle podmínek při ihromatoorgfai, jako jsou nappíklad typ použitého elučního Činidla a druh rozpuštěné látky. Výškový ekvivalent teoretického patra, jak te toho pojmu zde · používá, se stanoví tak, že te chromaaocgafuje vodný rsztsC etylenglyColu o hmotnostní Csnccetraci 1 · % za posvítí destišovan^é vody ja^cs^žts e^čn^s čin^^ při teplot ²⁵ °C a ^při ^pn^ůts^cov^é rychlosti eluční^ho činidla 1,5 m.h~ (povrchová rychlost v koloně), ze získaného chnomatorrtmu, znázorněného na obr. 1 (nefreCtsmeeгicCá detekce) te odečte eluční objem píku (Ve) a šířka píku (W) (viz Ttuguo Takíeuchi a Sadao Mosi Gelová chromafosraffe^,,, vyd. Kodantha Κ. K., Japonsko 1972), a hodnota HETP te vypočte podle vztahu:

HETP = L (W/4 Ve)² kde

L znamená délku řetězce a

W a Ve maj výše uvedený význam.

Plnicí pom^r gelového lože v koloně podle vynálezu te má regulovat s ohledem na zádrž vody (W_R). Tím je umožněno dosáhnout vysokého plnicího pornmru, aniž by ts ovlivnilo redukovaný výškový ekvivalent teoretického patra (HETT/Dp). Pro kolonu plněnou gelovým nosičem platí, jak známo, vztah

Vt = Vo + (Vi + Vg) ,

kde
Vt	znamená	celkový obejm kolony,
Vg	znamená	objem gelového subbtrátu,
Vi	znamená	vnitřní objem gelových zrn a
Vo	znamená	objem mezer mmei gelo.vými zrny

Plnící poměr (v dalším označovaný symbolem Pd) kolony podle vynálezu je vyjádřen vztahem se vynásobením hmeSrwsii gelu (a) v suchém stavu hodnotou W_R získá vypočte

Pd - J - (VoZVt ) , kde

Vo a Vt mma! výše uvedený význam.

Pro výpočet Vo

Vi, a hodnota Vg se ze vztahu

Vg = a/d , kde

Vg d má výše znamená uvedený hustotu význam a gelu.

(celkový objem kolony) se určí přímo z konstrukce kolony. U kolony podle vynálezu

Vt žádoucí, aby hodnota poměru (Vi/Vo) byla v rozmezí od 1,0 do 2,0, .s výhodou od 1,2 1,8, aby se tím dosáhlo harmonické kommí-nace zádrže vody W_R a plnícího poměru Pd. důležité pro dosažení výrazného zlepšení rychlooti chromatograilvotlosSi, aby hodnota pelíííhs poměru (pd) byla v rozmezí od 0,68 do 0,74, když hodnota poměru Vi/Vo je v rozmezí od ^je do U kolony podle vynálezu je fování, dělící účilnostl a od 0,66 do 0,78, s výhodou

1,2 do 1,8. Pro stanovení velikosti objemu prázdného prostoru mezi gelovými zrny (Vo) je známa mmtoda, pří níž se v plněné koloně vyvvjí polymer, maaicí větší molekulovou hmoonost, než je vylučovácí mez eeSeOulsvé hmoSnnsSi a Vo se získá jako objem píku eluátu, zaznamenaný na chromatogramu. Tato známá mmtoda však nevyhovuue, protože při ní dochází k významným chybám při eeření vlivem distribuce moSeOulových heoStl>sií vyvinutého polymeru a ve:^^e¢^e struktury gelového lože.

jako nosič v koloně nebo kopolymeru.

nebo zmýýdlňovací polymer nebo kopolymer

Kolona podle vynálezu bude nyní podrobně popsána. Gely, použité podle vynálezu, se miohou odvozovat od iilyekarbsxylátovéhs polymeru Naapíklad se tyto gely získají tím, že se podrobí přeesterifiksiálí reakci v rozpouutědle, které lerszpoužší polyvinylaeOshoS, pórovitý z jediného nebo několika monomm^ obsahnuících alsepoň dvě iilyeoarbsxylátsié skupiny nebo pórovitý kopolymer .získaný kopolymeedcí uvedeného monoím^ s monomerem obsahujícím jedinou iilylOarbsxylátsiΌu skupinu, načež se zrna, která si v poddtatě zachovával původní s příčně zesíňujícím činidlem.

takto jemně získaná, pórovitá polyvinylalkoholová pórovitou strukturu, nechhjí reagovat suspenzi v přítoenosti radikálového iniciátoru spolu s butylacetátem, vytvářejícím pórovítost vzniklého polymeru. Vzniklý polymer se přemění v pslyillyealksholová zrna pomocí reakce v metanolu, čímž se vytvoří hydroxylové skupiny. Pak se zrna polymeru podrobí zelij:žjjíj reakci s epίchlorhydrddee ve směsi acetonu s dimetylsulfoxddem za vzniku požadovaných gelů. Podrobn^si o gelech, získaných výše popsanými postupy, jsou popsány ve zveřejněné japonské patentové přihlášce č. 64 657/1981.

Naaříklad se divinyladipát polymeruje ve vodné

Alternativně je možno požadované gely, které jsou určeny k použití v kolonách podle vynálezu, získat kopolymerováním vinylkarboxylátového monomeru se zesítieelným monomerem a následným přllstlriiiOováníe apod. Popřípadě je možno získaný polymer dodatečně nechat reagovat s epichlorhydrlnee nebo jiným sírujícím čilidlee pro získání požadovaných gelů. * Jako příklady .zes^řec^ého monommru, obsahuúícího alespoň dvě liyellicky nenasycené skupiny, je možno uvést monomer maaicí isokyanurátový kruh, jako je iriaelylisokyalžrát, nebo monomer maj^i^:í kyanurátový kruh, jako je triaHylkyarnirát, nebo divinyléter, jako je dLetyl^engl·ykoldivinlllter. Z výše uvedených monomm^ je lejvýhodnljší triaHylisokyanurát, poněvadž snadno kopolymmeuje s vinylkarboxylátem a vzniklý gel má vynikkaící eechanicOou pevnoot.

