CS248535B1 - Způsob fyzikální imobilizace živých beněk do vrstvených pelet a zařízení k provádění tohoto způsobu - Google Patents

Abstract

Řešení se týká fyzikálního způsobu imobilizace živých buněk do dvou resp. vícevrstevných pelet a zařízení k provádění tohoto způsobu, přičemž imobilizované buňky v těchto peletách jsou využitelné k průmyslovým biotransformacím, resp. biokonversím, zejména pro kvasné a biosyntetické procesy. Podstata řešení spočívá v tom, že se suspenze nativních buněk prokaryontních nebo eukaryontních mikroorganismů vmíchá do vodných gelů připravených z přírodních materiálů na bázi thermoreversibilních gelů nebo iontově reversibilních polysacharidů, načež se tato směs vytlačuje středem víceproudé koaxiální· trysky, přičemž ústími trysky se společně vytlačuje gelový materiál bez buněk a vytvořené vrstvenné kapky se vkapávají do vody nebo roztoků anorganických nebo organických solí a po jejich ztuhnutí a/nebo vytvrzení se vrstvené pelety oddělí a případně dále zpevňují. Řešení je dále specifikováno poměry rychlostí vytlačování gelů obsahujícícn buňky a gelů samotných, které se nejvýhodněji pohybují v poměru 0,5 : 1. Součástí řešení je též zařízení k provádění způsobu, které sestává z centrální komory, alespoň jedné koncentrické komory ústící do -víceproudé koaxiální trysky.

Description

(54) Způsob fyzikální imobilizace živých beněk do vrstvených pelet a zařízení k provádění tohoto způsobu

Řešení se týká fyzikálního způsobu imobilizace živých buněk do dvou resp. vícevrstevných pelet a zařízení k provádění tohoto způsobu, přičemž imobilizované buňky v těchto peletách jsou využitelné k průmyslovým biotransformacím, resp. biokonversím, zejména pro kvasné a biosyntetické procesy. Podstata řešení spočívá v tom, že se suspenze nativních buněk prokaryontních nebo eukaryontních mikroorganismů vmíchá do vodných gelů připravených z přírodních materiálů na bázi thermoreversibilních gelů nebo iontově reversibilních polysacharidů, načež se tato směs vytlačuje středem víceproudé koaxiální· trysky, přičemž ústími trysky se společně vytlačuje gelový materiál bez buněk a vytvořené vrstvenné kapky se vkapávají do vody nebo roztoků anorganických nebo organických solí a po jejich ztuhnutí a/nebo vytvrzení se vrstvené pelety oddělí a případně dále zpevňují. Řešení je dále specifikováno poměry rychlostí vytlačování gelů obsahujícícn buňky a gelů samotných, které se nejvýhodněji pohybují v poměru 0,5 : 1. Součástí řešení je též zařízení k provádění způsobu, které sestává z centrální komory, alespoň jedné koncentrické komory ústící do -víceproudé koaxiální trysky.

248 555

-2248 535

Vynález se týká fyzikálního způsobu imobilizace živých buněk do vrstvených pelet a zařízení k provádění tohoto způsobu, přičemž imobilizované buňky v těchto peletách jsou využitelné k průmyslovým biotransformacím,resp. biokonverzím, zvláště pak pro kvasné a biosyntetické výroby.

Určitým pokrokem v oblasti enzymového inženýrství,resp. enzymové biotechnologie , je imobilizace enzymů nebo enzymově aktivních buněk. V prvním případě je enzym získaný procesem izolace z produkčních buněk fixován,resp. upoután /zakontven/, určitými specifickými způsoby, obvykle vazbou na,resp. do částic,ve vodě rozpustného materiálu - nosiče. V druhém případě jsou různými způsoby enzymy konzervovány,resp. fixovány,přímo v individuálních buň- kách, bez nebo za tvorby dobře sedimeptujících částic imobilizovaných buněk. Jak imobilizované enzymy, tak imobilizované buňky je pak možné průmyslově využívat mnohonásobě opakovaně, resp. kontinuálně^ cílem přípravy požadovaných průmyslově významných produktů enzymové přeměny.

Použití imobilizovaných buněk má oproti imobilizovaným enzymům řadu výhod. Nejsou to jen výhody ekonomické, v procesu výroby buněčných katalyzátorů odpadá nákladná izolace enzymů, ale i výhody další, především využití dvou, tří resp. multienzymových katalýz vedoucích k tvorbě požadovaných produktů. V tomto smyslu je použití imobilizovaných buněk ve srovnání s imobilizovanými enzymy nezastupitelné.

