CS245159B1 - Spdsob přípravy zmesi sekundárných metabolitov antrachinónovóho typu - Google Patents

Abstract

Podstata sposobu tkvie v tom, že sa na kvapalnom médiu, obsahujúcom zdroje uhlíka, dusíka a minerálnych látok, kultivuje mikroorganizmus Trichoderma viride CCM F-742, potom sa mycélium a filtrát kultivačného média podrobí extrakci! organickým rozpúšťadlom typu chlórovaných uhlodovíkov, esterov kyseliny octovej alebo alifatických alkoholov obmedzene miešatelných s vodou, získaný extrakt sa po odpaření rozpúštadla rozpustí v acetone., adsorbuje sa na silikagél, eluuje zmesou benzén-acetón a zeluátu sa rozpúšťadlá odparia.

Description

245159 2

Vynález sa týká spósobu přípravy zmesi sekundárných metabolitov atrachinónového typu.

Mnohé sekundárné metabolity mikroorganizmov sa vyznačujú biologickými účinkami a možnoich použit v boji proti patogénnym mikroorganizmom, parazitom, ako kancerostatiká a inakpósobiace farmakologicky účinné látky.

Niektoré z nich sa používajú ako východiskové zlúčeniny na přípravu semisyntetickýchderivátov S výhodnějšími alebo novými biologickými účinkami. Oblast použitia sekundárnýchmetabolitov alebo ich semisyntetických derivátov s biologickou účinnosfiou zahrňuje humánnua veterinárnu medicínu, rastlinnú a živočišné výrobu, potravinárstvo a iné priemyselné výroby.

Medzi najvýznamnejšie sekundárné metabolity nikroorganizmov patria anitbiotiká a alka-loidy, ktoré majú najrozmenitejšie uplatnenie. V celom svete pokračuje vyhladávanie sekun-rýrnych metabolitov mikroorganizmov a zistovanie možností ich praktického využitia. Rózne kmene mikroskopisckej huby Trichoderma viride produkujú sekundárné metabolityrozmanitéj chemickej štruktúry, napr. peptidové suzukacilíny a alameticíny,, steroidný vl-ridín, epiditiodioxopiperazínový gliotoxín a trichotecénový trichodermín /R. J. Cole andR. H. Coxi Handbook of toxic fungal metabolites, Academie Press, New York 1981, V. BetinaiThe chemistry and biology of antibiotics, Elsevier, Amsterdam 1983/. Z bližšie necharakterizovaných kmeňov T. viride boli izolované aj deriváty antrachinó-nu - pachybazín /3-metyl-l-hydroxyantrachinón/ a emodín /3-metyl-l,6,8-trihydroxyantrachi-nón/ /C.-K. Wati Microbial quinones, in A. I. Laskin and H. A. Lechevalier, editorsi CRCHandbook of microbiology, vol. III, Microbial products, CSC Press lne., Cleveland, 1973,pp. 183 až 260/.

Podlá PV 08189-83 autorov V. Betina a A. Fargašová mikroorganizmus Trichoderma virideCCM P-742 produkuje deriváty antrachinónu. AntrachinÓnové sekundárné metabolity majú rozmanitébiologické účinky. Napr. antracyklínové antibiotiká sú kancerostatické a niektoré derivátyantrachinónu z húb mají antimikróbne, ínsektícídne /napr. rugulozín, J. Dobiáš, V. Betinaa P. Nemec, Biológia 35 /1980/ 431 až 434 a iné biologické účinky.

Podstata spósobu přípravy zmesi sekundárných metabolitov antrachinónového typu podlávynálezu spočívá v tom, že na kvapalnom médiu o p!t 6,0 až 6,5 obsahujúcom zdroje uhlíka,dusíka ako je kvasničný alebo kukuřičný extrakt a minerálnych látok, sa pri teplote 20 až25 °C kultivuje mikroorganizmus Trichoderma viride CCM F-742 počas 15 až 25 dní, potom samycélium a filtrát kultivačného média podrobí extrakcii organickým rozpúštadlom typu chló-rovaných uhlovodíkov, esterov kyseliny octovej alebo alifatických alkoholov obmedzene mieša-telných s vodou, získaný extrakt sa po odpaření rozpúštadla rozpustí v acetone, adsorbujena silikagél, eluuje zmesou benzén-acetón a z eluátu sa rozpúštadlá odparia.

Surová zmes antraohinónových metabolitov z mycélia a kultivačného média sa rozpustív acetone a adsorbuje sa na 5-násobné množstvo silikagélu odpařením rozpúštadla za zničenéhotlaku. AntrachinÓnové metabolity adsorbované na silikagéli sa nanesú na štipec silikagélupřipravený suspendováním silikagélu v zmesi benzén-acetón. Elúciou zmesou benzén-acetón/lil alebo 2«3/ sa získá zmes antraohinónových metabolitov.

