CS248247B1 - Sposob výběru kmeňov vírusov hemorhagickej horačky s renálnym syndrómom imunoenzymatickou metódou - Google Patents

Description

248247

Vynález sa týká sposobu vyberu kmeňovvírusov hemorhagickej horácky s renálnymsyndrómom (HFRS) zá,pádného tyjpu imuno-enzymatickou (EIA) metodou.

Hemorhagická horácká s renálnym syn-drómom představuje vo svete, najma v Áziia Európe vážný verejno-zdravotnícky pro-blém [C. Gajdušek: WHO Report [1982]].Doteraz vo svete sa robili pokusy na zachy-tenie virusu, respektive virusového antigé-nu hemorhagickej horácky s renálnym syn-drómom z pl’ác drobných hlodavcov nepria-imou imunofluorescenciou [H. W. Lee, P. W.Lee, I. J. Back, K. Tsuchiya, R. S. Foulke:Am. J. Trop. Med. Hyg. 30, 477 (1981); M.Brummer-Korvenkontio, A. Vaheri, T. Hovi, C. H. von Bonsdorf, J. Vuorimies, T. Manni, K. Penttinen, N. O!ker-Blom, J. Lahdevirta:J. Infect, Dis. 141, 131 (1980); I. N. Gavrilov-sikaya, N. S. Apekina. Yu. A. Myasnikov, A. D. Bernshtein, E. V. Ryltseva, E. A. Gorbach-kova, A., D. Chumakov: Arch. Virol. 75, 313(1983); M. Grešíková, J. Rajčáni, M. Seikeyo-vá, M. Brumimer-Korvenkontio, O. Kožuch,M. Labuda, R. Turek, P. Weismann, J. Nosek,J. Lysý: Acta virol. 28, 416 (1984)], alebona bunečnej linii z 1'udských karcinomatóz-nych pláč (A 549) ako i na stabilizované)bunečnej linii z obličiek zelených opic(VĚRO klon F6 buňkách) [G. R. French:Abstract V. Int. Symp. Virology (1981); T.Kitamura, M. Chiharu, K. Toshihiko, S. Ka-zuyoshi, A. Jíro, S. Sadashi, T. Hisao, A.Yoriyuki, I. Kiyoshi: JPN J. Med. Sci. Biol.36, 17 (1983)].

Nevýhodou doteraz používaných metodikje velká prácnosť. Metodika přípravy ultra-tenkých rezov z pl'úc hlodavcov a následnýdůkaz antigénu nepriamou iimunofluorescen-ciou je zdíhavá. Podobné metodika kulti-vácie suspenzií z pl'úc drobných hlodavcovna bukách je prácna, pretože až po niekol-kých slepých pasážach sa dá dokázat anti-gén hemorhagickej horácky s renálnymsyndrómom v cytoplazme buniek poimocounepriamej imunofluorescencie.

Podstata vynálezu spočívá v tom, že sana film imúnneho gama glohulínu, obsahu-júceho protilátky k virusu hemorhagickejhorácky s renálnym syndrómom po vymytía vysušení nanesú číře testované materiá-ly, a potom sa po premytí a vysušení nane-ste anti-imunoglobulín, značený enzýmomperoxidázou, alebo fosfatázou po opatovnompremytí sa přidá 1,4-diamínobenzén, alebo 4-nitrofenylfosfát, reakcia sa zastaví po 30až 45 mih s 1 až 1,01 mól. I-1 roztokom ky-seliny sírovej a sfarbenie sa vyhodnotí vi-zuálně alebo fotometricky.

Imunochemické reakcie, t. j. reakcie an-tigénov s protilátkami sa využívajú velmičasto k důkazu biologicky aktívnych látekpre svoju vysoká špecificitu a citlivost. Vý-znamným markerom antigénov a protiláteksú enzýmy. Tieto bolí použité na označenieprotilátek k detekcii antigénov v histolo-gických preparátech a ku zviditelneniu sla- bých precipitačných linií pri imunodiíúznychtechnikách v agarovom géle.