Způsob imobilizace buněk diktuje reálnou možnost průmyslového využití buněčných biokatalyzátorů, neboř. vlastnosti částic imobilizovaných buněk jsou způsobem imobilizace do značné míry předem určeny. Jedná se o vlastnoti biochemické, fyzikální, fyzikálně chemické a technologické. Pro průmyslové biotransforraace a biokonverze jsou nejvíce využívány imobilizované mikrobiální buňky ve formě individuálně chemicky ošetřených a stabilizovaných buněk, nebo ve formě buněčných, chemicky stabilizovaných agregátů /např. čs. autorská osvědčení č. 201 621, 197 101, 200 802, 203 607, 209 265,

218 023, 231 458, 234 059/. V převážné většině případů jsou tyto preparáty imobilizovaných buněk tvořeny mrtvými buňkami, neschopnými růstu a množení a ve většině případů v nich neprobíhá proteosyntéza. Limitem širšího uplatnění těchto typů buněčných biokatalyzátorů je jednak citlivost některých klíčových enzymů v intaktních buňkách na chemické a fyzikální působení vedoucí k tvorbě imobilizovaných buněk, jednak určité omezení v jejich využití jen

-3248 535 na poměrně jednoduché enzymově katalyzované biotransformace,např. hydrolýza, izomerace, racemizace, adice, optická rezoluce.

Další skupinou buněčných biokatalyzátorů jsou imobilizované živé buňky. Od konce padesátých let je v odborné i patentové literatuře patrná snaha o vypracování šetrných způsobů imobilizace živých buněk, převážně fyzikálním způsobem, s cílem zachování celých metabolických drah katalyzovaných desítkami enzymů a vedoucích k biotr.ansformaci substrátů na požadované, přes mnoho meziproduktů vedoucí produkty /multienzymová biodegradace, biosyntéza/. Na rozdíl od způsobů imobilizace mrtvých buněk, kde se využívá převážně metod chemických, se běžně používá šetrných fyzikálních metod, zejména zabudování buněk do termoreversibilních gelů, zvláště agaru a želatiny /např. čs. patentový spis č. 113 908 již z roku 1962/. Dále např. v obsáhlém NSR patentovém spise DOS 2 278 622 z roku 1978 jsou popsány různé techniky a kombinované fyzikální imobilizace různých živých převážně mikrobiálních buněk do různých přírodních materiálů na bázi polysacharidů, zejména alginátu, κ-carrageenanu, furceleráhu a různých *dalších iontově reversibilních gelů a jejich využití pro cílené biotransformace a biokonverze, pro kvasné procesy a biosyntetické výroby.

Imobilizované živé buňky se převážně využívají v kvasném průmyslu, zejména pro výrobu ethanolu, methanolu, acetonu a butanolu, glycerolu, mléčné kyseliny, piva, vína, whisky a bioplynu /např. Immobilized Microbial Cells, K. Venkatsubramanien, ed., Amer. Chem.'Soc. Symp. Ser. 106, str. 1-157, Washington,' 197 9;. I. Chibata a T. Tosa, Ann.Rev.Biophys.Bioeng. 10, 197, 1981; Enzyme Engineering, Vol. 6, I.Chibata, S. Fukui a L.B. Wingard, Jr., eds., Plenům Press, New York and London, 1982; V. Vojtíšek a V. Jirků, Folia microbiol. 28, 309-340, 1983;. J. Klein a F. Wagner, Appl. Biochem. Bioeng. 4, str. 11-49, Acad. Press, lne., 1983/. V odborné literatuře, zatím na úrovni základního výzkumu, jsou popsány výsledky, s cílem využití iraobilizovaných živých buněk pro produkci biologicky aktivních látek, zejména antibiotik, vitaminů, hormonů, alkaloidů a extracelulárních enzymů /např. v; Biotechnology of Industrial Antibiotics, Drugs and the Pharmaceuticai Sciences, Vol.

22, E.J. Vandamme, ed., str. 762-780, 1984/. Z hlediska využití imobilizovaných živých buněk, zejména kvasinek, lze uvést např. aplikaci iraobilizovaných buněk do alginátu při využití specifického zařízení, pro výrobu vína a piva podle čs. autorských osvědčení č. 234 226 a č. 238 076.

