CS245159B1 - Spdsob přípravy zmesi sekundárných metabolitov antrachinónovóho typu - Google Patents

Description

Vynález sa týká sposobu přípravy zmesi sekundárných metabolitov atrachinónového typu.

Mnohé sekundárné metabolity mikroorganizmov sa vyznačujú biologickými účinkami a možno ich použit v boji proti patogénnym mikroorganizmom, parazitem, ako kancerostatiká a inak pósobiace farmakologicky účinné látky.

Niektoré z nich sa používajú ako východiskové zlúčeniny na přípravu semisyntetických derivátov S výhodnějšími alebo novými biologickými účinkami. Oblast použitia sekundárných metabolitov alebo ich semisyntetických derivátov s biologickou účinnosfiou zahrňuje humánnu a veterinárnu medicínu, rastlinnú a živočišnú výrobu, potravinárstvo a iné priemyselné výroby.

Medzi najvýznamnejšie sekundárné metabolity mikroorganizmov patria anitbiotiká a alkaloidy, ktoré majú najrozmenitejšie uplatnenie. V celom svete pokračuje vyhladávanie sekunrýrnych metabolitov mikroorganizmov a zistovanie možností ich praktického využitia.

Rózne kmene mikroskopisekej huby Trichoderma viride produkujú sekundárné metabolity rozmanitej chemickej štruktúry, napr. peptidové suzukacilíny a alameticíny,, steroidný viridín, epiditiodioxopiperazínový gliotoxín a trichotecénový trichodermín /R. J. Cole and R. H. Coxi Handbook of toxic fungal metabolites, Academie Press, New York 1981, V. Betinai The chemistry and biology of antibiotics, Elsevier, Amsterdam 1983/.

Z bližšie necharakterizovaných kmeňov T. viride boli izolované aj deriváty antrachinónu - pachybazín /3-metyl-l-hydroxyantrachinón/ a emodín /3-metyl-l,6,8-trihydroxyantrachinón/ /C.-K. Wati Microbial quinones, in A. I. Laskin and H. A. Lechevalier, editorsi CRC Handbook of microbiology, vol. III, Microbial products, CSC Press lne., Cleveland, 1973, pp. 183 až 260/.

Podlá PV 08189-83 autorov V. Betina a A. Fargašová mikroorganizmus Trichoderma viride CCM P-742 produkuje deriváty antrachinónu. AntrachinÓnové sekundárné metabolity majú rozmanité biologické účinky. Napr. antracyklínové antibiotíká sú kancerostatické a niektoré deriváty antrachinónu z húb mají antimikróbne, insektícídne /napr. rugulozín, J. Dobiáš, V. Betina a P. Nemec, Biológia 35 /1980/ 431 až 434 a iné biologické účinky.

Podstata sposobu přípravy zmesí sekundárných metabolitov antrachinónového typu podlá vynálezu spočívá v tom, že na kvapalnom médiu o p!t 6,0 až 6,5 obsahujúcom zdroje uhlíka, dusíka ako je kvasničný alebo kukuřičný extrakt a minerálnych látok, sa pri teplote 20 až 25 °C kultivuje mikroorganizmus Trichoderma viride CCM F-742 počas 15 až 25 dní, potom sa mycélium a filtrát kultivačného média podrobí extrakcii organickým rozpúštadlom typu chlórovaných uhlovodíkov, esterov kyseliny octovej alebo alifatických alkoholov obmedzene miešatelných s vodou, získaný extrakt sa po odpaření rozpúštadla rozpustí v acetone, adsorbuje na silikagél, eluuje zmesou benzén-acetón a z eluátu sa rozpúštadlá odparia.

Surová zmes antrachinónových metabolitov z mycélia a kultivačného média sa rozpustí v acetone a adsorbuje sa na 5-násobné množstvo silikagélu odpařením rozpúštadla za zníženého tlaku. AntrachinÓnové metabolity adsorbované na silikagéli sa nanesú na štipec silikagélu připravený suspendováním silikagélu v zmesi benzén-acetón. Elúciou zmesou benzén-acetón /lil alebo 2«3/ sa získá zmes antrachinónových metabolitov.

Zmes sa nerozpúšta vo vodě, rozpúšta se v metanole, acetone, octane etylnatom a chloroforme, slabo sa rozpúšta v benzéne, Zmes sa dá kvalitativně rozdělit tenkovrstvou chromatogr af iou na niekolko zložiek.

