CS245290B1

CS245290B1 - Method of isocitratedehydrogenaze production

Info

Publication number: CS245290B1
Application number: CS987982A
Authority: CS
Inventors: Wulfdieter Schoepp; Hermann Tauchert; Marlis Grunov
Original assignee: Wulfdieter Schoepp; Hermann Tauchert; Marlis Grunov
Priority date: 1982-02-24
Filing date: 1982-12-28
Publication date: 1986-09-18
Also published as: SU1418338A1; BG47420A1; DD211933A3; DE3239904A1

Description

-2- ΟόΛΘΟΤΒ ΠρΗΜΘΗΘΗΗΒ Π300ρθΤΘΗΗΗ ΗβοόρθτθΗΗθ Kaoaeicfl cnocoóa nojiyveHun H3OHHTpaTseraj]pore-H33H, KOTOpaH HaXOflHT ΠρΗΜΘΗΘΗΗΘ B ΚΤΙΚΗΗΚΟ-ΧΚΜΗΗΘΟΚΟβ ΑΗΘΓ-hocthkc z b aHajfflTHKe nponyKTOB πητθηηη jiflsí KOjiiaraecTBeHHO-ro οπρθΛθΛβΗΗΗ H3OuarpaTa.

XapaKTapHCTHKa Ζ3ΒΘΟτηηχ τθχηηήθοκκχ ρθπιθηηη:

Cnocotí nOJiyneHÍLH ΗΒΟΏΖΤρδΤβθΓΗ,πρΟΓΘΗΘβΗ yw Η3ΒΘΟΤΘΗ. HaH-dojiea paonpocTpaHBHHHM μθτοαομ ββληθτοη nojiyvemie <£epMeHiaH3 ΟΒΗΗΗΟΓΟ Cepjiqa ( S. Ochoa in Methods in enzymologyHrsg. S.P. Colowick und N.D. Kaplan, Vol., S. 699-704,Academie Press New York 1955; W. W. Cleland, V.W. Thompsonund R.E. Barden in Methode in Enzyraology, Hrsg. J.M. Lowen-stein, Vol. XIII, S. 30-55, Academie Press New York (1969). 245290 -3-