U gelu z triaelelisokyalžrátž lze snadno regulovat průměr pórů a pórooitost. Podrobnnoti o takovýchto gelech způsobech k jejich přípravě jsou uvedeny v japonských patentech č.

I (japonské patentové přihlášky č. 85 243/1980 a 183 703/1980) . Požadované gely je možno například získat suspenzním kopolymerováním triallylisoyaanurátu s vinyaacetáem v příslunéém molárním poměru, takže stupeň zesítění může mít předem určenou hodnotu v rozmezí od 0,20 do 0,40, v pří^ineoU butylacetátu, který způsobí, že vzniklý polymer je pórovitý, a radikálového iniciátoru, načež se takto získaný pórooltý Copolyoer podrobí přessteifikační nebo změěeeňovací reakci v metanolovém roztoku hydroxidu sodného. Jikýkooiv p°žadovaný obsah iinyliikohil·oiých skupin v polymeru je možno snadno doZUt řízením přeměny při řřeeslteifikicní nebo zmýýdeňovací reakci, výše uvedený zmíněný stupeň zesítění (X) je možno vypoočtit podle vztahu

kde

znamená molekulovou hmoonost iinyliarb°xylátl, znamená molekulovou hmoonost ШаНуИгсУхамМи, znamená ^ηο^^^ί m^nožtt^^í iitylCarb°xylltl použitého pro ^Ιΐοο^ιί, a znamená ^по^о^п! onn°žtví použitého pro ^110^3x1.

Dalším předmětem vynálezu je způsob přípravy kolony pro kapalinovou chr°moioigaiii s gelovýo ložem z pórovitých gelů obsa^^cích туИМ!^ jednotky, při němž se do plnicího zařízení, odp^i^lně spojeného s kolonou, která má na svém dolním konci první koncovku opatřenou fit^t^eu, vnese suspenze · pórovitých gelů obsa^-mulcích ^уШко^к^ jednotky, načež se plnicí zařízení neprodyšné uzavře s výjimkou výstupu pro suspenzi a vstupu· pro plnicí kappaim, pak se plnicí kapalinou, vedenou plnicím zařízením a kolonou, převede do kolony suspenze gelů za současného odvádění kappai-ny ze suspenze jakož i plnicí kapaliny přes filtr, upravený v první koncovce na dolním konci kolony, čímž se v koloně vytvoří gelové lože, poté se stupňovitě nebo spcoitě zvyšuje průtoková rychlost plnicí kapaliny, načež se kolona odpoj od . plnicího zařízení a ke koloně se na je^ji horním konci připoj druhá koncovka opatřena fitteeo, čímž v koloně zadrží vytvořené gelové lože, přičeŽ podstata způsobu spočívá v tom, že plnicí kapalina, pouužt-á k převedení suspenze gelů do kolony, se v objemovém onc°sSví rovnajícím se jednonásobnému až třSsiaáásobku vnitřního objemu kolony vede kolonou průtokovou rychlostí 0,2 až 1,5 m.h od začátku přivádění plnicí kap^iny, přičemž při stupňovitém nebo spojitém zvyšování průtokové rychlossi plnicí kapaliny Činí oaxioilní zvýšení tlaku a průměrné zvýšení tlaku na 1 ootr gelového lože, vyvozované proudící plnicí kapalinou na vstupu plnicího zařízení, nanejvýš 6 MPp.min ¹ u moxiIn0lního zvýšení tlaku a 0,2 až · MPa.h u průměrného zvýšení tlaku na 1 ooer gelového lože,

Plnění suspenze gelu do kolony se může provádět pomocí Čerpadla obecně známým postupem pro mokré plnění (viz. H.roy^J^i Ha tamo, a koř, ^хро^ов^ёт iysoko°yyhlosttí kapalinová chr°maio°raiit (Expeeioeetal High-Speed Liquid Chromoaooraphh), vyd. Kagxku Doin, Japonsko, 1977) . Při způsobu podle vynálezu je nanejvýš důležité, aby nedošlo k náhlé změně průtokové rychlosti nebo tlaku na gelové lože během plnicího postupu. PPi způsobu podle vynálezu je možno pouHt jxktho°oiii, pro tento účel běžně používaného plnicího zařízení. .

ppi prakt;ccé^o provádění způsobu podle vynálezu, se plnicí zařízení pro plnění tltpetzt gelu do kolony zpravidla napoj na jeden konec kolony. Na plnicí zařízení je rovněž napojena trubka pro přepravu kapaliny z odděleně ^^е^хап^^ čerpadla. Horní část plnicího zařízení je opatřena uzavíratennýo zařízením, které je schopno vydržet tlakové zatížení během doby plnění po nalití suspenze gelu do plnicího zařízení. Nx tom konci kolony, z něhož kapalina odchází, je nasazena první koncovka opatřená fitteeo, který proplutí Сара^ш, xvšxC zabraňuje průchodu zrn gelu.

Podle potřeby je možno nasadit na hlavu a/nebo spodek hlavní kolony pomocnou kolonu (obvykle označovanou jako předběSná kolona), mající stejný vnitřní průměr jako hlavní kolona. Účelem pouužtí této pomocné kolony nebo kolon je, zlepšit rovnomměnost gelovéUo lože odstraněním zřetelně nerovnoměrných částí gelového lože. Nerovnoměrné Části gelového lože maaí sklon na obou koncích kolony, takže je snadno části gelového lože přemístit do pomocné kolony. Proto, když se přemístěné nerovnom^irné části gelového lože, odstraní, odstraní nerovnoměrné části gelového lože společně s možno tyto nerovnoměrné pomocná kolona obsahující se tím snadno a dokonale pomocnou kolonou.

podle vynálezu, se s výhodou může připravit až 4,0 násobku onoho množství gelů, které

Suspenze gelu, kterou se naplní kolona smísením gelů v mnnožsví, odpovídá jícím 1,1 se má naplnit do kolony, s disperzním prostředím, kterým je totéž rozpouštědlo jako plnicí kapaliny, k vytvoření sloupce gelů. Objemová koncentrace suspenze je vhodně v rozmezí 3 až asi 30 %. Těsně před vlitím gelové suspenze do plnicího zařízení je výhodné gely dokonale rozppýýit v disperzním prostředí pomocí ultaazvukových vln nebo jiným vhodným způsobem. Po převedení gelové suspenze do plnicího zařízení se celé plnicí zařízení uvede do stavu, aby bylo schopné snést tlakové zatížení během doby plnění.

