CS244306B1 - Blood gamma globulin preparation method with reduced hypotensive and anti complementary effect - Google Patents

Description

a

ČESKOSLOVENSKA SOCIALISTICKÁ REPUBLIKA (lfl) POPIS VYNALEZU k AUTORSKÉMU OSVEDťENIU 244306 til) (Bl) (51) Int. CM A 61 K 39/395 (22) Přihlášené 27 12 82(21) (PV 9674-82] OftAD PRO VYN, ALEZV (40) Zverejnené 17 09 84 (45) Vydané 15 11 87 A OBJEVY l75) „ „ ,

Autor vynálezu ŠTĚPÁNEK IVAN ing. CSc., SARISSKE MICHAEANY (54) Spásali přípravy krvného gama globulínu so zníženým hypotenzívnyma antikomplementárnym účinkom i.

Vynález sa týká sposobu přípravy krvné-ho gama globulínu, z normálně] alebo hy-perimúnnej plazmy, připadne z normálnehoalebo retroplacentárneho, připadne hyper-imúnneho séra, ktorý je určený pre terapeu-tické účely. Až doposiaí sa realizuje příprava gamaglobulínu pre terapeutické účely prevažnepodlá kritérií pre intramuskulárne podanie,t. j. kladie sa doraz na výfažnosf, elektro-foretickú čistotu a na obsah látok so schop-nosťou vyvolat pyretickú reakciu.

Na precipitáciu gama globulínu zo zme-si plazmatických alebo sérových bielkovínbol použitý síran amónny a hydroxid hlini-tý (Schultze Η. E., Matheka H. D.: Behring-werke Mitt. 28, 9, 1954; Schultze Η. E., Scho-nenberger M., Matheka H. D.: BehringwerkeMitt. 26, 21, 1952], rivanol (Hořejší J., Sme-tana R.: Acta Med. Scand. 155, 65, 1956), sí-ran sodný (Amiraian K., Leikhim E. ].: J. Im-munol. 87, 301, 1961), chlorid hlinitý (Le-win J.: Therapie 9, 523, 1954), DEAE celu-lóza (Sober H. A., Peterson E. A.: Fed. Proč.17, 1 116, 1958; Peterson E. A., Sober H. A.: J. Am. Chem. Soc. 78, 756, 1956; Fahey J. L.,Herbett A. P.: J. Biol. Chem. 234, 2 645, 1959;Stanworth D. H.: Nátuře 188, 156, 1960), ky-selina kaprylová (Steinbuch M., Audran R.:Rev. Franc. D‘etud. Clin. Biol., 14, 1054, 2 1969), ionty Zn++ a Al+ + + (Rejnek J., Škva-řil F.: Coll. Czechoslov. Chem. Commun. 22,1 489, 1957); Rejnek )., Škvařil F.: Coll. Cze-choslov. Chem. Commun. 23, 773, 1958; Krau-ze R., Naimski K., Zakrewski K.: Acta Bio-chim. Pol. 8, 209, 1961), polymetafosfát(Nitschman H. S., Rickli R., Kistler P.: VoxSang. 5, 232, 1960), éter (Pennell R. B. vPutnám F. W. /ed/ The Plasma Proteins volI Academie Press New York 1960, str. 9) aetanol (Cohn E. J., Gurd F. N. R., SurgenorD. M., Barnes B. A., Brown R. K., Derouaux G. , Gillespie J. M., Kahnt F. W., Lever W. F.,Liu C. H., Mittelman D., Mouton R. F.,Schmid K., Uroma E.: J. Am. Chem. Soc. 72,465, 1950; Deutsch H. F., Gostling G. L., Al-berty R. A., Williams J. W.: J. Biol. Chem.164, 109, 1946; Oncley J. L., Melin M., Ric-kert D. A., Cameron J. W., Gross P. M.: J.Am. Chem. Soc. 71, 541, 1949; Nitschman H. S., Kistler P., Lergier W.: Helv. Chim.Acta 37, 866, 1954; Kistler P., Nitschman H. S.: Vox Sang. 7, 414, 1962; Taylor H. L. BloomF. C., McCall K. B., Hyndman L. A., Ander-son H. D.: J. Am. Chem. Soc. 78, 1 356, 1956).

Preparáty gama globulínu připravené po- dá doposiaí' platných kritérií pre intramus- kulárne podanie majú zpravidla dokazatel- ný obsah histamínu, ďalej hypotenzívny a antikomplementárny účinok, čo je pre kva- 244306 244306 litu intravenóznych preparátov nepřípustné.Podanie intramuskulárneho preparátu tých-to kvalit intravenózne može v dósledku ná-hlého poklesu krvného tlaku pacienta ohro-zit a v dósledku antikomplementárnej akti-vity oslabit jeho nespecifická imúnologic-kú obranu.