248 535

Podle uvedených a dalších patentových a literárních údajů se při imobilizaci do thermoreversibilních gelů /např. ager, želatina/ obvykle postupuje tak, že do teplého gelu se vmíchají celé buňky obsahující požadované enzymy a směs se nechá ztuhnout při pokojové teplotě nebo se vymrazuje. Po ztuhnutí thermoreversibilních gelů se ztuhlý koláč obvykle mechanicky dále zpracovává se zřetelem na velikost a tvar částic, např. řezáním na částice různých tvarů. Pokud jde o způsob imobilizace buněk do intově reversibilních gelů na bázi polysacharidů /např. alginát, κ-carrageenan/, opět se buňky s požadovanou enzymovou aktivitou vmíchají za pokojové nebo mírně zvýšené teploty do těchto materiálů a suspenze se obvykle vkapává např. injekční stříkačkou do roztoků anorganických solí jejichž volba závisí na charakteru použitého materiálu /např. CaC^r MgCl₂, /NH^^SO^, KC1 apod./, čímž dojde k vytvrzení kapek ve formě sférických nebo vejčitých pelet /částic/ při teplotě místnosti nebo za chladu. Je pochopitelné, že distribuce individuálních buněk v popsaným způsobem získaných Částicích je nerovnoměrná a část buněk v částicích, je imobilizována na okraji částice případně velmi blízko směrem k povrchu pelety, takže buňky se z částic snadno uvolňují.

V citovaných a dalších pracech z odborné a patentové literatury je «zřejmé, že fyzikální, způsob imobilizace do thermoreversibilních přírodních materiálů a do iontově reversibilních přírodních ma teriálů na bázi polysacharidů je běžně znám. Nevýhodou popsaných postupů imobilizace živých buněk v uvedených a dalších materiálech je však nízká mechanická pevnost částic imobilizovaných buněk a pře devším růst a množení buněk v částici, čímž dochází v poměrně krátké době k značnému uvolňování, buněk do externího prostředí a ve svých důsledcích k rozpadu částice, zvláště při snaze o aplikaci těchto materiálů pro kvasné procesy a biosyntetické výroby. Tato skutečnost limituje širší průmyslové využit.! fyzikálním způsobem imobilizovaných buněk.

Výše uváděné nevýhody jsou odstraněny vypracováním způsobu podle předmětného vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že se suspenze celých nativních živých buněk prokaryontních nebo eukaryontních organismů, zejména bakterií, kvasinek a hub, za teploty 10 až 50 °C vmíchá do vodných gelů připravených z přírodních materiálů na bázi thermoreversibilních polysacharidů, zejména alginátu nebo κ-carrageenanu, načež se tato směs vytlačuje středem víceproudé koaxiální trysky přičemž ústími trysky ve tvaru mezikruží

-5248 535 se společně vytlačuje gelový materiál bez buněk a vytvořené vrstvené kapky se vkapávají do vody o teplotě 0 až 40 °C nebo vodných roztoků anorganických nebo organických solí o teplotě -15 až 40 °C a po ztuhnutí a nebo vytvrzení se vytvořené pelety oddělí a popřípadě dále zpevňují sušením nebo vymrazováním.

Způsob podle předmětného vynálezu je dále vyznačen tím, Že poměr rychlostí vytlačování gelů obsahujících živé buňky a gelů samotných, měřená vytlačovaným objemem-na výstupu trysky, činí 0,1 až 1,5 : 1, výhodně 0,5 : 1.

Předmětem vynálezu je dále zařízení k provádění fyzikální imobilizace živých buněk, které sestává z centrální komory s alespoň jednou koncentrickou komorou, přičemž všechny komory jsou opatřeny přívody zpracovávaných materiálů a ústí do víceproudé koaxiální trysky, pod kterou je umístěna nádoba s vytvrzovacím roztokem.

Zařízení pro výrobu potahovananých pelet je sc'hematicky znázorněno na obr. 1.

Do centrální komory 1 se za tepla kontinuálně přivádí vodný termoreversibilní gel nebo gel na bázi iontově reversibilních polysacharidů, ve kterém byla rozmíchána suspenze celých nativních buněk prokaryontních nebo·eukaryontních organismů. Do koncentrické komory 2 se kontinuálně přivádí gelový materiál, který uvedené buňky neobsahuje. Obě media še společně vytlačují víceproudou· koaxiální tryskou 13 a vznikající vrstvené kapky _5 se nechávají, kapat do nádoby £ s vytvrzovacím roztokem, která je výhodně opatřena míchadlem. Tvar a velikost vyráběných pelet, jakož i tlouštka jednotlivých vrstev je dána jednak rychlostí vytlačování jednotlivých medií a jednak vzájemnými poměry průměrů D^ a D₂ víceproudé koaxiální trysky 3.

Výhody způsobu podle vynálezu spočívají v tom, že rigidita takto vyrobených částic je značně zvýšena a prorůstání buněk vlivem jejich množení je značně retardováno. Difúze substrátu resp. živin do dvou resp. vícevrstevných pelet a difúze produktů z těchto pelet významně neovlivňuje reakční rychlost a účinnost biotransformací zvolených substrátů na požadované produkty.