Ona část způsobu přípravy kolony pro kapalinovou cUromíaoorajii, která spočívá v převedení suspenze gelů do kolony plnicí kapalinou, vedenou plnicím zařízením a kolonou za současného odvádění kapaliny ze suspenze jakož i plnicí kapaliny přes filtr upravený v první koncovce na dolním konci kolony, slouží pro přeměnu gelů v podobě suspenze na gelové lože. Tento postup představuje zlepšení oproti dosavadnímu stavu techniky.

Jak již bylo výše uvedeno, spočívá v tom, že se plnicí kapalina o objemu, rovnajícímu se jednonásobkn až třtiaasSso^bku vnitřního objemu kolony, vede kolonou průtokovou rychUostí 0,2 až 1,5 m.U od začátku přivádění plnicí kapaliny, aby se zabránilo vytvoření nerovnoměrného gelového lože v počátečním stádiu plnicího postupu. Jestliže průtoková rychlost plnicí kapaliny je nižší než 0,2 íU, nejen že se snižuje účinnost plnicí operace, avšak vznikne gelové lože o příliš nízkém plnicím poměru, což má nepříznivý vliv na stabilitu jakos^s^^i, potřebnou pro další postup.

nerovnoměrné

Jestliže průtoková rychlost plnicí kapaliny přesahuje gelové lože, jak bylo výše uvedeno. Jestliže celkový objem než vnitřní objem kolony, vzniká gelové lože nedootatečné délky a tudíž v následujícím stupni 3) dochází k nežádoucímu rychlému pohybu zbýývaící suspenze gelu do kolony, což má za následek, že tvořící se gelové lože je nerovnoměrné. Jestliže celkový objem prošlé plnicí kapaliny přesahuje třtiaasásobek vnitřního objemu 'kolony, stává se účinnost plnicí operace nežádoucně nízkou.

1,5 m/h, vzniká prošlé plnicí kapaliny je menší

Hlavním účelem té části způsobu přípravy kolony podle vynálezu, v níž se stupňovitě nebo tloSiiě zvyšuje průtoková rychlost plnicí kapaliny, je vytvvoit vysoce účinnou kolonu zvýšením plnicího pom^iru za současného zachování rovnomměnnoti gelového lože. V této části způsobu se průtoková rychlost plnicí kapaliny zvyšuje stupňovitě nebo plynule. K dosažení zmíněného účelu činí, jak již bylo výše uvedeno, maximáání zvýšení tlaku a průměrné zv^í^e^:í tlaku na 1 metr gelového lože, vyvozovaného proudící plnicí kapalinou na vstupu plnicího zařízení, nanejvýš 6 MPPamin u mmximálního zvýšení tlaku a 0,2 až 8 MPp^aU ¹ u průměrn^éuo zvýšení tlaku na ¹ mmtr ^gelov^éUo l.o^že. '

Jestliže mmaiímání zvýšení tlaku na 1 m délky gelovéUo lože přesáhne 6 MPPamin je pravděpodobné, že bude narušena rovnoměěnoot gelového lože. Jestliže průměrný vzrůst tlaku na 1 m délky gelového lože je nižší než 0,2 MPa, snižuje se účinnost plnicí operace. Jestliže průměrné zvýšení tlaku přesáhne 8MPa, je nevýhodné vytvoření nerovnoměrného gelového lože pravděpodobné. Opprace zvyšování tlaku se přeruší, jakmile plnicí poměr gelového lože dosáhne požadované hodnoty.

Podle potřeby se pak nechá po několik hodin kolonou procházet plnicí kapalina průtokovou rychlosti, která není vyšší než maaimální průtoková rychlost, které bylo dosaženo během doby, kdy plnicí kapalina procházela kolonou k dosažení požadovaného plnicího pomáru, a při níž nedochází k vracení části gelového lože z kolony zpět do plnicího zařízení (obvykle je tato průtoková rychlost nanejvýš poloviční oproti máximáání průtokové rychlost), aby se vytvořené gelové lože stabilizovalo. Pak se hlavní kolona o^f^c^š-í od plnicího zařízení a otevřený konec kolony se uzavře druhou koncovkou mající filtr s póry o průměru v rozmezí 2 až 10 .um.

Okarnáik, kdy se má postup zvyšování tlaku ukoonit, se snadno zjistí vzhledem k výše uvedenému předem získanému vztahu mmzi maximálním taakem nebo průtokovou rychlosti a plnicím pom^irem. Vztah mmzi maximálním tlakem nebo průtokovou rychlostí a plnicím poměrem je možno zžistit mmtodou, při níž se nejprve připraví řada plněných kolon tím, že se kolony plní při různém maximálním tlaku nebo při různé maa1ш01п1 průtokové rychlosti a pak se výše popsanou metodou plnicí poměry těchto kolon. Naatavení plnicího poměru kolony podle vynálezu je možno snadno dosáhnout tím, že se plnění kolony provede za mmaimmáního tlaku nebo průtokové rycHoosi, jež odpooídaaí předem určenému plnicímu pommru podle výše získaného vztahu.

