CS247791B1

CS247791B1 - Analogy enkefalinu a způsob jejich přípravy

Info

Publication number: CS247791B1
Application number: CS711084A
Authority: CS
Inventors: Andrzej Lipkowski; Miroslava Konopka; Linda Servitova; Karel Hauzer; Tomislav Barth
Original assignee: Andrzej Lipkowski; Miroslava Konopka; Linda Servitova; Karel Hauzer; Tomislav Barth
Priority date: 1984-09-21
Filing date: 1984-09-21
Publication date: 1987-01-15

Abstract

Nové deriváty enkefalinových analogů obecného vzorce I Tyr-D-Ala-Gly-Phe-NH (I). X-NH kde X je zbytek Pro-Leu-Gly, kyseliny γ-aminomáselné, kyseliny nikotinové, nebo Tyr-D-Arg. Derivát opioidního peptidu enkefalinu Tyr-D-Ala-Gly-Phe-NH-NH2 byl použit k přípravě bifunkčních derivátů vzorce I s cílem získat látky s pozměněným spektrem účinků a distribučních vlastností. Způsob přípravy látek vzorce I se provádí tak, že se kondenzuje hydrazid chráněného tetrapeptidu vzorce Tyr-D-Ala-Gly-Phe-NHNH2 s komponentami obsahujícími X, odstraní se chránící skupiny a konečný produkt se čistí chromatograficky.

Description

Vynález se týká analogů enkefalinu. Po objevu a izolaci opoidních peptidů enkefalinu z mozku (Hughes et al» 1976) bylo připraveno mnoho syntetických analogů enkefalinů, zejména řada analogů se značně pozměněnou afinitou k různým populacím receptorů s jinými biologickými účinky a větší metabolickou stabilitou. Pozitivní výsledky přinesla zejména záměna L-aminokyselin za D-stereoisomery (Coy D. H. et al. Biochim Biophys. Res Commun. 83, 977-983, 1978, Hughes J. etal., Nátuře 258 , 577-579, 1975), synthesa sloučenin s vlastnostmi prohormonu (Lewis R. V., Stern A. S., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol 2 3, 353-72, 1983) a příprava dímérů (Lipkowski A. W. et al., Proč. of the 17th Peptide Symposium, Prague 1982, Walter de Gruyrer, Berlin, New York 1983,Str. 481-484).

Podstatou vynálezu jsou další nové analogy enkefalinu obecného vzorce I

Tyr-D-Ala-Gly-Phe-NH

I ί τ 1

X-NH ' ^J ’ kde X je zbytek Pro-Leu-Gly, kyselina γ-aminomáselné, kyseliny nikotinové, nebo Tyr-D-Arg.

Dále je předmětem vynálezu způsob přípravy těchto látek, jehož podstatou je, že se provede fragmentová kondenzace hydrazidu chráněného tetrapeptidu vzorce Tyr-D-Ala-Gly-Phe-NHNH2 s komponentami ve významu uvedeném pro X ve vzorci I, potom se odstraní chránící skupiny a konečný produkt se čistí chromatograficky. Analogy enkefalinu mají bifunkční charakter, podmíněný kovalentním spojením jednoho z velmi účinných analogů přirozeného enkefalinu

Tyr-D-Ala-Gly- Phe-Met se známými neurotransmittery a neuromodulátory.

Dimerisace molekuly analogu enkefalinu vede k řádovému zvýšení biologické aktivity. Spojení dvou látek s biologicky odlišnými aktivitami vytvořilo dimer se zachovanou biologickou aktivitou, a rovněž se změněmýni distribučními vlastnostmi, jež jsou podmíněny charakterem kombinovaných látek.

Biologické vlastnosti látek byly stanoveny testem na morčecím ileu, myším vas deferens a stanovením vazebné afinity k membránové frakci připravené z mozku (Paton, 1955; Hutchinson et al., 1975; Lord et al., 1977; Lipkowski, 1982).

Látky byly synthetisovány fragmentovou kondensací Boc~Tyr-D-Ala-Gly-Phe-NH-NH2 v dimetylformamidu s chráněnými formami Čtyř známých neuromodulátorů nebo neurotransmitterů, tj. Pro-Lue-Gly-NH2 (MIF), kys. Y -aminomáselná (GABA). D-Arg^-kyotorfin (tyrosyl-D-arginin) a kyseliny nikotinové. Detailní synthesa je uvedena v příkladech provedení, biologické vlastnosti připravených látek jsou uvedeny v tabulce I.