Do potahovaných pelet lze fyzikálně uzavřít buňky různých mikroorganismů, zejména bakterie, kvasinky, imperfektní vláknité houby /plísně/ individuální buňky a mycelium vyšších hub, rostlinné buňky a pod. přičemž podle volby kmene a jeho enzymového vybavení, lze těmito potahovanými peletami katalyzovat různé biotransformace a biokonverze, zejména biotransformaci organických

-6248 535 kyselin a aminokyselin, nebo imobilizované buňky použít pro kvasné procesy, zejména pro přípravu ethanolu.

Tlouštku jednotlivých vrstev pelet a do určité míry i jejich tvar lze regulovat jednak poměrem vnitřních průměrů víceproudé koaxiální trysky, jednak poměrem rychlostí vytlačování jednotlivých medií.

Příklady provedení • Příklad 1 g vlhké hmoty buněk baktérie Zymomonas mobilis, získaných odstředěním 20 h staré kultury, promytím a opětným odstředěním byl suspendován v 5 ml sterilní destilované vody.Získaná suspenze byla vmíchána za laboratorní teploty do 100 ml 3%ního /hmota/objera/ sterilního vodného roztoku Protanolu LF-10/60 /alginát sodný firmy Protan, Norsko/ a směs byla 30 minut intenzivně míchána rychloběžným rotačním míchadlem. Po zhoraogenizování byla suspenze buněk Z. mobilis v roztoku Protanalu obsahující 1 g vlhkých buněk/100 ml suspenze čerpána peristaltickým čerpadlem do centrální komory 1., současně s 3 %-ním /hmota/objem/ sterilním vodným roztokem Protanalu LF-10/60 neobsahujícím buňky, který byl druhým peristaltict kým čerpadlem čerpán do koncentrické komory 2.

Bylo použito zařízení' s rozměry koaxiální trysky 3 D^ = 1 mm a D- = 2,5 mm. Objemový průtok suspenze buněk v Protanalu měl -1 hodnotu 25 ml.h , objemový průtok roztoku Protanalu neobsahujícího buňky byl 40 ml.h \ Na výstupu trysky 2 vznikající dvouvrstvé kapky byly vytvrzovány v mírně promíchávaném 5%ním /hmota/objem/ vodném sterilním roztoku CaCl₂· Vytvrzené částice měly kulovitý tvar se střední velikostí 2,3 mm; tlouštka povrchové vrstvy částic neobsahující buňky byla cca 0,2 až 0,3 mm. Částice byly ponechány v prostředí 5%ního roztoku CaCl₂ a částice byly převedeny do vertikální skleněné kolony s temperačním pláštěm. Celkový objem kolony byl 75 ml, objem částic ve vrstvě byl 56 ml. Do spodní části kolony pod lože dvouvrstvých částic byla kontinuálně přiváděna sterilní fermentační půda o složení: D - glukosa - 150 g/1, kvasničný extrakt 10 g/1, KH₂PO₄ - 1 g/1, /NH₄/₂SO₄ - 0,5 g/1 a, MgSO₄.7H₂O - 0,5 g/1, pH - 6.

Výstupní proud byl odváděn společně s C0₂ v horní části kolony, jejíž teplota byla udržována na hodnotě 30+1 °C. Ve výstupním proudu byla sledována zbytková koncentrace glukózy, koncentrace

-7248 S3S ethanolu a mikroskopicky přítomnost volných buněk Z. mobilis. Objemový průtok fermentační půdy kolonou byl udržován na hodnotě 6 ml/h \ tomu odpovídá hodnota zředovací rychlosti D = 0,316 h V průběhu prvních šesti dnů ferraentace koncentrace ethanolu Ve výstupním proudu postupně vzrostla nad hodnotu 6,4 g/1 a potom došlo k jejímu ustálení v rozmezí 6,4 až 6,7 g/1. Produkce ethanolu tudíž činila 85 $ z teoretické hodnoty. Koncentrace glukózy ve výstupním proudu poklesla postupně ve sledovaném období pod hodnotu 10 g/1 a po ustálení se pohybovala v rozmezí 7,6 až 8,2 g/1. Ve sledovaném období 25 dnů nebyly ve výstupním proudu z kolony detekovány volné buňky Z. mobilis, zatímco v referenční koloně obsahující imobilizované buňky stejného mikroorganismu ve stejném materiálu za stejných podmínek použití a manipulace, avšak v nepotahovaných peletách, došlo již 5. den k uvolňování buněk' v kon6 7-1 centraci 10 až 10 .ml