Jako plnicí kapaliny je možno použžt vody nebo různých vodných roztoků. Dogogučuje se však používat roztoků pufrů nebo vodných roztoků organických a anorganických solí v v konccenraci ^ppesahnuící 1 moS.litr , poněvadž je nutno se vyhnout podmínkám, které by mohly vyvoOat nadměrné vzdutí gelů ve srovnán:! se vzdouváním gelů obvykl.ým při chromatografii.

Výhodnými rozmary kolony podle vynálezu jsou: vnitřní průměr v rozmezí 4 až 50 mm a délka 100 až 600 mm. Je možno pouužt trubic z nerezavvjící oceei, skla, polyetylénu nebo jiného ůattriάlž, avšak při volbě ma^eHiu trubky je třeba přihlédnout ke druhu eluiního činidla a k tlaku, použitému během doby plnění gelu a při chromatoorafovánn.

Při používání kolony podle vynálezu pro praktické provádění chromaaoggafování je jako eluiního činidla možno použžt vody, různých roztoků pufrů a různých vodných roztoků a/nebo anorganických soOÍ. Přesto však je kolony m^žno výhodně pouužt nejen pro provádění běžné rozdělovači ^01^^0^10, při níž se používá polárního rozpouutědla, ale i pro kommbnaci gelové permeační chgomaaoggafie s rozdělovači chromátooraafi, při níž se používá výše uvedených vodných roztoků s přídavkem vhodného mnnšžtví organického rozponutědla.

DDle se vy^i^^lez týká ještě metody analyzován:! složek krve, kterážto metoda spočívá v tom, že se vyvine chromátogram krevního séra na koloně pro kapalinovou chrgmátogrrafi zahrnující gelové lože z pórovitých gelů obsah^ících vinylalkoholové jednotky, přičemž gely maaí hmmOnootní střední průměr zrn v rozmezí 4 až 20 ^m a gelové lože má plnicí poměr 0,66 až 0,78 a stupeň rovno^měr^n^os^:) v rozmezí 2,0 až 4,0, který je definován výrazem

HETP/Dp , kde

HETP znmmená výškový ekvivalent toor^ti^i^céíOD pataa koOony a

Dp znmmená hmotnostní steddní půůměr znr. rtžu.

Kolona podle vynálezu je vysoce účinnou kolonou pro kapalinovou chrgmátograafi, schopnou účinně rozdělovat různé iontové a ^iontové látky příOomné ve vodě nebo vodný roztok organických a/nebo anorganických solí. Kolona podle vynálezu pro kapalinovou chromatografii je obzvláště vhodná pro rozdělování nebo pro rozdělování a. iаennifiCаcl složek krve, kterýžto účel již delší dobu vyžadoval řešení. Když se provádí rozdělování složek krve nebo rozdělování a identifikace složek krve způsobem podle vynálezu, je výhodné, jestliže se pro rozdělení rozpuštěných 11ПгС majících moOeCulovou hmoOnnot, odppoídající moOeCulové amoUnnuSi albuminu, nebo molekulovou vyšší než je molekulová h^oor^c^s^lt albuminu, použije kolony obsahu^cí gely o exkluzní mezní hodnotě mooekulové amoUtooSi (vztaženo na dextran) alespoň 100 000, pro rozdělení rozpuštěných látek o moUetulové hmotnos!, udppuvdfríií mooekulové hmotno&ti albuminu, nebo o mooekulové hmoUnouti 100 až mol-ekulová Urnoonost albuminu se pouuije kolony obsaha^cí gely o exkluzní mezní hodnotě mooekulové hmoUnooSi (vztaženo na dextran) 100 000 nebo méně, jakožto elučního činidla se použije různých vodných roztoků organických a/nebo anorganických solí nebo jejich sm^E^í v koncentraci od 0,05 do 0,5 moUu.llta ¹ a jakožto detektoru se pouuije ultrafrlUvvéau sp^I^t^rufotometru.

Jak již bylo výše uvedeno, pocidailo se kolonou podle vynálezu a způsobem podle vynálezu pro její přípravu společně vyřešit stávající problémy v této oblasti. To má pro praktické pouužtí velké výhody. Charakteristickým význakem vynálezu je, že gely, používané jako náplň do kolony podle vynálezu, obsáhnií netont.ové vinyl alkoholové skupiny v kostře polymeru, takže adsorptivnost rozpuštěných látek ve vodném roztoku na gely je nízká.

Z toho plyne, že bylo um^^i^iěno provádět přímou analýzu krevního séra ap^<^., která byla až dosud obtížná pomocí rozdělovači iaruInaaougafie nebo adsorpční caromarturrrie, takže je možno získat údaje týkající se jednotlivých složek krve, často údaje, umožňujcí stanovit jejich molekulovou amoUnout. Podle vynálezu je možno připravit kolonu obsahnuící rovnoměrné gelové lože o vysokém plnicím poměru způsobem, při němž je při vytváření kolony nutno se vyhnout náhlé změně průtokové rycla 1 osti nebo tlaku na gelové lože během plnicího postupu, čímž se um)2^r^:í zároveň zlepšit rychlost eluce a prodloužit životnost kolony, čehož nebylo možno dosáhnout pum^u^:L obvyklých gelových permeačních kolon s vodným rozpouštědlem. Dalším charakteristitkým znakem je, že u kolon gelů o malém průměru zrn, které se proto vyznačuj kromě výše rozdělovači účionouSí.

podle vynálezu se používá uvedených výhod zvýšenou

Vynález je Híže objasněn dále uvedenými příCL.rdj, které neomezuj í.

však jeho rozsah nikterak

Příklad 1

Směs 80 g divinyladipátu (o čistotě vyšší než 99 %, 200 g n-butiy láce tátu , 6,4 g polyvinylacetátu (o polymeračním stupni 500) a 1 g 2,2'~rzulLstsuluty jouO.trtLl. se při te^plo^{tě 70} °C ^po^lymeruje v sus^nzi ^{20 h}odin v 1^,2 ¹ vody obsahnuíc-á ^^vin^ntotol v hmc^o^i^coístní^m mnočžtví 1 % jakožto stabilizátor suspenze, čímž se získá poly(. Po skončení polymerace se vzniklá zrna isolují odiilauováním, prommyi nejprve vodou, pak metanolem, načež se vysuší.

