CS248247B1 - Sposob výběru kmeňov vírusov hemorhagickej horačky s renálnym syndrómom imunoenzymatickou metódou - Google Patents

Abstract

Účelom riešenia je výběr kmeňov hemorhagickej horúčky s renálnym syndrómom imunoenzymatickou metódou. Uvedeného účelu sa dosiahne tak, že na film imúnneho gamaglobulínu obsahujúceho protilátky k virusu hemorhagickej horúčky s renálnym syndrómom sa nanesie čirý testovaný materiál, po premytí a vysušení sa nanesie anti-imunoglobulín označený enzýmom peroxidázou, alebo fosfatázou po opatovnom premytí sa přidá 1,4-diamínobenzén alebo 4-nitrofenylfosfát, reakcia sa zastaví po 30 až 45 min a 1 až 1,01 mól. i-1 roztokom kyseliny sírovej a sfarbenie sa vyhodnotí vizuálně alebo fotometricky. Spósob výběru kmeňov hemorhagickej horúčky s renálnym syndrómom má použitie v zdravotníctve.

Description

Účelom riešenia je výběr kmeňov hemorhagickej horúčky s renálnym syndrómom imunoenzymatickou metódou.

Uvedeného účelu sa dosiahne tak, že na film imúnneho gamaglobulínu obsahujúceho protilátky k virusu hemorhagickej horúčky s renálnym syndrómom sa nanesie čirý testovaný materiál, po premytí a vysušení sa nanesie anti-imunoglobulín označený enzýmom peroxidázou, alebo fosfatázou po opatovnom premytí sa přidá 1,4-diamínobenzén alebo 4-nitrofenylfosfát, reakcia sa zastaví po 30 až 45 min a 1 až 1,01 mól. i^-1 roztokom kyseliny sírovej a sfarbenie sa vyhodnotí vizuálně alebo fotometricky.

Spósob výběru kmeňov hemorhagickej horúčky s renálnym syndrómom má použitie v zdravotníctve.

Vynález sa týká sposobu výběru kmeňov vírusov hemorhagickej horácky s renálnym syndrómom (HFRS) zápádného typu imunoenzymatickou (EIA) metodou.

Hemorhagická horácká s renálnym syndromem představuje vo svete, najma v Ázii a Európe vážný verejno-zdravotnícky problém [C. Gajdušek: WHO Report (1982)]. Doteraz vo svete sa robili pokusy na zachytenie virusu, respektive virusového antigénu hemorhagiíckej horácky s renálnym syndrómom z plúc drobných hlodavcov nepriaimou imunofluorescenciou [H. W. Lee, P. W. Lee, I. J. Back, K. Tsuchiya, R. S. Foulke: Am. J. Trop. Med. Hyg. 30, 477 (1981); M. Brummer-Korvenkontio, A. Vaheri, T. Hovi,

C. H. von Bonsdorf, J. Vuorimies, T. Manni, K. Penttinen, N. O!ker-Blom, J. Lahdevirta: J. Infect, Dis. 141, 131 (1980); I. N. Gavrilovsikaya, N. S. Apekina. Yu. A. Myasnikov, A.

D. Bernshtein, E. V. Ryltseva, E. A. Gorbachkova, A.. D. Chumakov: Arch. Virol. 75, 313 (1983); M. Grešíková, J. Rajčáni, M. Seikeyová, M. Brumimer-Korvenkontio, O. Kožuch, M. Labuda, R. Turek, P. Weismann, J. Nosek, J. Lysý: Acta virol. 28, 416 (1984)], alebo na bunečnej linii z 1'udských karcinomatóznych plúc (A 549) ako i na stabilizované) bunečnej linii z obličiek zelených opic (VĚRO klon F6 buňkách) [G. R. French: Abstract V. Int. Symp. Virology (1981); T. Kitamura, M. Chlharu, K. Toshihiko, S. Kazuyoshi, A. Jíro, S. Sadashi, T. Hisao, A. Yoriyuki, I. Kiyoshi: JPN J. Med. Sci. Biol. 36, 17 (1983)].

Nevýhodou doteraz používaných metodik je velká prácnosť. Metodika přípravy ultratenkých rezov z pl'úc hlodavcov a následný důkaz antigénu nepriamou imunofluorescenciou je zdíhavá. Podobné metodika kultivácie suspenzií z plúc drobných hlodavcov na bukách je práicna, pretože až po niekol'kých slepých pasážach sa dá dokázat antigén hemorbagickej horúčky s renálnym syndrómom v cytoplazme huniek pomocou nepriamej imunofluorescencie.