Upn ποιήθηκε E3OHHTpawnwporeHa3U b ochobhom nocTynamTT9K, hto ηοχοληηζ Ma Tepna jí cbhhhoo cepjme cHanaJia μθχβηεήθο-KE ΡΘ3ΜΘΛ£Η8ΘΤΟΗ. OTCEffla HOJiyHaiOT όθΟΚΗΟΤΟΗΗΐώ ÓOJIKOBHfi SKCT-ρβκτ, HairpHMQp, o homouiljo ηθητρη^γεροβθιιηη. Ilpa yoKopoHEH b40 000 aKTEBKOCTB πο^ηθηηογο Φθρμθητθ cocTaBjmeT λο 0,4 ΗΕ/μγ,DpE 0ΟΛΘΘ ΗΕ3ΚΕΧ OÓOpOTaX ΟΗΘ ΗΒΧΘ. ΕθΛΗ SKCTpaKT ΠρΕΓΟΤΘΒΟ-βθθτοη H3 βηΖπθηηογο aiíSTOHOM noponuca, το HaHaxbBaa θκτεβηοοτβítocraraei 0,7 ΗΕ/μγ. ΙΙοορθλοτβομ μηογοκρθτηογο nepeocasflemmOyjILČjáaTOM ΘΜΜΟΗΗΗ ΕΛΗ 3TaH0JI0M φβρΜΘΗΤ ysaSTCH OdoraTHTL £0οπθπηφΕΗθοκοΑ θκτεβηοοτε β 2-4 ΗΕ/μγ, a nocjie nocjiejiyíomaS χρο-MaTorpa$HH,· Hanpmep, Ha ΟβφβΛθκοβ Γ 25 a KM-nejunM03a - λο3Η3ηθηε2 b 10-20 ΗΕ/μγ. IIpojiasHna npenapaTH εμθϊοτ oóhhho ax-TEBHOCTB B 2-4 ΗΕ/μγ (W ΜΘΗΒΙΠΘ 3 %) . #0 CEX πορ Ηθ Η3ΒΘ0ΤΘΗ CHOCOÓ ΠΟΛ^ΗΘΗΗΗ φθρΜΘΗΤΗ Ε30ΕξΕΤρθΤ-ΛΘΓΕίξρ0ΓΘΗ33Η ΜΗΒρΟόΕΟΛΟΓΕΠΘΟΚΕΜ ΠγΤΘΜ. ΗθΛΒ Η300ρθΤΘΗΕΗ Η300ρθΤΘΗΕΘ ΕΜΘΘΤ ΗΘΛΒΚ) Πρθ&ΚΟΧΗΤΒ TSKOŽ CHOCOÓ HOJiyHOHMφβρΜΘΗΤΘ, πρχ OCymeCTBJíeHHH ΚΟΤΟρΟΓΟ 3KTEBH0CTB Η3ΟΕ0ΪΤρ3ΤΛΘΠϋζ—poreHa3H yae b rpyóoM óojikobom θκοτρθκτθ εμθθτ βηθηθηεθ β 1-3ΗΕ/μγ, Tax ητο πο^ηθηεθ rpeóyeT 3Η3Ήετθλβηο μθηβιπεχ 3aTpar, ΗΘΜ ΠΟ Ε3ΒΘ0ΤΗΗΜ ΠΟ CEX ΠΟρ ΜΘΤΟΠΗΜ. Η3ιϋΟ2ΚΘΗΗΘ CyiUHOCTH Ε300ρθΤΘΗΕΗ 3anane2 ε300ρθτθηεη ηβληθτοη nojiyneKae ποορθποτβομ πρεμθηθηεηΜΕΚροόΕΟΠΟΓΕΗΘΟΚΟΓΟ ECTOHHHKa φθρΜΘΗΤΘ ΠρΕ ΟΟΒΜΘΟΤΗΟΜ ΠρΕΜΘΗΘ—hhe hoboíí TexHOJiormj BejiaeMoro Φθρμθητθ c bucqkoíí cneííHčgizreec-KOÍÍ aKTEBHOCTBK).

CoWiaCHO Ε300ρθΤΘΗΕΙ£> 38^3^ ρΘΙΚΘΤΟΗ T3KEM 0Ópa30M, HTO ffiOp-μθητ E30iJ5iTpa wrxflporeHa3a (HAJEi-3aBECHMul) πρεγοτοβλήθτοηE3 UITaMMa Pseudomonas putida ATGC 17633. KyJIBTHBHpo— βθηεθ nraaMMa ocymecTBJíneTCfl πρθημυπθοτβθηηο Ha 2 % arape npx 245290 -4- πρπ 4° C Β ΤΘΜΗΟΤΘ ΠΡΗ ΠρΗΜΘΗΘΗΗΗ βθΚΘΗΘ ΚΘΚ HOTOHHHKa yr-ΛθρΟίΒ Η (NH4)2S04 Κ9Κ HOTOHHHKa a30Ta.

KyJIBTHBIípOBaHHe Pseudomonas putida OCyiHeCTBJMeTCH ΠΟΟΛΘ3apaaeHita hojihoS KyjiBTypu npH leMiiepaiype ot 20 po 40° C(npeHMywecTBeHHO npa: 30° C) b oydMepcHOHHož KyjiBType Ha &ew-KOft ΜΗΗΗΜΘΛΒΗΟΖ Ορθβθ.