Suchá zrna se pak nasypou do baňky s kulovým dnem o objemu 2 litrů spolu s 1 lireem metanolu, obsahujícím 32 g hydroxidu sodného, a vzniklá směs se zahřívá 24 hodiny za míchání prii te^plot^{ě 40} °C. Po stončeni reatoe se vzniHá zrna od^lt^jí a ^om^í mmtrnol·em^, pak acetonem.

Takto získaná polyvinylalkoholová zrna se vnesou do baňky s kulovým dnem spolu s s kapalnou smějí, sestává jící z 350 ml dimeey lsulfoxidu, 350 ml acetonu, 37 g opichlorhydrinu a 16 g hydroxidu sodného, a vzniklá směs se zahřívá 24 hodiny za míchání při teplotě 50 °C. Po stončení reatoe se vznitoá. zrna odfiltrují a ^důkla^dn^{ě p}rumyjí nej^prve tortou vodou, pak acetonem. Tento reakcí, filtrační г promývací postup se ještě způsobem, jak výše popsáno.

jednou opakuje

Zís^kan^á zrna se ^pa^k 24 tořny za míchání zaai^ívaří při. teptoto ⁸⁰ °C 1 N roztokem hydroxidu sodného, načež se pak zrna důkladně promyjí vodou. takto získaných zrn se stanoví pomocí přístroje Coulter Coomner Model ZB' Electronics lne.; činí 12,3 yum.

spoiLu s vodným

Střední průměr (výrobce Coulter

I

Výše v popisu popsanou metodou se určí hodnota W_D jako 1,⁷⁵ ml.^g-1. část získaných к θ gelů se nechá reagovat v pyridinovém rozpouštědle při teplotě 90 °C s anhydridem kyseliny octové a z mnossví zreagovanVho anhydridu kyseliny octové se vypočte koncentrace (q_„) — 3 OH skupin, která činí 9·, 1 mmkv.g” .

g takto získaných vysušených zrn se ponoří přes noc do 100 ml destioované vody a nechá nabobtnat. K jednomu konci kolony o vnitřním průměru 7,5 mm a o délce 500 mm se připojí první koncovka opatřená fi-ltiem s póry o průměru 5 yum a druhý otevřený konec kolony se spoňí s plnicím zařízením o vnitřním otjemu·100 ml. Plnící zařízení je ve své horní čássi opatřeno vstupem pro suspenzi gelu, vstupem pro plnicí kapalinu, který je ’ spojen s plnícím čerpadlem trubkou z nerezzavjící occei, a manommtrem. Po nea-tí suspenze gelu do plnicího zařízení je toto možno uzaavít. Výše uvedená suspenze nabobtnalých zrn gelu se podrobí po dotu 10 minut dispergování pomooí ultazvunkového čistíchho zařízení Branson B-12 (výrobce Branson Cleaning Equipment Company, USA) a vlije do plnicího zařízení vstupem pro suspenzi gelu.

Pak se plnicí zařízení uzavře. Poté se plnicím zařízením a kolonou nechá procházet ^po ^do^bu 60 minut desti^vaná voda (plnicí. tapalin^ ^pr^ůtokovou rychlostí 1,0 ml.min ” A [LV ^ine^ní rychlost): ^1,36 m.^{h ]} . Nato se ^to)^ ryclhlost ^dest^ovairé vody zv^yšuje ^při ^pr^ůměrn^ém růstu · tlaku 2 MPa-^{h 1} na ¹ metr ^gelov^ého З-o^ a ^při maximálním růstu tlaku 2 MPa^in ¹ na · ¹ mm^ ^ge].ov^ého ^Lo^ tak d^lnu^hn^, a^s manoom^ uká^se ^přetlak ^8,5 MPa. Po další 3 hodiny se nechá protékat des^^vaná voda, přčeemš přetlak se udržuje na 8,5 MPa regulováním mnnOssví destiOované vody dodávané čerpadlem.

Po zastavení průtoku desti0ovаiV vody se kolona odpojí od plnicího zařízení a na otevřený konec kolony se nasadí druhá koncovka, maáící stejnou strukturu jako první koncovka. Tím je plněni kolony skončeno. Vyrobená kolona má hodnotu HETP/Dp 3,3, hodnotu Vi/Vo

1,54 a exkluzivní mezní hodnotu mooekulové hmoonnosi (vztaženo na dextran) přibližně 2 000 000.

Na koloně, připravené jak výše popsáno, se chromaatogafuje vodný roztok komerčního nh^yroglobul·iiu, albuminu, mmoolobtuinu a fe^^lani-nu, získaný chromatogram se vyvine a eluuje ^pufrovým roztokem ýselin⁰ fosforeč^ o mc^ární konceerraci 0^,°⁵ mml.litr ¹ a o pH 6^^, který o^ahaje síran sodný v konceetraci ^0,2 mm^olitr ^{1 p}ři ^pr^ůtokov^é ^chlosti 1,0 ml.min ¹ . Jak je patrné z chromatogramu na obr. 2, je jedno^^vé složky možno rozdě^t velmi účinně, př^emž se získaj postupně v pořadí svých mmlekulových hmonrюnSÍ. Doba potřebná pro analýzu je pouze 20 minut. , (T - ^отд^Ь^^, A - α]^bum.n, M - o^yooloOtUin, P - ^^ΙιΙιζϊζ)

Příklad 2

Do válcové nádoby o objemu 2 litrů se vnese kapalná směs, settááolící ze 100 g vinylacetátu, 32,2 g nrlal0^ylήso0linurStu (číslo X: 0,25), 100 g i-tutolaettStu a 3,3 g 2,2'-azonisSaontU^yoonitniiu spolu s 0,8 litru vody, obsaahjjcí oolooiioialknhnl v famonnotní * jakožto stabilizátor suspenze. Výsledná směs se míchá, čímž se získá stabilní sus^nze. Pak se tato sus^nze zahř^ ^{18 h}odin ^při ⁶⁵ °C; v zahříval se pak ^pokraču^je za míc^ní ^při ti^lot^ ⁷⁵ °C ^po do^bu ⁵ ^din, ^oři^eem^ž pro^^e ^lymerace v v sus^nn^. Po skončení pol^omerace se vzniklá zrna o^ffl^trujír promyOÍ nejprve vodou, pak metanolem, · načež se vysuší.