Podstata vynálezu spočívá v tom, že sa na film imúnneho gama globulínu, obsahujúceho protilátky k virusu hemorhagickej horúčky s renálnym syndrómom po vymytí a vysušení nanesú číře testované materiály, a potom sa po premytí a vysušení nanesie anti-imunoglobulín, značený enzýmom peroxidázou, alebo fosfatázou po opatovnom premytí sa přidá 1,4-diamínobenzén, alebo 4-nitrofenylfosfát, reakcia sa zastaví po 30 až 45 min s 1 až 1,01 mól. I'¹ roztokom kyseliny sírovej a sfarbenie sa vyhodnotí vizuálně alebo fotometricky.

Imunochemické reakcie, t. j. reakcie antigénov s protilátkami sa využívajú velmi často k důkazu biologicky aktívnych látoik pre svoju vysokú špecificitu a citlivost. Významným mankerom antigénov a protilátek sú enzýmy. Tieto holi použité na označenie protilátek k detekcii antigénov v histologických preparátech a ku zviditelneniu slabých precipitačných linii pri imunodifúznych technikách v agarovom géle.

Ako sa ukázalo, enzymové konjugáty sa velmi ho)dia k histologlckým a cytologickým vyšetreniam, pretože oproti klasickej imunofluorescencii majú veliká výhodu nielen vo vyššej citlivosti, stálosti preparátov a použitelnosti i pri elektrónovej mikroskopii, ale predovšetkým v možnosti pozorovat súčasne i tkaninové buněčné štruktúry a zistiť tak presnú lokalizáciu hladaného· antigénu.

Po ipríprave prvých enzýmových konjugátov sa zrodila tzv. metoda „enzymeimmunoassay“ EIA, u ktorej sa hodnotí enzymová aktivita, a to spravidla pomocou rozkladu vhodného substrátu, ktorý poskytuje farebné reakčné produkty.

Vzhladom k tomu, že asociačně konstanty komplexu antigén-protilátka sú v optimálnych prípadoch rádu 10~¹² mól. 1^_1 je citlivost imunoenzymatickej metody EiA rádu až 10^_15 mól. 1^_1. Imunoenzymatické metody vyhovujú moderným požiadavkám na vyhodnocovanie, na přesnost a reprodukovatelnosť.

Výhoda sposobu výběru kmeňov vírusov hemorhagickej horúčky s renálnym syndrómom imunoenzymatickou metodou spočívá v úspoře materiálu: médií, sér a buniek.

Ďalšou výhodou je, že navrhované riešenie je časovo úsporné, znižuje sa prácnosť a rizikovost z hladiska bezpečnosti pri práci.

Příklad 1

Na polystyrénové mikroplatničky sa nanesie po 0,05 ml specifický 1'udský gamaglobulín, obsahujúci protilátky k hemorhaglckej horúčke s renálnym syndrómom. Po adsorpcii gamaiglobulínu na tvrdú podložku počas 18 hodin (cez noc) pri teplote 22 °C sa jamky 3krát premyjú s 0,01 ml. I^-1 fosfátovým pufrom o pH 7,2 s prímesou 0,5 % hmot. polyoxyetylén 20 sorbitant monolaurátu (Tweenu 20) o molekulovej hmotnosti 1 200.

U.P

Zloženie fosfátového pufru:

Připraví sa fosfátmi tlrnený fyziologický roztok o {pH 7,2. Roztok A : 8 g chloridu sodného, 0,20 g chloridu draselného, 2,89 hydrngénfosforečnanu sodného, 0,20 g dihydrogénfosforečnanu draselného sa rozpustí v redestilovanej vodě a roztok sa doplní redestilovanou vodou na objem 800 ml. Roztok B : 0,1 g chloridu vápenatého sa rozpustí v 100 ml <redestilovanej vodě. Roztok C : 0,1 g hexahydrát chloridu horečnatého sa rozpustí v 100 ml redestilovanej vody.

Roztoky A, B a C sa zmiešajú a potom sa přidá 0,5 % hmot. polyoxyetylén 20 'sorbitant nionolaurátu. Po premytí a vysušení platničiek sa pridajú vyčírené suspenzie z ipíúc drobných hlodavcov ,po 0,05 ml. Po adsorpcii antigénu pri teplote 4 °C počas 18 h sa jamky opátovne premyjú s fosfátovým pufrom s prímesou 0,5 % hmot. polyoxyetylén 20 sorbitant monolaurátu. Po vysušení sa přidává antiglobulín, označený enzýmom pero-xidáctou. Po trojnásobném premytí sa přidá 1,4-diamínobenzén. Reakcia sa zastaví po 30 iminútach 1 mól. I^-1 roztokom kyseliny sírovej. Výsledky sa odčítajú na fotometri (Microelisa MR 590 j pri vlnovej dížke 210 nm alebo vizuálně.