Příklad 2

0,2 g vlhké pasty vinařských kvasinek Saccharomyces cerevisiae Blastocel Kappa získané odstředěním 6 dnů staré kultury, *

promytím biomasy sterilní deštil, vodou a opětným odstředěním bylo zředěno 2 ml sterilní deštil, vody do formy vysoce koncentrovaně suspense. Tato suspenze byla za laboratorní teploty vmíchána do 100 ml sterilního 3 % /hmota/objera/ vodného roztoku Protanalu LF-10/60 /alginátu sodného firmy Protan, Norsko/. Směs buněk a roztoku Protanalu byla potom 30 minut intenzivně míchána rychloběžným rotačním míchadlem, čímž byla důkladně homogenizována. Získaná homogenní suspenze buněk byla peristaltickým čerpadlem čerpána do centrální komory 1^ současně se sterilním 3 % /hmota/objem/ vodným roztokem Protanalu LF-10/60 neobsahujícím buňky, kte-. rý byl druhým peristaltickým čerpadlem čerpán do koncentrické komory 2· Koaxiální tryska 2 měla průměr = 1,5 mm a průměr D2 = = 4 mm. Suspenze buněk v roztoku Protanalu byla čerpána objemovým průtokem 55 ml.h \ roztok Protanalu neobsahující buňky byl čerpán objemovým průtokem 56 ml.h \ Dvouvrstvé kapky vznikající v koncentrické trysce a odkapávající s frekvencí cca 2 kapky s ¹ byly vytvrzovány v 5 % /hmota/objem/ roztoku CaC^, který byl mírně promícháván magnetickým míchadlem. Vytvrzené částice kulovitého tvaru měly průměr 3 až 4 mm, tlouštka povrchové vrstvy částic neobsahující buňky činila 0,2 až 0,5 mm. Celkem bylo získáno cca 140 g vlh-8248 535 kých částic, které byly ponechány 24 hodin v 5 % roztoku CaC^ při teplotě 3 až 5 °C. Potom byly částice odděleny cd roztoku

CaCl₉ a několikrát dekantovány destilovanou vodou, čímž z nich byl ^z 2+ odstraněn příbytek Ca iontů. Omyté částice byly potom nasazeny do Erlenmayerových baněk obsahujících filtrovaný sterilní vinný mošt zředěný dest.. vodou na koncentraci redukujících cukrů 200 mg.ml '¹. Násada částic do moštu činila 5 g vlhkých části/100 ml. moštu. Průběh kvašení při laboratorní teplotě byl sledován podle úbytku koncentrace redukujících cukrů a po ukončení kvašení, tj. po poklesu koncentrace teduk. cukrů pod hodnotu 10 až 15 mg ml \ byla též stanovena koncentrace vytvořeného alkoholu.

Stále stejná násada částic byla použita v celkem 20ti kvasných cyklech, jejichž sumární výsledky jsou uvedeny v následující tabulce:

Číslo cyklu	1	2	3	4	5	6	7	8
Doba kvašení, /dny/	8	6	5	5	5	5	J ! 1	4
Konečná konc. red. cukrů /mg/ml/	7,3	10,4	12,8	8,7	5,6	9,2	12,8	14,5
Konečná konc. alkoholu /% hmot,./	10,8	12.4	12,8	10,6	10,2	12,1	10,4	9,8

9	10	11	12	13	14	15	16	17	18	19	20
5	5	5	4	5	4	4	4	5	5	5	4
8,6	11,7	12,6	14,0	9,3	6,8	O «b 00	8,1	5,3	9,7	9,1	7,2
11,6	12,1	13,0	14,0	10,8	10,5	12,1	11,1	11,8	12,3	10,1	10,7

V průběhu sledovaných 20ti cyklů kvašení, nebylo pozorováno uvolnění kvasinek z částic do moštu, i když bylo pozorovatelné určité zvýšení množství biomasy ve vnitřní, oblasti částic.

Příklad 3 g vlhké hmoty čerstvé pasty nativních bakteriálních buněk

Alcaligenes metalcaligenes s apartát amoniak lyázovou aktivitou /specifická aktivita buněk 600 ^urnol L-aspáragové kyseliny.min -1 ' . g vlhké hmoty/, která byla získána odstředěním z fermentační kapaliny, bylo suspendováno ve 150 ml 5%ního /hmota/objem/ vodného

-9248 53S roztoku κ-carrageenanu /Serva Feinbiochemica, NSR/. Po homogenizaci buněk v gelu pomocí rychloběžného rotačního míchadla byla tato suspenze ze zásobníku čerpána do centrální komory 1^ objemovým průtokem 40 ml h ¹ a z druhého zásobníku byl současně čerpán 3%ní /hmota/objem/ vodný roztok κ-carrageenanu bez buněk do koncentrické komory 2 objemovým průtokem 30 ml h . Koaxiální tryska 3. měla rozměry D = 1 mm a D_ =2,5 mm. Dvouvrstevné kapky byly kapány ^{1 z} -1 do 1M vodného roztoku fumaranu amonného obsahujícího 20 mg.ml MgC1.2 a 0,05 % /objera/objem/ tenzidu /Slovafol 909/ o teplotě 12 až 15 °C za mírného míchání. Vzniklé pelety byly v uvedeném prostředí mírně míchány po dobu 24 hodin při výměně uvedeného roztoku každých 8 hodin,