Vysušená zrna se vnesou do baňky s kulnoiýýo dnem o objemu 3 litrů spolu se 2 litry metanolu, obsahhuícího 47 g hydroxidu sodného, a vzniklá směs se zahřívá za míchání při ttolnně 15 °C po dobu 20 hodin, čímž proběhne ořeetanerfikačií reakce. Sedioetnací ve vodě se získaj gely (Dp: 9,8 /m, Dp/Dn: 1,28). Tyto gely maj konceenraci hydroxylových s^pin ^7,3 mekv.^{g 1} a ^hodnctu W_R ^1,58 ml.g A 13

Pak se ze získaných gelů naváží tři dávky po 7 g (v suchém staeu). Každá z těchto tří dávek gelů se ponoří do 100 ml vodného roztoku síranu sodného o mlc^i^ní konccetraci 0,2 mol.litr \ ^kde se ^ponec^há přes noc, načež se 5 minut disperguje ^pomocí u].tazeuukov^ého homoggečiátoru typu US-300 (výrobce Nippon Seiki Seisakusho KK, Japonsko). Každá z výsledných tří gelových suspenzí se pak vlije do plnicího zařízení, napojeného na předběžnou kolonu o délce 100 mm a o vnitřním průměru 7,5 mm, která je nasazena na jeden konec hlavní kolony z nerezavvjící oceli o vnitřním průměru 7,5 mm a o délce 250 mm? hlavní kolona je na svém druhém konci opatřena první koncovkou s filteem, tak jako v příkladu 1.

Jak předběžná kolona, tak hlavní'kolona byly předem naplněny vodným roztokem síranu sodného o mo^rní konccetraci 0,2 moHitr , Po uzavření plnicího zařízení se tímto zařízením, předběžnou kolonou a hlavní kolonou nechá po dobu 60 minut procházet vodný roztok síranu sodc^éh^g (plnicíí kapalina) o mmfární ^ncce^aci ^0,2 mmLHtr \ ^do^dávaný ^čer^pa^dlem. Bě^hem těchto 60 minut vstupuje suspenze gelu do hlavní kolony, přičemž z ní první koncovkou nasazenou na dolním konci hlavní kolony vytéká vodný roztok síranu sodného o mólární koncentraci 0,2 moHitr” ¹ , obsažený jednak v suspenzi, gelu, jednak použitý jako plnicí kapalina; tím se v hlavní koloně vytváří gelové lože.

Pak se průtoková rychlost vodného roztoku síranu sodného o mo^rní ^nece^aci

0,2 moUč-tr ” ¹ postupně zvyšuje při průměrném růstu tlaku 0,5 MPp.h ¹ na 1 metr gelového lože a při maximálním růstu tlaku 0,5 MPp.mic 1 na 1 metr gelového lože tak dlouho, až pře-tlak, indikovaný manommtrem jako v příkladu 1, dosáhne 2,6, 4,6 resp. 5,7 MPa. Plnicí kapalina se nechá procházet kolonami po další 2 hodiny, přičemž se udržuje uvedený přetlak. Pak se plnicí zařízení a předběžná kolona odpoj a na každou z hlavních kolon se nasadí druhá koncovka k zadržení vzniklého gelového lože.

Tyto kolony se podrobí zkouškám ke zjištění jejich charakteristčckých vlastností a praktické použitelnooti. Výsledky těchto zkoušek jsou příznivé. ChharaCeetsticCé vlastnosti těchto kolon podle vynálezu jsou uvedeny v tabulce I.

Tabulla l

Kolona č.	HETP/Dp	Vi./Vo	Pd
1	2,95	1 ,34	0,67
'7	2,30	1,61	0,71
3	3,34	1,90	0,74

Všechny tyto kolony maaí vylučovací mez mdekulové hmoUncuti (vztaženo na dextran) přibližně 30 000.

Na koloně c 1 se vyvine směs komeečního gammaglobbžicu, albuminu z krevního séra hovězího skotu, albumin z vaječného bílku a myogloOužinu, a eluce se provede za pouužtí vodného rgztgk^ι chloridu sodného o mcděmí 0,3 moLUtr ³ fosforečnanu sodného o molární Conccetraci 0,1 moHitr o pH 7,0 jakožto el-učního činidla. Každá z uvedených složek se získá téměř ve 100% шпс^Ы. Všechny tyto bílkoviny se získají v pořadí svých moo.ekulových hrmotos!.

Na koloně č. 2 se vyvine 100 mitcrlittů (1 mg) vodného roztoku etylecglyCglu o hmotnostní Conccetraci ¹ % a eluce se provádí ph teplot I⁵ °C destitovanou vofou pH p^tokové rychhosti 1,0 ml.min 1. Ze získaného chromatogramu se určí hodnota HETP. Tento postup se 800krát opak^e. Stanovené hodnota HETP jsou v rozmezí 24,5 až 25,6^um. Nemmnccgt hodnot HETP může být považována za důkaz prodloužené iieotcoltt kolony a za důkaz, že při dlouhodobém používání kolony nedochází k snížení ύό^ηο^ί kolony.