BapantuBaHna npoBOflHTca b ycjioBnax τθκογο γθθοβογο οοοτθβθB03jiyxa, npn κοτοροΜ odpa3OBaHne H3OHHTpaT£ara,nporeHa3H ηθΠΟΒΘΒΛΗΘΤΟΗ H3ÓHTK0M Β^ΤρΗΚΛΘΤΟΗΗΟΓΟ HAJ®. TaK K3K 3TO, HO-BHflHMOMy, xapaicrepHo, κθκ b cjiynae ηθηθλβηογο ροοτβ, τβκ hxrpu flOCTHKSHHH CTaUHOHapHOS φθ3Η, aKTHBHOCTB φθρΜΘΗΤΘ Π0Κ33Η—Β3ΘΤ OCTpuS MaKCHMyM, κοτορίώ ΛΟΟΤΗΓΘΘΤΟΗ B KOHUe JIOrapn^MH-ηθοκοζ $a3H pocia. Taxoe pa3BHTHe ημθθτ mgcto b βρηηιχηπθ πρπΠρΗΜΘΗΘΗΗΗ ΒΟΘΧ HCTOHHHKOB yraepOflB, ΚΟΤΟρΗΘ ΙΠΤΘΜΜ Β COCTOHHHHΗ0Π0ΛΒ30Β8ΤΒ. AÓCOJIETHHe 3Η3ΗΘΗΗΗ, ΚΟΤΟρΗΘ MOTyT ÓHTB HOCTET-HyTH Β ΜΘΚΟΗΜγΜΘ J&1SI ΘΚΤΗΒΗΟΟΤΗ φβρΜΘΗΤΘ, ΗΘΧΟΛΗΤΟΗ, 0ΛΗ3Κ0, Βθθβηοημοοτη κοκ οτ ΓΘ30ΒΗΧ ycjiOBHfi, τβκ η οτ ηοτοηηηκθ yrjiepo-ρ&. ΟΟΟόθΗΗΟ ΠρΗΘΜΛΘΜΗΜΗ ΟΚΘΘΗΒΘΙΟΤΟΗ ΤΘΚΗΘ ΒΘΙΠΘΟΤΒΘ, y ΚΟΤΟ-ΡΗΧ Β ΒρΟΧξθΟΟΘ ΟΚΗΟΛΘΗΗΗ ΒΟ3ΗΗΚΘΘΤ όΟΛΒΠΙΟΘ ΗΗΟΛΟ ΤΘΚΗΧ ΙφΟΜΘ-syTOHHHX npojiyKTOB (HanpuMep, θηθτοθχιθτθτ) , κοτορπβ πρπ orpa-ΗΗΉΘΗΗΟΜ 0ΗΘ0ΚΘΗΗΗ KHCJIOpOflOM B HX Λ9ΛΙ>ΗθίίΙΜΧ peaKUJlHX HOipeÓ-jlíhot HAJ® η. τθμ caMHM pereHepHpymT HAJJ+. ΠρΗΜθρ τθκηχ βκλοβΠρθΛΟΤΘΒΛΘΗ B TadJUEDP I. Β ΚΘΗΘΟΤΒΘ HCTOHHHKOB a30Ta ΠρΗΜΘΗΘΗΗΘ HaXOJOUH NH^Cl, (NH^SO^Η Τ.Π. Ho ΗΟΤΘΗΘΗΠΗ ΒρθΜΘΗΗ pOCTa OT 5 £0 40 H3C0B B 38ΒΗ0ΗΜ0—cth οτ Φηθηολογηηθοκογο cocTOSHHH h κοκηηθοτβθ sapaaaeMoro Ma-TepnaJia - daKTepnn cotínpaiOTCH, Hanpmiep, ΐίθΗτρΗφγρκροΒθΗΗθΜ,npOMHBaiOTCH φΟΟφθΤΗΗΜ dypepOM H npOBpamaKTCH B βθΚΠΚΗΘΗΗΘ B0θοκλθτοηηη2 SKCTpaKT, hto, Hanpmiep, μοκθτ ocymecTBJíHTBCHodpadoTKoií yjiBTpa 3syK0M npn TewnepaTypax βΟληθη τοίο eaMep-3θηηη c nocjxeAywiM ηθητρη^γηροβθηκθμ.