Zmes sa nerozpúšta vo vodě, rozpúšta se v metanole, acetone, ootane etylnatom a chloroforme,slabo sa rozpúšta v benzéne, Zmes sa dá kvalitativně rozdělit tenkovrstvou chromatografiouna niekolko zložiek.

Uvedená zmes slúži ako východiskový materiál na přípravu čistých látok antrachinónového typu. 3 245159 Příklad 1 50 kusov 1 000 ml Erlenmyerových baniek sa naplní po 300 ml kultivačného roztoku tohtozloženíai sacharoza 40 g, dusičnan sodný 3 g, hydrogénfosforečnan draselný 1 g, síran horeč-natý 0,5 g, chlorid draselný 0,5 g, síran železnatý 0,01 g, kvasničný atuolyzát 5 g a 1 000 mlpitnej vody, pH před sterilizáciou 6,0 až 6,5. Sterilizuje sa pri 120 °C. V kultivačných nádobách sa roztok naočkuje po 4 ml suspenzie spor mikroorganizmu Tri-choderma viride CCM F-742, ktorá sa připraví zalitím vysporulovanej kultúry v 1 000 mlErlenmayerových bankách po 125 ml sterilného 0,05 % vodného roztoku Tween 80 a uvolněnímspor sterilnou skleněnou, tyčinkou. Kultivačně nádoby sa inkubujú pri laboratórnej teplotestaticky za stálého osvetlenia alebo za striedanie dňa a noci 21 dní, keď sa dosiahnemaximum produkcie antrachinónových metabolitov. Příklad 2

Kultivačně médium po kultivácii kmeňa Trichoderma viride podlá příkladu 1 sa opatrenezleje a přefiltruje. Mycelium v Erlenmayerových bankách sa žaleje po 200 ml octanu etylnatého,ktorý sa nechá pósobit 16 až 24 hodin pri laboratórnej teplote. Potom sa mycélium oddělí odextraktu vákuovou filtráciou a spojené extrakty sa zbavia vody filtráciou cez bezvodý síransodný a získaný filtrát sa odpaří za zníženého tlaku. Získá sa 6 g surového preparátu.

Príklad3 K 12 1 filtrátu kultivačného média získaného podlá příkladu 2 sa přidá 6 litrov octanuetylnatého, dokladné sa premieša miešadlom po dobu 20 min a,obe fázy sa oddelia. K vodnejfáze sa pridajú 3 1 octanu etylnatého a postupuje sa ako pri prvej extrakcii. Spojené octovéfázy sa zbavia vody filtráciou cez vrstvu bezvodého síranu sodného a získaný filtrát saodpaří do sucha za zníženého tlaku. Získá sa 1 g surového preparátu.

Príklad4 7 g surového preparátu, získaného z mycélia podlá příkladu 2 a z filtrátu kultivačnéhomédia podlá příkladu 3 sa extrahuje 200 ml n-hexánu, extrakt sa odfiltruje a rozpúštadlosa odpaří za zníženého tlaku. Získá sa 4,45 g olejovitej zložky, ktorá sa ďalej nespracúva.Zvyšok surového preparátu sa extrahuje 1 000 ml octanu etylnatého, extrakt sa sfiltruje arozpúštadlo sa odpaří za zníženého tlaku. Získá sa 1 g surověj zmesi antrachinónových me-tabolitov.

Surová zmes sa rozpustí v acetone, přidá se 5 g silikagélu a za zníženého tlaku sarozpúštadlo odpaří. Silikagél s adsorbovanými metabolitmi sa nanesie na štipec silikagélu3 x 30 cm, suspendovaného v zmesi benzén-acetón /95>5/, a eluuje sa zmesou benzén-acetón/1»1 až 2i3/. Zachytí sa frakcia žltavého až oranžového sfarbenia, ktorá obsahuje 6,5 gzmesi antrachinónových metabolitov. Γ·

Claims (1)

1. 245159 4 PREDMET VYNÁLEZU Spósob přípravy zmesi sekundárných metabolitov antrachinónového typu, hlavně hydroxy-antrachinónov, vyznačujúci sa tým, že na kvapalnom médiu o pH 6,0 až 6,5 obsahujúcom zdrojeuhlíka, dusíka ako je kvasničný alebo kukuřičný extrakt a minerálnych látok, sa pri teplote20 až 25 °c kultivuje mikroorganizmus Trichodeřma viride CCM F-742 počas 15 až 25 dní, potomsa mycélium a filtrát kultivačného média podrobí extrakci! organickým rozpúštadlom typu chlo-rovaných uhlovodíkov, esterov kyseliny octovej alebo alifatických alkoholov obmedzene mieša-telných s vodou, získaný extrakt sa po odpaření rozpúštadla rozpustí v acetone, adsorbujena silikagél, eluuje zmesou benzén-aceton a z eluátu sa rozpúštadlá odparia. Severografia, n. p., MOST Cena 2,40 Kčs