CS245313B1 - Sposob usměrněněj dediferenciačnej transformácie rastlinného organizmu pomocou 3-benzyloxykarbonylmetyl-2-benzotiazolinónu - Google Patents

Description

Vynález sa týká spósobu usmernenej dediferenciačnej transformácie bunlek a pletiv rastlinného organizmu v podmienkach „in vivo“ a „in vitro“ pomocou 3-benzyloxykarbonylmetyl-2-benzotiazolinónu.

Chemické regulátory rastu a delenía s vysokou biologickou aktivitou a selektivitou majú dnes vedúcu úlohu v usmernenej regulácii životné dóležitých procesov rastlinného organizmu. Používajú sa na zvyšovanie výnosnosti rastlín (Šebánek, J.: Sborník VŠZ, Brno, 2, 322—333, 1965; Nátr, L., Kousalo vá, I.: Studijní informace — základní a pomocné vědy v zemědělství. ŮVTI, Praha, 1973; Kutina J.: Regulátory rástu a její využití v zemědělství a zahradnictví, SZN, Praha, 1977) a pri štúdiu diferenciácie a dediferenciácie rastlinných buniek, pletiv a orgánov v podmienkach „in vivo“ a „in vitro“ (Thimann, Κ. V.: The auxins. In: Wilkins, M. B.: Thy Physiology of Plant Growth and Development — Ms Graw-Hill, London, p. 3 až 48, 1969; Gambur K. Z.: Biochimija auxina i jego dejstvije na kletky rastenij, Nauka, 272, 1976; Reinert, J., Bajaj Y. P. S.: Plant Cell, Tissune and Organ Culture, SpringerVerlag Berlin, Heidelberg, New York, p. 803, 1977).

Škálu látok, ktoré indukujú dediferenciáclu rastlinných buniek, okrem známých hormonálnych efektorov ako je napr. IAA, 2, 4-D, NAA, deriváty kinínu, giberelíny a retardanty, dnes rozširujú aj deriváty fluóru, amínofluoridy a morfaktíny — syntetické fluór-9-karbónové kyseliny a ich deriváty, ktoré zapríčiňujú depolarizáciu a degradáciu reprodukčného procesu, stimulujú činnost kambia, indukujú kalogenézu (Schneider G.: Morphactins: Physiology and Performance. Ann Rev. Plant Physiol., 21, 499 až 536, 1970; Miller, J. A.: Carcinogenesis by Chemicals: An OverView Cancer. Res., 30, 559—576, 1970).

V posledných rokoch boli dokázané dediferenciačné účinky aj u niektorých dalších auxinoidov indolylového radu. Niektoré z nich, napr. benazolín (4-chlór-2-oxo-benzotiazolín-3-octová kyselina) alebo benzotiazoliloctová kyselina (Ingram, D. S.; Butcher, D. N. Z. Pflanzenphysiol., 66, 206, 1972), ale aj deriváty 2-R-3-R¹-substituovaných benzotiazóllových solí (Sekerka V., Sutoris V.: AO 231 242), či deriváty kyseliny 2-oxo-3-benzotiazolín octovej (Sekerka V., Sutoris V. AO 231 241) sú rovnako aktivně v iníciácii a raste kalusov mnohých rastlín ako 2,4-D, alebo ju dokonca prevyšujú.

Podstata spósobu usmernenej dediferenciačnej transformácie buniek a pletiv rastlinného organizmu „in vivo“ a „in vitro“ spočívá v tom, že na rastlinný materiál sa pósobí derivátom 3-benzyloxykarbonylmetyl-2-benzotiazolinónom štruktúrneho vzorca s

@ -nch5lC00Ch₂-<O>

Preukazná transformácia rastlinných pletiv a buniek nastáva po pósobení látky v koncentrácii 10^-4 až 10~³ mol . dm³. Viditelné je inhibovaný predlžovací rast stonky a primárného koreňa. Pletivá hrubnú v prolongačnej zóně. Morfózy sa objavujú na apexoch stonky a koreňa. Na kořeni diferencujú bočné kořene následkom rýchlejšieho rastu vnútornej časti pletiv dochádza k roztrhnutiu povrchových vrstiev apexu, diferenciačnej a prolongačnej zóny a k tzv „vyzlečeniu koreňa“, oddeleniu povrchových kortikálnych vrstiev od vnútornej stržňovej časti, buňky ktorej intenzívně proliferujú. V obnaženej diferenciačnej zóně následkom inhibície rastu primárného koreňa bočné kořene vyrastajú husto vedl'a seba a vytvárajú pilkovité, alebo vejárovité morfózne útvary s typickou teratoidnou formou organlzácie.

Amorfně kalusy vznikajú dediferenciáciou v podmienkach „in vitro“. V štádiu primokalusu pletivo je rozpadavé na buňky. Po preočkovaní na čerstvé médium analogického zloženia ako bolo médium počas dediferenciácle, kalus zachovává typický neorganizovaný rast. Po aplikácii predmetnej látky na kalusové buňky čerstvá hmotnost' biomasy počas pretrvávajúcej dediferenciácie sa zvyšuje v závislosti od koncentrácie a času pósobenia látky s maximom účinnosti pri koncentrácii 10^-5 mol . dm^-3 (grafy 1.2).

Zlúčenina aplikovaná podlá vynálezu spósobuje morfogénne procesy a morfologické efekty známe po pósobení hormonálnych efektorov a to v podmienkach „in vivo“ a „in vitro“ (Obraz). Stupeň účinnosti predmetnej látky závisí od použitej koncentrácie.