Kolonou Č. 3 se nepřetržitě provádí vodný roztok síranu sodného o molární koncentraci 0,2 moii.tr při průtokové rychlossi 1,2 ml.min po dobu 24 0 hodin ; po uplynutí téoo doby se zjistí příznivá hodnota HETP 32,9/um (HETP/Dp = 3,36), přičemž nelze zjistit žádné snížení účinnooSi kolony.

Příklad 3

Na spojených kolonách i. 1 a i. 2, připaavtných postupem podle příkladu 2, se vyyííí lidské krevní sérum, a eluuje při pH 7,0 vodným roztokem chloridu sodného o mooární koncentrací. ^0,3 mol.Htr ¹ a fosforečnanu so^dn^ého o moUrní ^konceenraci 0Д mooiltr’^{1 p}ři ^řr^ůto^kov^t r^ychlos^si ^1,0 . ml.min ¹ za ^pooižití ultra^ili^ovtёho spekSro^SomeSru jakožto detektoru ^při vlnové délce 250 nm. Na obr. 3(a) je znázorněn chromatogram normálního lidského krevního séra, získaný výše popsaným postupem, a na obr. 3(b) je znázorněn chromatogram séra po selhání ledvin.

Na tomtéž výkresu jsou uvedeny dva chromatogram^y, získané při různé seenstivitě detektoru, na nichž jsou společně naznačeny větší a menší složky séra. Z těchto chromatogramů je patrné, že kolona podle vynálezu pro kapalinovou caromaatogaafi se vyznačuje v^ynňkaaící rozdělovači účinnootí a že je obzvláště vhodná pro rozdělování smmsi, obsa^u^ích mnoho druhů rozpuštěných látek, jako je například krev.

Srovnávací p řík a a d 1

Z gelů, získaných podle příkaadu 2, se naváží 10 g gelů, které se necha^ botnat, a dispergovat postupy, popsanými v příkaadu 2, načež se vnesou do plnicího zařízení spojeného s kolonou o vnitřním průměru 7,5 mm a o délce 500 mm. Suspenze gelu se z plnicího zařízení přenese do kolony, peiPemi se tlak na vstupu do kolony udržuje na 7,0 MPa. Plnící kapalina se provádí kolonou po dobu 4 hodiny, p^eemž se udržuje uvedený přetlak. Pak se na naplněnou. kolonu nasadí druhá koncovka k zadržení vytvořeného gelového lože. Získaná kolona má hodnotu HETP/Dp 7,1. Na této koloně se caromaloorafиje týž vzorek séra (pacienta, trpícího selháním ledvin) jako v příkaadu 3 a za týchž podmínek, jakých b^ylo pouužto v v případu 3. Získaný chromatogram je znázorněn na obr. 4. Z porovnání chromatogramů na obr. 4 a obr. 3(b) je patrné, že plněná kolona podle vynálezu se vyznačuje mnohem vyšší rozdělovači účinnoosí než kolona, získaná v tomto srovnávacím příkladu 1.

Příklad 4

Do 'baňky se vnese směs, seesáávjící ze 100 g vin^yilcttátu, 41,4 g triai.l^ySisoklnnžrátž, 70 g n-butylacetátu a 3,3 g 2,2^,-lioUiiSso0už^yrouitrrlž. . Polymerace v suspeeni, přppstprifUování a sedimentace produktu se provedou prakticky stejně jako v příkaadu 2, čímž se získaaí gely, maaící hodnotu Dp 9,4zum. Tyto gely se vyznaa^í konceenraci hydroxylových skupin ^7,1 mekv.g ¹ a todnotou WR ^1,20 mi.^{g 1 Z tě}c^hto gelů se odváží ¹3 ^g; tato d^ávka se vnese do kolony z nerezaa-v^ící occPí o vnitřním průměru 7,5 mm a o délce 500 mm týmž postupem jako v příkaadu 1, čímž se získá plněná kolona, vyzna^ujcí se hodnotou HETP/Dp 2,75 a hodnotou Vi/Vo 1,55.

Za.pouužtí této kolony se chromaloogafžjρ sérum pacienta, trpícího selháním ledvin prakticky, týmž postupem jako v příkaadu 2, jen se lnaaýzl provádí při větší průtokové rychhoosi elučního ^п^11. Obr. 5(a) znázorňuje chromaSogram, získaný při průtokové rychhoosi plučníao činidla 1,0 ml.min ¹ zatímco obr. 5(b) znázorňuje chromatogram, získaný při ^pr^ůtokov^t rychhossi pIu^í.^ činiHa ^2,0 ml.min ¹ Z c^hromato^gramu na obr. 5(^bh získan^ého ^při ^k. v^ysok^é pr^ůSokov^t rychiosH ej-u^íbo (činela jako je ^2,0 ml.min ¹ co^ž odpovídá lineární rychlossi 2,72 m.h.¹, vyplývá téměř stejně vysoké rozdělení jako na chromatogramů obr. 5(a), získanému při průtokové rychhoosi elučního činidla 1,0 ml.min

Z toho je patrné, že plněná kolona podle vynálezu umožňuje vysokorychlostní chromatografii s vysokou rozdělovači účinnoosí. Kromě toho si kolona i po chromatografování 150 vz^irků krevního séra při průtokové rychlosti 2,0 mimin¹, podržuje původní rozdělovači schopnost a účinnost, kterou se vyznačuje ihned po své přípravě. Toto dokládá prodlouženou životnost plněné kolony podle vynálezu.

Příklad 5

Směs, sestávaaící ze 100 g vinylacetátu, 32,2 g trialCyiSsoCyanátu (stupeň příčného zesítění: 0,25), 40 g n-butylacetátu a 3,3 g 2,2’-azobisissbutycrsiitilu, se polymeruje v suspenzi, sfiltruje, produkt se extrahuje, přeesterifikuje a sedimentuje v podstatě maa^í hodnotu Dp 13 /um, hodnotu g ¹ a hodnotu W_ 1,05 ml.g

K týmž způsobem jako v příkladu 2, čímž se získají gely, Dp/Dn 1,32, koncentraci hydroxylových skupin 8,2 mekv.