Bylo získáno přibližně 500 g vlhké hmoty potahovaných pelet o střední velikosti 2 mm,. Tlouštka pvrchové vrstvy neobsahující buňky činila přibližně 0,1 až 0,2 mm. Scezené a promyté pelety sušeny volně na vzduchu po dobu 24 hodin a poté znovu suspendovány do 1M roztoku substrátu avšak neobsahujícího tenzid při koncentraci MgCl2 1 mg.ml \ V tomto prostředí byly částice ponechány botnat v lednici do druhého dne. Poté byly částice scezeny a promyty vodou. Střední velikost částic po opětném nabotnání činila přibližně 1,6 mm.

Ze Ί00 -g těchto dvouvrstevných pelet bylo vytvořeno pevné lože ve vertikálně umístěné skleněné koloně o vnitřním průměru 25 mra a délce 250 mm. Vytvořeným ložem byl směrem shora dolů čerpán roztok 1M fumaranu amonného objemovým průtokem 10 ml.h při teplotě 25 °C. Na výstupu z kolony byla jímána konversní směs a ve zvolených časových intervalech analyzována na množství vytvořené kyseliny L-asparagové. Kolona byla v nepřetržitém provozu po dobu 18 dnů, sloupcem za tuto dobu proteklo 4,32 litrů roztoku substrátu, přičemž průměrný stupeň stechiometrické konverze fumaranu amonného na kyselinu L-asparagovou činil 99,1 %.

Příklad 4 g vlhké hmoty čerstvé pasty nativních buněk kvasinky Rhodotorula glutinis s fenylalanin amoniak lyázovou aktivitou /specifická aktivita buněk 0,03 /Umol L-fenylalanimu min .mg suché hmoty/, která byla získána odstředěním z fermentační kapaliny byla suspendována ve 150 ml roztoku κ-carrageenanu o jeho koncentraci a způsobem uvedeným v příkladu 3. Při přípravě dvouvrstev-10248 535 ných pelet bylo postupováno stejným způsobem, jako je uvedeno v příkladu 3, s tím rozdílem, že dvouvrstevné kapky byly kapány do 0,05 M roztoku amonné soli kyseliny trans-skořicové obsahujícího O,O5%ní MgSO₄.7H₂O a 0,01%ní MnSO₄.6H₂O jehož pH bylo upraveno koncentrovanou čpavkovou vodou na 9,5. Vzniklé pelety byly v prostředí uvedeného roztoku ponechány po dobu 24 hodin v klidu při teplotě 5 °C.

Bylo získáno přibližně 480 g vlhké hmoty potahovaných pelet o střední velikosti 2,4 mm. Tloušňka povrchové vrstvy neobsahující buňky byla stejná jako v příkladu 3. Scezené a promyté pelety byly v tenké vrstvě zmrazený při teplotě -18 °C přes noc, poté při teplotě místnosti ponechány volně rozmrazit a potom znovu suspendovány do 0,05 M roztoku substrátu o výše uvedeném složení. V tomto prostředí byly částice ponechány v lednici přes noc. Potě byly částice scezeny a promyty vodou. Střední velikost částic po popsaném ošetření činila přibližně 2,1 mm.

100 g těchto dvouvrstevných pelet bylo naplněno db kolony jejíž rozměry jsou uvedeny v příkladu 3. Pevným ložem biokatalyzátoru byl stejným způsobem, který je uveden rovněž v příkladu 3, čerpán 0,05 M roztok substrátu objemovým průtokem 5 ml.h při teplotě 30 °C a pH roztoku 10,0. Na výstupu z kolony byla jímána konverzní směs a ve zvolených časových intervalech analyzována na množství vytvořeného L-fenylalaninu. Kolona byla v nepřetržitém provozu po dobu 5 dnů, sloupce za tuto dobu proteklo 600 ml roztoku substrátu, přičemž průměrný stupeň stechiometrické konverze amonné soli kyseliny trans-skořicové na L-fenylalanin činil 30 %.