Příklad 1

0,01 molu hydrazidu tercbutyloxykarbonyl-tyrosyl-alanyl-glycyl-fenylalaninu (Boc-Tyr-D-Ala-Gly-Phe- NH-NH2) bylo rozpuštěno v 50 ml dimetylformamidu a postupně k tomuto roztoku přidáno 0,01 molu tercbutyloxykarbonyl-proly1-leucyl-glycinu (Boc-Pro-Leu-GlyOH) a 0,05 molu N-hydroxybenztriazolu (HOBt). Směs byla ochlazena na 0 °C a poté k ní přidáno 0,011 molu dicyklohexylkarbodiimidu (DCC). Při této teplotě byla směs míchána 2 hodiny a poté při teplotě místnosti dalších 12 hodin. Utvořená sraženina dicyklohexylmočoviny byla odsáta a promyta 10 ml dimetylformamidu. Filtrát byl doplněn do 250 ml 0,lM Na2COj.

Vysrážený produkt byl odsát, promyt 2x 50 ml vody, 50 ml 0,5M kyseliny citrónové a opět 50 ml vody. Produkt byl vysušen v exsikátoru nad práškovým P2^O5* ^Po vysušení byla látka rozpuštěna v 25 ml koncentrované kyseliny octové obsahující 2N HCl a 0,5 ml anisolu. Po 30 minutách bylo do roztoku přidáno 100 mi o tyletheiu. Vysrázený produkt byl odsát a promyt dvakrát 20 ml etyletheru. Produkt byl získán ve výtěžku 71 %. Pro účely dalšího čištění byla látka rozpuštěna v metanolu a chromatografována na sloupci Sephadexu LH-20 za použití metanolu. Výtěžek této operace byl 92 %. Látka byla charakterizována [a| _D ²⁵ (c = 0,2,metanol)

Rp (silikagel) v butanol-kyselina octová-voda (4:1:5 obj. %) aminokyselinovou analýzou a elementární analýzou. Získaná sloučenina vzorce II (HC1)₇.Tyr-D-Ala-Gly-Phe-NH

I (II)

Pro-Leu-Gly-NH má následující charakteristiku: C°l1 p^{25= r}f = θ»⁴⁵» aminokyselinová analýza:Ala:Gly:

Leu:Phe:Tyr, 1,01:1,98:1,01:1,00:0,95:0,92. Pro C₃₆H₅₃OgN₉Cl₂ (810,87) vypočteno: 53,32 % C: 6,60 % H: 15,55 % N: nalezeno: 53,26 % C. 6,87 % H: 15,31 % N.

Příklad 2

0,01 molu hydrazidu tercbutyloxykarbonyl-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-fenylalaninu (Boc-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-NH-NH₂) bylo rozpuštěno v 50 ml dlmetylformamidu (DMF) a postupně přidáno do roztoku 0,011 molu 2,4,5-trichlorfenylesteru kyseliny tercbutyloxykarbonyl- γ -aminomáselné (kyselina γ -aminomáselná-GABA) spolu s 0,03 molu N-hydroxybenztriazolu. Směs byla míchána při teplotě místnosi 18 h a surový produkt vysrážen přidáním 200ml 0,lM Na₂CO₃. Sraženina byla odsáta a promyta 2x 50 ml vody, 0,5M kyselinou citrónovou a opět 50 ml vody. Látka byla vysušena ve vakuu nad P₂O₃. ^{Ro ν}Υ^δυ^θηί byl produkt rozpuštěn v 25 ml koncentrované kyseliny octové obsahující 2N HC1 a 0,5 ml anisolu.

min byl do roztoku přidán etylether v množství 100 ml. Výtěžek reakce byl 82 %.

Pro další čištěn¹ b/la látka rozpuštěna v metanolu a chromatografována na koloně Sephadexu LH-20 za použití metanox·- ' činidla. Látka byla získána ve výtěžku 89 %. Charakte ristika sloučeniny vzorce III (HC1)₂ . Tyr-D-Ala-Gly-Phe-NH (III) nh₂-ch₂-ch₂-ch₂-co-nh je následující: M 26°, R_F= 0,44, aminokyselinová analýza:Ala:Gly:GABA:Pher:Tyr, 1,00:

0,97: 0,97: 1,10: 0,95. Pro C₂₇H₃₉OgN₇Cl₂ (628,63) vypočteno: 51,58 % C; 6,27 % H; 15,60 % N, nalezeno: 51,71 i.Cj 6,45 % H; 15,48 % N.