Coflepscamafíca β 0θοκλθτοηηομ rpyóoM θκοτρβκτβ φβρΜθΐιτ ποβ23η-BaeT b 3aBHCHM00Tn ot HCTOHHííKa yrjiepoxa npescTaB^eHHiíe b Tatí-ΛΗΙίθ I ΟΠΘΙξΗφίΓΪΘΟΚΗΘ aKTHBHOCTH. ΡθΗΒ Η^ΘΤ ΠρΗ 3Τ0Μ Od 9Μθρ- 245290 -5- chohhom KyjiLTHBHpoBaHHH Ha 2 $ arape. lípu cyÓMepcHOHHiix yc-JIOBHHX KyjIBTHBffpOBaHHH ΤΘΚΗΘ 3Η3ΗΘΗΚΗ aKTHBHOCTH .HOCTHraiOTCHnooae cooTBGTCTByícmaro οιιτημηροβηηκη raeoBoro cocTaBa h cko-pOCTH ΠΘΡΘΜΘΠΕΒΘΗΗΗ B 38BHCHM0CTíI OT KOHCTpyKOJIOHHUX ΠΒβΏΜΘΤ-poB φβρΜΘΗΤθΐίΗΟΗΗΟΓΟ cocyra. ΟΟΟύθΗΗΟ βηγοληηθ po3yjn>TaTn ΛΟ-CTnrajmc£ b cjiynae, ecra ι^λβτηββροβθηηθ npoBo;njuioc£ opu irpa-μθηθηηη yrjiQBOítopojioB b KanecTBe hgtohhhkob yrjiepo.ua, κοτορυθnOJÍBOflHJUIGB K φθρΜΘΗΤΘΙζΗΟΗΗΟΙ^ COCyjiy B ra300Ópa3H0M COGTOHHHK.H3 óecKJieToqHoro rpydoro deraoBoro 3KCTpaKTa wwpawwpo-reHa3a μοκθτ óhtb otíorameHa c homoiw ^paKUHOHspoBaHHoro ocasc-ΛθΗΗΗ COJIHMH UJDI 3KCTpaKHEie2, ΗΘΠρίΙΜθρ, C CyJIL$aTOM aMMOHHa,b 5-10 pa3. JUa θτογο κ rpydOMy dejiKOBOMy SKCTpaKTy jjoóaBJíaeT-ca TBepsuS cyji£$aT aMMOHHa λο κοηθηηοζ KOHneHipamm b 70 % Ha-cumeHjaa, irpaaeM Bca βκτηβηοοτβ nepexojmT b ocasoK. JDjia sajiB-HeSmero odorameima H3onjíTpaTsewporeHa3H octstok nepeMenmBa-erca Kasáme 5 MHHyT c pacTBopoM cyjií>$aTa θμμοηηη, cosepaamero0,05 mojií/ji NaH2P04 πρκ 0° C H cHHKawtxca KOHqeHTpaiiHaxcyjit$aTa θμμοηηη. Φθρμθητ pacTBopaeTca npa 3tom b B03pacTaranežοτθπθηη. OcHOBHoe KOjmecTBO pacTBopaeTca npn stom b irpoMeaiyT-κθ κοΗΐίβΗτρθίξΕώ cyjn>$aTa θμμοηηη Meawy 40 h 50 % ηθοηηιθηηη.Φθρμθητ cHOBa ocawaeTca sodaBJteraeM cyji£$aTa θμμοηηη λο ko-ΗΘΗΗΟϋ KOHIíeHTpaW b 70