Příklad 5 g vlhké hmoty čerstvé pasty nativních bakteriálních buněk Corynebacterium glutamicum s furaarázovou aktivitou /specifická aktivita buněk 0,4 /umol kys. L-jablečné min \mg ¹ vlhké hmoty/, která byla získána z fermentační kapaliny odstředěním byla suspendována na 150 ml roztoku κ-carrageenanu o jeho koncentraci a způsobem uvedeným v příkladu 3. Při přípravě dvou vrstevných pelet bylo postupováno způsobem uvedeným v příkladu 3 s tím rozdílem, že dvouvrstvé kapky byly kapány do 1M roztoku MgS0₄- při teplotě 10 °C a pH - 7.0. Vzniklé pelety byly cca 30 minut v prostředí uvedeného roztoku mírně míchány a potom ponechány přes noc v klidu při teplotě 5 °C. Poté byly částice scezeny, promyty vodou a suspendovány

-11248 535 v 1M roztoku fumaranu sodného o pH = 7,0, který obsahoval 0,05 % tenzidu /cetyltrimethylamo.niurabromid/ a 10 mg ml MgSO^^ř^O a částice byly v roztoku mírně míchány po dobu 3 h při teplotě 30 °C. Poté byly částice scezeny, promyty vodou a ponechány v ten ké vrstvě zmrazit při teplotě -15 až -18 °C, Po 5-hodinovém mražení byly pelety rozmraženy při teplotě místnosti a promyty vodou.

Bylo získáno přibližně 390 g vlhké hmoty potahovaných pelet o střední velikosti částic 2,4 mm. Tlouštka povrchové vrstvy neobsahující buňky byla stejná jako v příkladu 3.

100 g takto připravených vrstevných pelet bylo naplněno do kolony, jejíž rozměry jscu· uvedeny v příkladu 3. Pevným ložem částic biokatalyzátoru byl způsobem popsaným v příkladu 3 čerpán 1M roztok substrátu objemovým průtokem 10 ml h při teplotě 30 °C a pH = 7,0. Na výstupu z kolony byla jímána konverzní směs a analyzována ve zvolených časových intervalech na množství vytvo řené kyseliny L-jablečné. Kolona byla v nepřetržitém provozu po dobu 14 dnů, sloupcem za tuto dobu proteklo 3,36 litru roztoku substrátu, přičemž průměrný stupeň stechiometrické konverze fumaranu sodného na kyselinu L-jablečnou činil 98 %.

Příklad 6 ml sporové suspenze ve sterilní vodě obsahující 0,1 % /v/v/ tenzidu ,/Tween 80/, koncentrace spor v rozmezí 10° až 10°

-1 · t ml , získané smytím ze šikmého agaru imperfektní houby Aspergillus niger, bylo homogenizováno rychloběžným rotačním míchadlem do 20 ml 6 %ního /hmota/objem/ sterilního 50 °C teplého sodného roztoku alginátu sodného. Po homogenizaci byla suspenze spor v roztoku alginátu čerpána způsobem uvedeným v příkladu 1 a 3 %ní sterilní vodný roztok alginátu sodného neobsahující snory rovněž způsobem uvedeným v příkladu 1, s tím rozdílem, že rozměry koaxiální trysky 3 byly = 4. mra. Způsob vytvrzování, tvořených dvouvrstvých kapek byl rovněž stejný jako v příkladu 1. Vytvrzené částice měly kulovitý tvar se střední velikostí částic přibližně 4 mra. Tlouštka povrchové vrstvy částic neobsahující spory činila 0,4 až 0,5 mm. Částice byly ponechány v prostředí 5 %ního CaC^ po dobu 24 h při teplotě 5 °C,

Potom byly částice asepticky zcezeny, promyty sterilní vodou a uloženy do sterilního média následujícího složení /koncentrace

-12248 S35 uvedeny v % /hmota/objem/: glukóza 10 %., NH₄C1 0,08 %, ^NH4^NO3 0,02 %, močovina 0,1 %, MgSO₄.7H₂O 0,05 %, KH₂PO₄ 0,01 %, KC1 0,007 %, MnSO₄.H₂0 0,002 %, ZnSO₄-7H₂O 0,001 %, FeSO₄.7H₂O 0,001 %, pH média 3,5. částice byly inkubovány po dobu 48 hodin při teplotě 30 °C na reciprokém třepacíra stroji o počtu kyvů 50 min 1 ve stejných hmotnostních dílech á 35 g vlhké hmoty částic na 100 ml média v 500 ml Erlenmayerových baňkách uzavřených vatovými zátkami.

Po uvedené době byly částice asepticky odděleny od média, promyty sterilní vodou a asepticky přeneseny do vertikální skleněné kolony jejíž dno bylo opatřeno porcelánovou fritou. Rozměry kolony byly: výška 400 ml, vnitřní průměr 50 mm. Pracovní objem kolony činil 780 ml. Kolona byla opatřena v dolní' části přívodem vzduchu s filtrem naplněným skleněnou vatou. Celé zařízení bylo předem vysterilizováno. Náplň kolony činila přibližně 100 g vlhké hmoty vrstvených pelet a 300 ml živné půdy, jejíž složení bylo stejné jak je výše uvedeno, s tím rozdílem, že neobsahovala NH₄NO₃Podmínky biosyntézy kyseliny citrónové imobilizovaným myceliem A. niger ve vrstvených peletách v popsaném zařízení byly následující: teplota 30 °C, vzdušnění 0,6 1 vzduchu .min ¹, počáteční hodnota pH = 3,5.