Ako sa ukázalo, enzymové konjugáty savelmi hofdia k histologickým a cytologickýmvyšetrenium, pretože oproti klasickej imu-nofluorescencii májá velká výhodu nielenvo vyššej citlivosti, stálosti preparátov apoužitelnosti i pri elektrónovej mikroskopii,ale preldovšetkým v možnosti pozorovat sú-časne i tkaninové buněčné štruktúry azistiť tak přesná lokallzáciu hladaného an-tigénu.

Po príprave prvých enzýmových konjugá-tov sa zrodila tzv. metoda „enzymeimmu-noassay“ EIA, u kíorej sa hodnotí enzymováaktivita, a to spravidla .pomocou rozkladuvhodného substrátu, který poskytuje fareb-né reakčné produkty.

Vzhladom k tomu, že asociačně konstan-ty komplexu antigén-protilátka sú v opti-málnych prípadoch rádu 10~12 mól. 1_1 jecitlivost imunoenzymatickej metody EÍA rá-du až 10_15 mól. 1_1. Iimunoenzymatické me-tody vyhovujá mofderným požiadavkám navyhodnocovanie, na přesnost a reproduko-vatefnosť. Výhoda spůsobu výběru kmeňov vírusovhemorhagickej horácky s renálnym syndró-mom imunoenzymatickou metodou spočíváv úspoře materiálu: médií, sér a buniek. Ďalšou výhodou je, že navrhované rieše-nie je časovo úsporné, znižuje sa prácnosťa rizikovost z hladiska bezpečnosti pri prá-ci. Příklad 1

Na polystyrénové mikroplatničky sa na-nesie po 0,05 ml specifický 1'udský gama-globulín, obsahujáci protilátky k hemorha-gickej horáčke s renálnym syndrómom. Poadsorpcii gamaglobulínu na tvrdá podložkupočas 18 hodin (cez noc) pri teplete 22 °Csa jamky 3krát premyjá s 0,01 ml. I-1 fos-fátovým pufrom o pH 7,2 s prímesou 0,5 %hmot. polyoxyetylén 20 sorbitant monolau-rátu (Tweenu 20) o molekulovej hmotnosti1 200.

U.P

Zloženie fosfátového pufru: Připraví sa fosfátmi tlimený fyziologickýroztok o pH 7,2. Roztok A : 8 g chloridu sod-ného, 0,20 g chloridu draselného, 2,89 hyd-rogénfosforečnanu sodného, 0,20 g dihydro-génfosforečnanu draselného sa rozpustí vredestilovanej vodě a roztok sa doplní re-destilovanou vodou na objem 800 ml. Roz-tok B : 0,1 g chloridu vápenatého sa roz-pustí v 100 ml redestilovanej vodě. RoztokC : 0,1 g hexahydrát chloridu horečnatéhosa rozpustí v 100 ml redestilovanej vody.

Roztoky A, B a C sa zmiešajá a potom sapřidá 0,5 % hmot. polyoxyetylén 20 sorbi-tant monolaurátu. Po premytí a vysušeníplatničiek sa pridajá vyčírené suspenzie z

Claims (4)