UpnroTOBjíeHHHa coraacHO π300ρθτθηηχ) φβρΜβΗΤ χοροιπο coxpaHHM.lípu cnenjiqsneGKOH θκτηβηοοτη 5-10 mmojib/mhh/μγ óejiKa ycTaHOB—aeHO ηθ óoaee cjiejtywix ayaeposHHX θκτηβηοοτθ2: ajucorojiB-, MaaaT- h aaKTaT-r;ernj3poreHa3H, waa MeHee I %. H3on^TpaTAeninporeHa3a πριι πρημθηθηηη γηπρο$ο0ηο2 xpoMaTorpa-φιιπ, HanpHMep, Ha I0-KapóoKCimemajice$apo3e, μοηθτ óhtb odora-ineHa so cnenHč&oaecKofi θκτηβηοοτη b 50 HE/mt. ΗθοΟρθτθηηθ noacHaeTca Ha cjieryiomeM npmepe ocymecTBJíemia.HpiiMep ocyiuecTBJíeHna η300ρθτθηηη

KyjIBTHBHpOBaHHe Pseudomonas putida ATCC 17633 irpOBOJíHJIOCBb cpejje, coflepKameH Ha a cjieryiomíe οοοτθβηηθ nacTii:

KpHPO^, 7,46g; KaII2PO , 0,54 g; MgSO^ . 7 iI2Ú, 20 mg;

CaCl2 . 2 320, 20 mg; FeOTH^CSO^ . 6 H^O, ΊΟ mg; 245290 -6- B κθ^θοτβθ εοτοηηηκθ a3OTa cnywi; (nh4)2so4 (<ig/i).

JUH 3ΜΘΡΟΗΟΗΗΟΓΟ KyJIBTHBHpOBaHHH ΠΙΤ3ΜΜ3 B ΠρΟΰΐίρΚθ C KOCUM 2 % arapoM (ίηφκο-arap) arap npHroTaBjniBajiCH Ha ochobg βηπιθ-oniaoaHHoS cpesa. Ha npodnpKy npzMeHíuioGB 6 mji pacraopa arapa.3aTBepjieBaHE© arapa nonsHO ocymecTBjniTBCH b MaKcmajiBHo bos-MOKHOM ropH3OHTaJIBHOM HOJIOWHO UpOÓHpOK. JÍRA HOnnepjKaHKHunaMMa npotíHpKH nocjie nepeceBa Ha ποβθρχηοοτβ, HanpHMep, cΠΟΜΟΟΒΙΟ ΠΘΤΤΠΙ, CTaBHTGH ΒθρΤΗΚΘ JIBHO . B ββΚΛΚΗΘΗΙΙΘ SOÓaBJUHOT0,1 mji naicaHa, npaneM ποβθρχηοοτβ rejin tojibko b οοηοβθηιπι co-cyna πρηχοηπτ b οοπρηκοοηοβθηηθ c hctohhhkom yrjiepona.

Hocjie HHKyóanjm npn 25° C b τθήθηηθ πρη0λη3Ετθλβηο 60 nac.daK-ΤθρΗΗ CMHBaiOTOH C ΠΟΒθρΧΗΟΟΤΗ arapa ÍByMH mji 0,05 moji/ji φοο-$aTHoro dy$epa pH 7,5 (ΕθοθΜ*^ 2,5) η πρημθηηβτοη bzw 3apaJKe-hhh cydMepGHOHHOĚ KyjiBTypu. Hjiothogtb noceBHoro Ma Tepna JiaEgooM/>» 0,05. Hpn Kyjr&THBHpoBaHEH Ha yrjieBOflopoflax, HanpHMep,na γθκοθηθ, hotohhhk yrjiepona nonaeTcn nepea ra30By» cpeny.