Uvedená zmes slúži ako východiskový materiál na přípravu čistých látok antrachinónového typu.

Příklad 1 kusov 1 000 ml Erlenmyerových baniek sa naplní po 300 ml kultivačného roztoku tohto zloženíai sacharóza 40 g, dusičnan sodný 3 g, hydrogénfosforečnan draselný 1 g, síran horečnatý 0,5 g, chlorid draselný 0,5 g, síran železnatý 0,01 g, kvasničný atuolyzát 5 g a 1 000 ml pitnej vody, pH před sterilizáciou 6,0 až 6,5. Sterilizuje sa pri 120 °C.

V kultivačných nádobách sa roztok naočkuje po 4 ml suspenzie spor mikroorganizmu Trichoderma viride CCM F-742, ktorá sa připraví zalitím vysporulovanej kultúry v 1 000 ml Erlenmayerových bankách po 125 ml sterilného 0,05 % vodného roztoku Tween 80 a uvolněním spor sterilnou skleněnou, tyčinkou. Kultivačně nádoby sa inkubujú pri laboratórnej teplote staticky za stálého osvetlenia alebo za striedanie dňa a noci 21 dní, keď sa dosiahne maximum produkcie antrachinónových metabolitov.

Příklad 2

Kultivačně médium po kultivácii kmeňa Trichoderma viride podlá příkladu 1 sa opatrene zleje a přefiltruje. Mycelium v Erlenmayerových bankách sa žaleje po 200 ml octanu etylnatého, ktorý sa nechá pósobiť 16 až 24 hodin pri laboratórnej teplote. Potom sa mycélium oddělí od extraktu vákuovou filtráciou a spojené extrakty sa zbavia vody filtráciou cez bezvodý síran sodný a získaný filtrát sa odpaří za zníženého tlaku. Získá sa 6 g surového preparátu.

Príklad3

K 12 1 filtrátu kultivačného média získaného podlá příkladu 2 sa přidá 6 litrov octanu etylnatého, dokladné sa premieša miešadlom po dobu 20 min a,obe fázy sa oddelia. K vodnej fáze sa pridajú 3 1 octanu etylnatého a postupuje sa ako pri prvej extrakci!. Spojené octové fázy sa zbavia vody filtráciou cez vrstvu bezvodého síranu sodného a získaný filtrát sa odpaří do sucha za zníženého tlaku. Získá sa 1 g surového preparátu.

Príklad4 g surového preparátu, získaného z mycélia podlá příkladu 2 a z filtrátu kultivačného média podlá příkladu 3 sa extrahuje 200 ml n-hexánu, extrakt sa odfiltruje a rozpúšťadlo sa odpaří za zníženého tlaku. Získá sa 4,45 g olejovitej zložky, ktorá sa ďalej nespracúva. Zvyšok surového preparátu sa extrahuje 1 000 ml octanu etylnatého, extrakt sa sfiltruje a rozpúšťadlo sa odpaří za zníženého tlaku. Získá sa 1 g surověj zmesi antrachinónových metabolitov.

Surová zmes sa rozpustí v acetone, přidá se 5 g silikagélu a za zníženého tlaku sa rozpúšťadlo odpaří. Silikagél s adsorbovanými metabolitmi sa nanesie na štipec silikagélu 3 x 30 cm, suspendovaného v zmesi benzén-acetón /95>5/, a eluuje sa zmesou benzén-acetón /1>1 až 2í3/. Zachytí sa frakcia žltavého až oranžového sfarbenia, ktorá obsahuje 6,5 g zmesi antrachinónových metabolitov.

Claims (1)

1. Spósob přípravy zmesi sekundárných metabolitov antrachinónového typu, hlavně hydroxyantrachinónov, vyznačujúci sa tým, že na kvapalnom médiu o pH 6,0 až 6,5 obsahujúcom zdroje uhlíka, dusíka ako je kvasničný alebo kukuřičný extrakt a minerálnych látok, sa pri teplote 20 až 25 °c kultivuje mikroorganizmus Trichodeřma viride CCM F-742 počas 15 až 25 dní, potom sa myoéllum a filtrát kultivačného média podrobí extrakci! organickým rozpúštadlom typu chlorovaných uhlovodíkov, esterov kyseliny octovej alebo alifatických alkoholov obmedzene miešatelných s vodou, získaný extrakt sa po odpaření rozpúštadla rozpustí v acetone, adsorbuje na silikagél, eluuje zmesou benzén-aceton a z eluátu sa rozpúštadlá odparia.