Příklad 3

0,01 molu hydrazidu tercbutyloxykarbonyl-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-phenylalaninu (Boc-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-NH-NH₂) bylo rozpuštěno v 30 ml dimetylformamidu a postupně přidáno 0,01 molu 2,4,5-trichlorfenylesteru kyseliny nikotinové spolu s 0,01 molu hydroxybenztriazolu. Směs byla míchána při teplotě místnosti po 18 h a poté byl produkt vysrážen přidáním 100 ml etylesteru kyseliny octové a 100 ml etyletheru. Sraženina byla odsáta a rozpuštěna ve 30 ml kyseliny octové obéahující 4N HC1 a 0,5 ml anisolu. Po 20 min bylo přidáno 100 ml etyletheru. Vysrážený produkt byl čištěn chromatografií na koloně Sephadexu LH-20 v metanolu, za použití metanolu jako elučního činidla. Výtěžek činil 65 %. Charakteristika sloučeniny vzorce IV (HCI)₂. Tyr - D -Ala -Gly -Phe - NH

ící:

1,01: 0,94. pro 53,70 % C; 5,58 [«]_D ²⁵= ¹⁰-⁸°' ^rF⁼ °'²⁷< ^29^35^6^7^^2 (648,61) % H; 14,98 % N.

aminokyselinová vypočteno: 53,70

1,00: 1,02: nalezeno:

analýza: Ala:Gly:Phe:Tyr, % C; 5,45 % H; 15,12 % N;

Příklad 4

0,01 molu hydrazidu tercbutyloxykarbonyl-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-fenylalaninu (Boc-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-NH-NH2) bylo rozpuštěno ve 40 ml dimetylformamidu a postupně k tomuto roztoku přidáno 0,01 molu Boc-Tyr-D-Arg <NC>2) a 0,05 molu hydrobenztriazolu. Po ochlazení na 0 °c bylo do roztoku přidáno 0,01 molu dicyklohexylkarbodiimidu. Po 1 hodině míchání při 0 °C byl roztok ohřát na teplotu místnosti a míchán dalších 12 hodin. Vysrážená dicyklohexyl-moČovina byla odsáta a z filtrátu byl vysrážen surový produkt přidáním 150 ml 1M NaHCO₃.

Produkt byl odsát a rozpuštěn ve 20 ml kyseliny octové obsahující 4N HC1 a 0,2 ml anisolu. Po 20 min bylo přidáno 100 ml metanolu a roztok byl redukován vodíkem v přítomnosti 10 %

Pd/C katalysátoru. Po šesti hodinách redukce byl roztok zahuštěn na 20 ml a bylo přidáno 100 ml etylesteru kyseliny octové. Surový produkt byl čištěn chromatografií na Sephadexu LH-20 v metanolu při výtěžnosti 43 %. Získaná sloučenina vzorce V (HC1)₃.Tyr-D-Ala-Gly-Phe-NH _{v)

Tyr-D-Arg-NH má následující charakteristiku:E°Q8,8°, R_F= 0,15, aminokyselinová analýza:Ala:Arg:Gly:Phe: Tyr, 1,00:0,92:0,95:1,03:1,92. Pro C₃₈H₅₄OgN₁₁Cl₃CH₃OH (931,45) vypočteno: 50,29 % C; 6,29 % H, 16,55 % N; nalezeno: 50,11 % C; 6,39 % H; 16,81 % N. V následující tabulce I jsou uvedeny některé biologické účinky čtyř nově synthetisovaných analogů.

Tabulka I

Biologické účinky nových analogů enkefalinu

Látka	Myší vas deferens ^IC50.^{n rao}^^u·1”^	Morčecí ileum IC5Q.n molu. V*¹	vazba na receptory IC^Q.n molu.l”^
I	4,5	84,8	3,2
II	520,0	50,1	1,1
III	140,0	25,0	2,8
IV	35,0		1,7

I1₃q = koncentrace (n molu.l“·*·) látky vedoucí k 50¾ inhibici stimulovaného biol. efektu.

BifunkČní peptidy umožňují nový přístup ke studiu různých interakcí na úrovni receptorů a samoregulačních mechanismů jednotlivých peptidů (Lipkowski et al., 1982, 1983). Struktura peptidů I - iv byla zvolena pro přípravu bifunkčních látek, ze kterých se mohou uvolňovat dvě biologicky aktivní složky v přítomnosti specificky působících peptidas.

Claims

PŘEDMĚT VYNÁLEZU

1. Analogy enkefalinu obecného vzorce I

Tyr-D-Ala-Gly-Phe-NH

X-NH kde X je zbytek Pro-Leu-Gly, kyseliny γ-aminomáselné, kyseliny nikotinové, nebo Tyr-D-Arg.
2. Způsob přípravy analogů enkefalinu vzorce I podle bodu 1, vyznačený tím, že se provede fragmentová kondenzace hydrazidu chráněného tetrapeptidu vzorce Tyr-D-Gly-Phe-NHNl·^ s komponentami ve významu uvedeném pro X ve vzorci I, potom se odstraní chránící skupiny a konečný produkt se čistí chromatograficky.