TaK, B 10 JIHTpOBOM φθρΜΘΗΤΘTHBHOM COCyne C ΗΘΠΟΛΗΘΗΗβΜ £0 7 JInocTynjieHHe ra30B02 cmgch (2-10 Ji/nac) ocymecTBJíaeTCH nepe3conepjsamyro γθκοθη npoMHBHyio CKJiHHKy npH 30° C. Cpennee nocTyn-jieinie rencaHa b Φθρμθητββιιοηηημ oocyn npn θτηχ ycjioBHnx coc-TaBjíaeT okojio 5-10 MJi/nao. KyjiBTypaJiBHan čpěna ηητθηοηβηο ne-ΡΘμθιοηβθθτοη (800 oó/mhh). Hocjie KyjiBTHBHpoBaHHH b τθηθηηθ20-30 nac πρπ 30° C - MyraocTB cpenu οοοτθβληθτ nocjie stotoEg0QM/~< 2-4 - óaKTepmi oodHpaioTcn nocpencTBoii iíeHTpiírayriipoBa-HHH, npoMHBaiOToa poemathhm óypepow (0,05 mojib/ji, pH 7,5) hpa3pyinaioTCH b 3aKJiOTeHne c πομοιιιβιο yjiBTpa3ByKa irpu 4° C. Eec-KjieTonHLĚ rpyÓHÍi θκοτρβκτ nojiynaeTcn neHTpiigynrpoEaHiieM. One- * HH&raecxaH θκτηβηοοτβ H3Oin-iTpaTnerHnporeHa3u npn sthx ycjioBH-nx nocraraeT 3HaneKitíi 1-2 ΗΕ/μγ. Stot dejncoBiái rpytínii okct-paKT pa3BonETcn 0,05 mojib/ji $ocčpaTHHM dyňepow (pH 8) rq ro-οτηηθηηη conepscaHi-w dejiKa 5-20 mt/mji. οτογο pacTBopa upil4° C nyTeM nodaBJíGHHH cyjiB^ara θμμοηηη no Koi-iennoíi icořinoixpa-njffl no 70 % HacwHHa ocannaeTcn nonaBJUnonsK hoctb tíejiiía. 245290 -7- Qówasi θκτηβηοοτβ n3oxjjiTpaTflemflporeHa3H ηθχο^ητοη řepu θτομb ocajute. ΙΙοολθ yeHTpH^yinpoBaHiiH ocajtoK cycnoHflHpyoTCH irpu0° C b pacTBopa cyjii>$aTa θμμοηεη (40 % HacwHM b 0,05 μολβ/λNaoHP04) h b 3ax<JH0H©Kne cHOBa iíQHTpxKjyriípyeTC.H. Ποολθ ποβτο-pemifl upoiíeflypu, K3K npaBiuio, cBmne 80 % oómež θκτηβηοοτη H3O-BBTpawrivíporejiasH HaxojyiTCH b cynepnaTaHTe (cm. Tatíjnmy 2). Φθρμθητ CHOBa ocaswaeTCH nyieM λο08βλθηηη cyjiBqáaTa θμμοηηηflo kohohhož KOHiíeHTpaumí b 70 % HacumeHHa. Ecjm nojtyHeHHHíi no-cpeflCTBOM SKCTpaKmra cymgáaTa θμμοηηη cynepHaTaHT (2. cynep-HaTaHT 40 %) b xojnraecTBe 15 mji c co^epnaHneM tíajuca b 130 mtHaHocHTCH Ha KOJioHKy, Koiopan coaepsaiT 80 wi IO-KapdoKcnjienHJi-ce$apo3H h sjírapyeTCH npH 22° C 100-200 wl pacTBOpa cym>$aTaaMMOHHH (HacmueHiie b 40 %), to H3OHHTpaTí;exTiJíporeHa3a otíora-JuaeTca λο cnenja^araecKofi θκτηβηοοτη b 50 HE/mt. 245290 -8-

Taóona I ΟΠΘϋΗφΗπθΟΚΘΗ aKTHBHOCTL· Η30ΙΙΗΤρ3ΤΒΘΓΗ£Ρ0ΓΘΗ33Η B rpyÓOM3Κ0ΤΡ3ΚΤΘ H3 Paeudomonas putida ATCC 17633 H0CJI3 poCTaHa pa3jmHHh[x ucTOHHHKax yrxepo,na

Kyjn>THBnpoBaHiíe hpoboíjijiogb Ha kocom arape, npiaraeM ηοτοή-hhkh yřjaepofla noóaBJDumci, b KOHneHTpaw no 0,5 % Kajajmž.ΙΙοολθ HHKy.óanrazí b 24 naca npn 30° C óaKiepra ομηβθληοβ^Akthbhoctb onpesejiKHacB nocjie 3aMopaHHBaHHH—οττηηββηιιη kjxo-tok b npHcyTCTBini 0,1 % Τρητοκθ X 100.