Uvedené biologické účinky zvýrazňujú význam derivátu 3-benzyloxykarbonylmetyl-2-benzotiazolinónu ako potenciálneho induktora usmernenej dediferenciačnej transformácie organizmu a buniek rastlín, za účelom biotechnologických manipulácií.

Přiklad 1

V prvej sérii pokusov v podmienkach „in vivo“ k indukcii dediferenciácie boli použité klíčence rastlín (Vicia sativa L. var. Fatima; Vicia faba L. var. Inovec; Pisum sativum L. var. Smaragd j. Po inhibícii (6—16 hj v destílovanej vodě semená klíčili v expandovanom perlíte, v tme v termostate 72 ho245313 din. Potom bolí klíčence po omytí od perlitu osušené papierovou vatou, selektované a na ďalšie testy bolí použité klíčence s koreňom dlhým 25 až 30 mm +1 mm. Súbory klíčencov (5 ks) bolí vysadené v horizontálně) polohe na navlhčený filtračný papier do Petriho misiek priemerne] velkosti 17 centimetrov. Filtračný papier bol nasýtený účinnou látkou v koncentráciách 10², 10^-3, ΙΟ“⁴, ΙΟ-⁵, ΙΟ⁶, 10“⁷, 10~⁸, 10“⁹ mol . dm-³. Kontrolná séria klíčencov bola inkubovaná na filtračnom papieri, ktorý bol nasýtený destilovanou vodou. Indukcia dediferenciácie sa uskutočnila v termostate, v tme, pri 25 °C +1 °C počas 72 až 96 hodin. Efekt dediferenciačnej transformácie bol stanovený vizuálně pomocou mikroskopické) lupy. Maximálnu dediferenciačnú účinnosť spůsobuje skúmaná látka na klíčencoch rastlín po působení látky v koncentráciách 10“⁴ a 10~³ mol . dm-³.

Příklad 2

V druhej sérii pokusov v podmienkach „in vitro“ kalogenéza bola indukovaná na apikálnych segmentoch primárných koreňov viky siatej (Vicia sativa L. var. Solarka). Selektované semená) přibližné rovnakej velkosti a farby osemenia) boli sterilizované roztokom 5 % chloramínu 1 hodinu a niekolkokrát opláchnuté sterilnou destilovanou vodou. Sterilně semená klíčili v Petriho miskách na 0,8 % agarovom médiu 48 hodin v tme pri 25 °C +1 °C. K indukcii kalogenézy boli použité sterilně klíčence 25 až 30 mm +1 mm dlhé. Z nich boli dekapitované apikálne segmenty primárných koreňov v dížke 10 až 15 mm, ktoré boli vysadené do Petriho misiek v horizontálně] polohe na 0,6 % modifikované pevné agarovo médium podlá Murashige-Skooga. V pokusných variantoch médium obsahovalo účinná látku v koncentrácii 10~² až 10~⁹ mol.

. dm'³. V kontrolnej variante médium obsahovalo 2,4-D v koncentrácii 10^-5 mol .

. dm“³.

β

Kalogenéza bola indukovaná pri teplote 25 °C, v tme, počas 14 dní. Příprava skúmaného materiálu, ako aj kultivácia boli robené v aseptických podmienkach. Maximálna dediferenciačná účinnosť bola zistená pri koncentrácii 5 . 10“⁴ mol. dm“³.

Příklad 3

V tretej sérii pokusov bol zistený účinok látky na tvorbu čerstvej hmotnosti kalusového pletiva Haplopappus grácilis. Ako inokulum bol použitý kalus z kultúry nachádzajúcej sa v 53 pasáži, pestovanej na pevnom agarovom médiu podlá Murashige a Skooga. Počiatočná hmotnost inokula sa pohybovala od 1,1 do 2,3 g“¹.

V pokusnej sérii inokulum bolo vysadené do 100 ml Erlenmayerových baniek na pevné agarovo médium podlá Murashige a Skooga s obsahom účinnej látky ΙΟ“⁷, 10^_ΰ, 10 ~⁵, 10“³ mol . dm^-3 v jednotlivých variantoch. Kontrolná séria obsahovala ako fytohormonálny efektor 2,4-D v koncentrácii 10~⁵ mol . dm“³. Kultivácia prebiehala v termostate, v tme, pri teplote 25 °C. Odběry vzoriek boli robené na 7, 14 a 21 deň kultivácie v 10 opakovaniach. Gravimetricky bola vyhodnotená produkcia čerstvej hmotnosti (grafy). Maximálny nárast čerstvej hmotnosti bol dosiahnutý po působení účinnou látkou v koncentrácii 10“⁵ mol . dm“³. Legenda ku grafom:

Obr. 1 Čerstvá relativná hmotnost kalusov Haplopappus grácilis po působení účinnou látkou v g/1 g inokula.

Obr. 2 Percento čerstvej hmotnosti kalusov Haplopappus grácilis gak kontrola = 100 pere.) po působení účinnou látkou.

K = kontrola

10“⁷, 10^-6, 10~⁵, 10~³ mol. dm^-3 — účinná látka

Claims (1)

1. Sposob usmernenej dediferenciačnej transformácie rastlín vyznačujúci sa tým, že na rastlinný organizmus, pletivá alebo kalusové buňky sa pósobí derivátom 3-benzyloxykarbonylmetyl-2-benzotiazolinónom štruktúrneho vzorca o koncentrácii 10⁴ až 10“³ mol . dm^-3 v podmienkach ,,in vivo“ a 10“⁵ až 5 . 10^-4 mol . dm^-3 v podmienkach „in vitro“.