Pozitivně reagujúce vzorky sa vyberú na kultiváciu na stabilizovanej bunečnej linii z obličiek zelených opic (VĚRO klón E6 buňkách). Tieto stabilizované buněčné linie sú uložené vo· Virologiokom ústave SAV, Mlýnská dolina 1, 817 03 Bratislava.

Příklad 2

Postupuje sa ako v příklade 1 s tým rozdielom, že sa použije krv chorého člověka, alebo vyčírené orgány (.plúca, obličkyj post mortem. Na film imunneho- gamaglobulínu, obsahujúceho protilátky k virusu hemorhagickej horúčky s renálnym syndromem sa nanesie číry testovaný materiál a potom sa po preimytí a vysušení nanesie antlimunoglobulín, značený enzýmom peroxydázou; po opátovnom promytí sa přidá 1,4-diamínobenzén; reakcia sa zastaví po 30 min s 1 mól. I^-1 roztokom kyseliny sírovej a sfarbenie sa vyhodnotí vizuálně alebo- f-otometricky pri vlnovej dížke 210 nm.

Příklad 3

Postupuje sa ako v příklade 1 s tým rozdielom, že sa použije moč chorého člověka, upravený na neutrálně pH. Na film iimúnneho gamaglobulínu s protilátkami k hemorhagickej horúčike s renálnym syndrómom sa nanesie im-oč pacienta. Po adsorpcii pri teplote 4 °C počas 18 hodin sa jamky opátovne 3k-rát premyjú s fosfátovým pufrom s prímesou 0,5 °/o hmot. polyoxyetylén 20 sorbitant monolaurátu. Po vysušení sa přidá antiimunoglobulín, značený enzýmom peroxydázo-u. Po- trojnásobném premytí -s fosfátovým pufrom -sa priidá 1,4-diamínobenzén (ortofenyléndiamín). Reakcia sa zastaví po 30 minúta-ch -s 1 iml. I'¹ roztokom kyseliny sírovej. Výsledky sa odčítajú na fotometri pri vlnovej dížke 210 nm alebo vizuálně. Po-zitívne reagujúce vzorky sa vyberú na kultiváciu na stabilizovanej bunečnej linii z obličiek zelených opic (VĚRO klon E6 buňkách).

Příklad 4

Postupuje sa ako v příklade 1 s tým rozdielom, že sa použije antiglobulín, označený enzýmom alkalickou fosfatázou. Po tro-jnás-obnom premytí sa přidá dvojisodná sof 4-nitrofenylfosfátu. Reakcia -sa nechá prebiehať v trne a potom sa zastaví po 45 minútach 1,01 mól. 1^_1 roztokom kyseliny sírovej. Výsledky -sa odčítajú na fotometri pri vlnovej dížke světla 490 alebo vizuálně. Pozitivně reagujúce vzorky sa vyberú na kulti-váciu -na stabilizovanej bunečnej linii z obličiek zelených opic (VĚRO klon E6 buňkách).

Sposob výběru kmeňov hemorhagickej horúčky s renálnym syndrómom móže nájsť široké uplatnenie v zdrav-otníctve na izoláciu kmeňov hemorhagickej horúčky s renálnym syndrómom, t-itráciu i identifikaci u uvedených kmeňov vírusov.

Claims (4)

1. PREDMET

   -Sposob výběru ikmeňov vírusov liemorhagickej horúčky s renálnym syndromem imunoenzyímatickou metodou, vyznačujúci sa tým, že na film imúnneho gamaglobulínu, obsahujúceho protilátky k hemorhagickej horúčke -s renálnym syndromem po premytí a vysušení sa nanesu číře testované materiály a potom sa po premytí a vysušení naVYNÁLEZU ne-sie antiimunoglobulín, značený enzýmom peroxydázou, alebo- fosfatázou po opátovnom premytí sa přidá 1,4-diamínobenzén, alebo 4-nitrofenylfosfát, reakcia sa zastaví po 30 až 40 min s 1 až 1,01 mól. i¹ roztokom kyseliny sírovej a sfarbenie sa vyhodnotí vizuálně alebo fotometrieky.