Takto získanými gely se plní kolona o vnitřním průměru 7,5 mm a o délce 500 mm v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, čímž se získá plněná kolona o hodnotě HETP/Dp 3,4 a hodnotě Vi/Vo 1,20. Na této plněné koloně se chromtoogafuje vodná směs N,N'-dimetyl-4,4'-bipcriSc.lUuěcllrriSu (NQ) , N“menyCl44 (44ppcidyl)pcriSiniumchloridu (MQ) a N-mmeylpyridiaiumchloriSu (MS), která se získá při výrobě chemické sloučeniny, určené pro zemmddlské pouuiií, přičemž eluce vzniklého chromatogramu se provádí vodným roztokem chloridu sodného o mo^rní Jkonchn^jrtci ⁰,3 moKlitr p^ři ^totové r^ychlos¹,⁰ ml.min \

Získaný chromátogram je znázorněn na obr. 6. Na chromatogramu jsou zřetelně patrné jedno tlivé složky směi.. Tento příklad dokládá, že plněné kolony podle vynálezu je možno účinně pouuít též pro frtOhirjtci a iSenjifiOthi elektrolytů o nízké mmlekulové ^m^nosi.

Claims (12)

1. Kolona pro kapalinovou hlrommtorratfi, s gelovým ložem z pórovitých gelů obsahnuících vinyltlkrlrlrvé jednotky, vyznatcjíhí se tím, že gely maaí ^α^ο^ηί střední průměr zrn

4 až 20 ^m, přičemž gelové lože má hodnntu plnicího pommru v rozmeeí 0,66 až 0,7 8 a stupeň rovnomměnnoti v rrzж?;íí 2,0 až 4,0 definovaný poměrem

HETP/Dp , ve kterém

I1ETP znamená výkRový ekvivalent neoneihoélro patra a

Dp znmniená hmotnostní sředdní půmměr zrn geůů.

2. Kolona podle bodu 1, vyznáačuicí se tím, že gely maaí lmornj)rtní střední průměr zrn v rozmezí 6 až 15 yium.

3. Kolona podle bodu 1 a 2, vyznnaující se tím, že se gely odvoonuí od homopolymeru nebo kopolymeru vinclktrbrxylátu.

4. Kolona podle bodu 3, vyznatující se tím, že kopolymerem je kopolymer vinyLkarboxylátu se sííujícím monomerem obsahujícím isrkctnurátový kruh.

5. Kolona podle bodu 3, vyznatcljíhí se tím, že kopolymerem je kopolymer vinclktrbrxylátu se sířujccím monomerem obsahujícím kyanurátový kruh.

6. Kolona podle bodu 4, vyznaačuící se tím, že sítujícím monomerem obsahujícím isokyanurátový kruh je trialCyiisokctauuáál

7. Kolona podle bodu 3, vyznatčUící se tím, že vinylOarbrxylátrvý kopolymer je odvozen od monommru obsahuuícího alespoň dvě esterové skupiny

8. Kolona podle bodu 7, vyznačující se tím, že monomerem obsahujícím alespoň dvě esterové skupiny viaylkarboxylátu je diviaylacetát.

9. Kolona podle bodů 1 až 8, vyznačující se tím, že gely mají zádrž vody v rozmezí 0,6 až 2,0 ml.g ¹ a gelové lože má hodnotu poměru Vi/Vo, ve kterém Vi znamená vnitřní objem uvnitř zrna gelu a Vo znamená prázdný objem mmzi zrny gelu, v rozm^j^JÍ 1,0 až 2,0.”

10. Kolona podle bodů 1 až 9, vyznna^ící se tím, že gely mají konccetraci UydroxylovýcU skupin v rozmezí 3 až 15 mekv.g .

11. Kolona podle bodů 1 až 10, vyznačující se tím, že gelové lože má Uodnotu pLíí^cj^U^o poměru v rozmezí 0,68 až 0,74. .

12. Způsob přípravy kolony pro kapalinovou cUiroi^m^ctogčiaÍj- podle bodu 1, při němž se do plnicího zařízení, odppjitzlilě spojeného s kolonou, která má na svém dolním konci první koncovku opatřenou fi-tt^em, vnese suspenze pórovitých gelů obsahuuícÍcU vityLčlkoUolové jednotky, načež se plnicí zařízení neprodyšně uzavře s výjimkou výstupu pro suspenzi a vstupu pro plnicí kappainu, pak se plnicí kapalinou, vedenou plnicím zařízením a kolonou, převede do kolony suspenze gelů za souUasnéUo odvádění kapa^ny ze suspenze jako i plnicí kappainy přes filtr, upravený v první koncovce na dolním konci kolony, čímž se v koloně vytvoří gelové lože, poté se stupňooitě nebo spp^itě zvyšuje průtoková rycUlost plnicí kappainy, načež se kolona odppóí od plnicíUo zařízení a ke koloně se na jejím Uorním konci připojí druUá1 koncovka opatřená fitteem Čímž se v koloně zadrží vytvořené gelové lože, vyznač^ící se tím, že plnicí kapalina pouuitá k převedení suspenze gelů do kolony se v objemovém mn^^ví, rovnajícím se jednonásobku vnitřníUo objemu kolony, vede kolonou ^pr^ůtokovou rychlost 0^ a^ž 1^,5 m.^¹ o^d začátku ^přiv^ádění ^^nLc^í ^pp^ny^ рШепгё ^při stupňovitém nebo spojitém zvyšování průtokové rychlossi plnicí kappainy činí maaxmáání zvýšení tašku a průměrné zvýšení taciku na 1 meer gelovéUo lože, vyvozované proudící plnicí kapalinou na vstupu pIíícíUo zařízení, nanejvýš 6 MPa.min · ¹ u mihimiáníUo zvýšení tašku a ^0,2 a^ž 8 MPa^”¹ u ^^ěrn^o zvý^ní -t-laku na ¹ me^ ge^v^o 1o^žz.