1. 248247 S ipíúc drobných hlodavcov po 0,05 ml. Po ad-sorpcii antigénu při teplote 4 °C jpočas 18 hsa jamky opatovne premyjú s fosfátovýmpufrom s prímesou 0,5 % hmot. polyoxy-etylén 20 sorbitant monolaurátu. Po vysu-šení sa přidává antiglobulín, označený en-zýmom peroxidáciou. Po trojnásobnom pre-mytí sa přidá 1,4-idiamínobenzén. Reakciasa zastaví po 30 minútach 1 mól. I-1 rozto-kům kyseliny -sírovej. Výsledky sa odčítajúna fotometri (Mi-croelisa MR 590) pri vlno-vej dížke 210 nm alebo vizuálně. Pozitivně reagujúce vzorky sa vyberú nakultiváciu na stabilizované] bunečnej liniiz obličiek zelených opic (VĚRO klon E6buňkách). Tiet-o stabilizované buněčné liniesú uložené vo· Virologickom ústave SAV,Mlýnská dolina 1, 817 03 Bratislava. Příklad
2. 2 Postupuje sa ako v příklade 1 s tým -roz-dielom, že sa použije krv chorého člověka,alebo vyčírené orgány (,pl'úca, obličky) postmortem. Na film imúnneho- gamaglobulínu,obsahujúceho protilátky k virusu hemorha-gickej horúčky s renálnym syndromem sananesie čirý testovaný materiál a potom sapo preimytí a vysušení nanesie antiimuno-globulín, značený enzýmom peroxydázou;po opátovnom premytí sa přidá 1,4-diamíno-benzén; reakcia sa zastaví po 30 min s1 mól. 1_1 roztokoím kyseliny sírovej a sfar-benie sa vyhodnotí vizuálně alebo- fotome-tricky pri vlnovej dížke 210 nm. Příklad
3. 3 Postupuje sa ako v příklade 1 s tým roz--dielom, že sa použije moč chorého člověka,upravený na neutrálně pH. Na film iimúnne- ho gamaglobulínu s protilátkami k hemor-hagickej horúčike s renálnym syndrómom sananesie imoč pacienta. Po adsorpcii pri tep-lotě
4. 4 °C počas 18 hodin sa jamky opatovne3krát premyjú s fosfátovým pufrom s prí-mesou 0,5 °/o hmot. polyoxyetylén 20 sorbi-tant monolaurátu. Po vysušení sa přidá an-tiimunoiglobulín, značený enzýmom peroxy-dázou. Po- trojnásobnom premytí s fosfáto-vým pufrom sa priidá 1,4-diamínobenzén(ortofenyléndiamín). Reakcia sa zastaví po30 minútach -s 1 ml. I'1 roztokom kyselinysírovej. Výsledky sa odčítajú na fotometripri vlnovej dížke 210 nm alebo vizuálně.Po-zitívne reagujúce vzorky sa vyberú nakultiváciu na stabilizovanej bunečnej liniiz obličiek zelených opic (VĚRO klon E6buňkách). Příklad 4 Postupuje sa ako v příklade 1 s tým roz-dielom, že sa použije antiglobulín, označe-ný enzýmom alkalickou fosfatázou. Po troj-násobnému premytí sa přidá dvojsodná sol’ 4-nitrofenylfosfátu. Reakcia sa nechá pre-biehať v trne a potom sa zastaví po 45 minú-tach 1,01 mól. 1_1 roztokom kyseliny síro-vej. Výsledky sa odčítajú na fotometri privlnovej dížke světla 490 alebo vizuálně. Po-zitivně reagujúce vzorky sa vyberú na kul-tiváciu -na stabilizovanej bunečnej linii z ob-ličiek zelených opic (VĚRO klon E6 buň-kách). Spósob výběru kmeňov hemorhagickej ho-rúčky s renálnym syndrómom může nájsťširoké uplatnenie v zdravotníctve na izolá-ciu kmeňov hemorhagickej horúčky s re-nálnym syndrómom, titráciu i identifikaciuuvedených kmeňov vírusov. PREDMET -Spósob výběru kmeňov vírusov hemorha-gickej horúčky s renálnym syndromem imu-noenzyímatickou metodou, vyznačujúci satým, že na film imúnneho- gamaglobulínu,obsahujúceho protilátky k hemorhagickejhorúčke s renálnym syndrómom po premytía vysušení sa nanesú číře testované mate-riály a potom sa po premytí a vysušení na- VYNÁLEZU nesie antiimunoglobulín, značený enzýmomperoxydázou, alebo- fosfatázou po opatov-nom premytí sa přidá 1,4-diamínobenzén,alebo 4-nitrofenylfosfát, reakcia sa zastavípo 30 až 40 min s 1 až 1,01 mól. I"1 rozto-kom kyseliny sírovej a sfarbe-nie sa vyhod-notí vizuálně alebo fotometricky.