Po 15 dnech kultivace za uvedených podmínkách bylo dosaženo produkce kyseliny citrónové 60 mg ml \ Po této .dóbě byla živná půda asepticky odsáta a kolona znqvu naplněna 300 ml čerstvé sterilní živné půdy o stejném složení' a popsaným způsobem a za uvedených podmínek byla biosyntéza opakována s:e stejnou násadou imobilizovaných buněk celkem třikrát. Průměrný stupeň produkce kyseliny citronové/3 opakované patnáctidenní cykly použití téže násady biokatalyzátoru činil 54 mg ml \ V průběhu sledovaných tří cyklů opakovaného použití potahovaných pelet nebylo uvolňování mycelia z částic do média významné.

Příklad 7

Z 0,2 g vlhké pasty kvasinek S. cerevisiae byla sterilně připravena koncentrovaná vodná suspenze jako v příkladu 2. Tato suspenze byla při teplotě 48 °C vmíchána do 100 ml sterilního 5 %ního /hmota/objem/ vodného roztoku agar-agaru pomocí rychloběžného rotačního míchadla. Získaná homogenní suspenze buněk byla při uvedené teplotě /48 °C/ čerpána do centrální komory 1 současně se sterilním

-13248 535 %ním /hmota/objem/ vodným roztokem agar-agaru neobsahujícím buňky, který byl při stejné teplotě čerpán do koncentrické komory 2- Zvýšená teplota celého zařízení byla udržována pomoci' infralampy. Zásobní roztoky byly temperovány ve vodní lázni. Rozměry koaxiální trysky stejně tak jako objemové průtoky suspenze buněk v agaru a agaru neobsahujícího buňky byly stejné jako v příkladu 2. Dvouvrstvé· kapky byly vytvrzovány v sterilní ledové vodní lázni při teplotě blízké 0 °C. Ztuhlé částice čočkovitého tvaru měly průměr 4,5 až 5 mm; tloušňka povrchové vrstvy částic neobsahující buňky činila 0,3 až 0,5 mm. Částice byly ponechány v ledové vodě při 2 °C po dobu 24 hodin. Poté byly částice asepticky odděleny a promyty sterilní ledovou vodou.

Dále bylo postupováno při kvašení jako v příkladu 2 v celkem 20 opakovaných kvasných cyklech se stejnou násadou potahovaných pelet. Při době 5 dnů/jeden cyklus bylo dosaženo průměrných hodnot •konečných koncentrací/ 20 opakovaných cyklů: 7,8 mg.ml redukujících cukrů a 10,6 % ethanolu. V průběhu sledovaných 20 cyklů nebylo pozorováno uvolnění buněk z částic do externího prostředí.

Claims (3)

PŘEDMĚT VYNÁLEZU 248 535

1. Způsob fyzikální imobilizace živých buněk do vrstvených pelet, využitelných pro průmyslové biotransformace a biokonverze, kvasné procesy a biosyntetické výroby, vyznačující se tím, že se suspenze celých nativních buněk prokaryontních nebo eukaryontních organismů, zejména bakterií, kvasinek a' hub, za teploty 10 až 50 °C vmíchá do vodných gelů připravených z přírodních materiálů, na bázi termoreversibilnich gelů, zejména agaru nebo želatiny, nebo na bázi iontově reversibilních polysacharidů, zej ména alginátu nebo <⁼carrageenanu, načež se tato směs vytlačuje středem víceproudé koaxiální, trysky, přičemž ústími trysky ve tvaru raezikruží se společně vytlačuje gelový materiál bez buněk a vytvořené vrstvené kapky se vkapávají do vody o teplotě

0 až 40 °C nebo vodných roztoků anorganických nebo organických solí o teplotě -15 až 40 °C a po ztuhnutí a nebo vytvrzení se vytvořené pelety oddělí a popřípadě dále zpevňují sušením nebo vymražováním.

2. Způsob podle bodu 1, vyznačený tím, že poměr rychlostí vytlačování gelů obsahujících buňky a gelů samotných, měřená vytlačovaným objemem na výstupu trysky, činí 0,1 až 1,5 : 1, výhodně 0,5 : 1.

3. Zařízení, k provádění způsobu podle bodu 1, vyznačující se tím, že sestává z centrální komory /1/ s alespoň jednou koncentrickou komorou/2/, přičemž všechny komory jsou opatřeny přívody zpracovávaných materiálů a ústí do víceproudé koaxiální trysky /3/, pod kterou je umístěna nádoba /4/ s vytvrzovacím roztokem.