Hctohhhk yrjieposa OOTHHecKan oothoctb E600 AKTHBHOCTí φορΜΘΗ-Ta (mmojil/mhh/μγ) LHTpaT 1,2 0,8 H30Hř[TpaT 1,0 0,7 a-KBTorjwTapaT 3,0 1,5 $yMapaT 2,5 1,2 cywtHaT 3,8 0,7 njipyBaT 3,4 1,4 D,L-MaJiaT 1,9 2,0 jiewtH 1,5 1,4 wiyTapaT 2,9 3,0 reiccaH 1,4 2,0 ΛΘΚΘΗ 1,5 1,1 245290 -9-

Taójmna 2 OÓOraiIlQHHO Η30Ι£1τρ9ΤΛΘΓΗβρ0ΓΘΗ331Ι H3 Pseudomonas putidanocpeflCTBOM SKCTpaKrpui cyjn>$aa?0M θμμοηηη OóihhS dejcoK Otímaa θκτηβ- ΟπθιφιΦη- Bekojc (μγ) HOCTL· (mmojil/mhh) necKaa qk—THBHOCTB(mmojxi>/mhh/ mt) Ppytíuž sKCTpaKTmna ocaflOK 70 % 5800 6080 1,04 I. cynepHaiaHT 40 % 1050 1650 1,5 27 2. oynepHaTaHT 40 % 550 4040 7,3 67 245290 -10- SQWJIA HSOEPEIEHHa

1. Cnocod nojiyneinui H3OOTTpawrworeHa3H oTjmnawíftcH ΤΘΜ, ΏΟ H3OHHTpawrHJiporSHa3a ΒΗΒΘΛΗΘΤΟΗ H3 ΙϋΤ3ΜΜ3 Pseudomonasputida ATCC 17633, Kyju»THBnpyeMoro b cyÓMepcHOHHOú

2. CnOCOtí HO HyHKTy I, OTJIHnaOWCH ΤΘΜ, HTQPseudomonasputida ATCC 17633 KyjLETHBHpyeTGH npEt TewmepaTypax 20-40° C B cytíMepCHOHHOÍi KyJIBType Ha WJCOfi MEHHMaJIBHOŽ ορθβθ, H HO Η0-TeneHm BpeMeHH pocia οτ 5 λο 40 nao. óaKTepm codnpaioTCfl,npo-MHBaiOTCH φΟΟφθΤΗΗΜ dy$QpOM Η ΠθρθΒΟΛΗΤΟΗ Β deOKJIQTO^HHŽ 3KCT-ρβκτ, Η3 κοτοροΓΟ φθρωθΗτ odoramaeTca nocpescTBOM φρβκηκοΗΗρο-Β3ΗΗ0Γ0 ΟΟΛΘΒΟΓΟ OCaWHHH, ΠρΗΊΘΜ 70^-ΗΟΘ ΗβΟΗΠξθΗΗΘ <NH4)2S04βθλθτ κ nojiHOMy ocaaweHHio φβρΜβΗΤΘ, τογλθ Κ3Κ 40-50^-ηοθ Haca-ΏθΗΗθ ποητη paciBopaeT. 3. Cnocod no nyHKTy 2, OT-mtawEScn τθμ, hto b KaneciBeuctohhhkob yxoiepona πρημθηθηηθ HaxojcaT iniTpaT, H3ontnpaT, a-KGTorjiyTapaT, $yMapaT, cyKnmiaT, wapyBaT, d,l -μβλθτ, JiefirpíH.iviyTapaT, reiccaH, λθκθη h τ.λ. β οτλθλβηοοιή ηλη β προηβΒΟΛΒ-ηηχ KOMdHHanaax. ' 4. Cnocod no nyHKTaM οτ I ro 3, OTjmnawtžcn τθμ, hto no^oflUTcn 0,3-1,5 λ B03syxa/rJi κκτθτθλβηοΕ: cpenn. 5. Cnocod no nyHKTaM οτ I ro 4, OTjnrcaiQiiiHScH τθμ, hto bKanecτβθ hctohhhkob yimepojia πρημθηηβτοη yrjieBOjiopojm γθκοθη,ΛΘΚΘΗ H Τ.Π., ΠΟβΒΟΛΗΜϋθ B ra300dpa3H0M COCTOHHHH. 6. Cnocod no nyHKTaM οτ I ro 6, OTmnawScfí τθμ, hton3ODjiTpaTíterHjiporeHa3a odoramaeica c homoiulio rnjpo^odHož xpo-MaTorpa^m Ha IQ-KapdOKCHKenjMC©$apo3e so 50 mmojib/mhh/μγ. 245290 -11-

AHHOTAW Ιί30<3ρθΤθΗΗθ KacaeTCH cnocoda noay^ieHHa H3onaTpaw:rawporeHa-3H. Oho meeT nejit© npejtioKHTt cnocotí nponywm stopo φορΜΘΗ-Ta, b nponecce κοτοροτο θκτηβηοοτβ H3onHTpaTneirmporeHa3U bI no 3 HE/μγ nocTuraeTCH y&e b rpytíoM βκοτρβκτθ. 3anana coctoht b tom, ητοόκ nocpencTBOM πρημθηθημη MKKpotíuaja>-ΗΟΓΟ HCTOHHHKa φθρΜβΗΤ3 B 00ΠΘΤ3ΗΗΗ C Ο£ΗΟΗ H3 HOBHX ΤΘΧΗΟΛΟ-γη2 nojiynuTt aejiaeMHÚ Φθρμθητ o bhcokož θκτηβηοοτβ©.

Sanana pemaeTcn nyTeM nojiynenan H3 niTaMMa Pseudomonas putidaATCC 17633, φθρΜθΗτβ. 24ό29ΰ

Claims

245290 ,2 Ρ δ Ϊ i) lí Ě Ϊ VYNÁLEZU

1. Způsob výroby izocitrátdehydrogenázy, vyznačující se tím, že izocitrátdehydrogená-za se získává z kmene Pseudomonas putida ATGC 17oJ3, pěstovaného submerzně na tekutémminimálním médiu.
2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že Pseudomonas putida ATCC 17633 sepěstuje při teplotách 20 až 40 °G na tekuté minimální půdě, a po uplynutí doby růstu od5 do 40 hodin se bakterie oddělí, proplachují fosfátovým tlumičem a převádí se na bez-buněčný extrakt, z něhož se ferment obohacuje pomocí frakcionovaného vysolování přičemž70% nasycení /NH^/gSO^ vede k úplnému vysolení fermentu e při 40 až 50% nasycení se ferment téměř rozpouští.
3. Způsob podle bodu 2, vyznačující se tím, že se jako zdroje uhlíku použije citrát,izocitrét, ketoglutsrát, fumarát, sukcinát, pyruvát, D, L-malét, leucin, glutarát,hexan nebo děkan samostatně nebo v libovolných kombinacích.
4. Způsob podle bodů l až 3, vyznačující se tím, že se přivádí 0,3 až 1,5 1 vzduchu/hlkultivačního média. 5· Způsob podle bodů 1 až 4, vyznačující se tím, že jako zdroje uhlíku se používajíuhlovodíky jako hexan a dekqn, přiváděné v plynném stavu.
6. Způsob podle bodů 1 až 5, vyznačující se tím, že izocitrátdehydrogenéza se obo-hacuje pomocí hydrofobní chromatografie na 1O-karboxydecylsefaróze do 50 mmol/min/mg. Uznáno vynálezem na základě výsledků expertizy, provedené Úřadem pro vynálezectvía patentnictví, Berlín, DD. Severografia, n. p., MOST Cena 2,40 Kčs