Napriek tomu, že hypotenzívny účinok priintramuskulárnom podaní nemá taký prie-beh ako pri intravenóznom podaní možnoho označit spolu s vysokým antikomplemen-tárnym účinkom a dokazatelným obsahomhistamínu za vlastnosti nežiadúce pre pre-paráty gama globulínu, ktoré sú určené preterapeutické účely či už pre intramusku-lárne alebo intravenózne podanie.

Na odstraňovanie antikomplementárnejaktivity gama globulínu, ktorý bol připrave-ný zo zmesi plazmatických alebo sérovýchkrvných bielkovín bola použitá úprava hod-noty pH na 4,0 pri 24hodinovej inkubáciipri 37 °C (Barandun S., Kistler P., Jeunet F.,Isliker H.: Vox Sang. 7, 157, 1962).

Pokles antikomplementárnej aktivity ga-ma globulínu bol zaznamenaný po přidaníaktívneho uhlia (Steinbuch M., Audran R.,Amouch P., Blatrix C.: Vox Sang. 13, 103,1967), po přidaní tricalciumfosfátu (Stein-buch M., Audran R., Amouch P., Blatrix C.:Rev. med. Tours, suppl. No. 3, 79, 1968) apo přidaní albuminu (Auerswald W., Kiese-wetter E.: Wien. med. Wschr. 115, 690,1965).

Znižovanie antikomplementárnej aktivitygama globulínového roztoku pomocou pro-teolytického štiepenia bolo realizované pep-sínom (Schultze Η. E., Schwick G.: Dtsch.med. Wschr. 87, 1 643, 1962) a plazmínom(Sgouris J. T.: Vox. Sang. 13, 71, 1967; Ba-randun S., Castel F., Makula M. F., Morell A., Pian R., Škvařil F.: Vox Sang. 28, 157,1975).

Antikomplementárnú aktivitu gama glo-bulinovej molekuly je možné znížiť jej che-mickou redukciou beta merkaptoetanolom(Wiedermann G., Miescher P. A., FranklinE. C.: Proč. Soc. exp. Biol. Med. 113, 609,1963), modifikáciou beta propiolaktonom(Stephan W.: Z. kliň. Chem. 7, 282, 1969;Stephan W.: Vox Sang. 28, 422, 1975), re-dukciou s dithioerythritolom (Isenman D.E., Dorrington K. J., Painter R. H.: J. Immun.114, 1726, 1975), sulfonáciou (Masuho Y.,Tomibe K., Matsuzawa K., Ohtsu A.: VoxSang. 32, 175, 1977), amidáciou (Schmidt-berger R.: US Patent No 4 118 379 /1978/), re-dukciou s dithiothreitolom a alkyláciou sjodacetamidom (Fernandes P. M., LundbladJ. L.: Vox Sang. 39, 101, 1980) a redukcious dithiothreitolom v kombinácii s dithioe-rythritolom s následnou alkyláciou pomo-cou jodacetamidu alebo metyljodidu, akrylo-nitrilu, benzylbromidu, připadne etylénoxi-du (Schroeder D. D, Tankersley E. L., Lundb-lad J. L.: Vox Sang. 40, 373, 1981).

Antikomplemeníárna aktivita gama glo-bulínu súvisí jednak so vznikom polymérovgama globulínu, ktoré móžu vznikat' v pro- cese technologickej izolácie a jednak vzni-ká v procese lyofilizácie v dosledku inter-akcie nízkomolekulárnych látok s molekula-mi gama globulínu. Použitie destilovanej a-pyrogénnej vody pri separácii nízkomoleku-lárnych látok z gama globulínu jednak spo-sobuje precipitáciu najma vyšších polymé-rov gama globulínu a jednak odstránenienízkomolekulárnych látok, v dósledku čohopri lyofilizácii nemóže dójsf ku ich interak-cii s molekulami gama globulínu, číže ne-dochádza ku vzniku antikomplementárnejaktivity. Použitie vodného roztoku chlori-du sodného, v koncentrácii do 30 g na li-ter, zaručuje polymérom gama globulínu vroztoku potřebná stabilitu a dochádza lenku separácii nízkomolekulárnych látok, kto-ré spósobujú vznik antikomplementárnejaktivity v procese izolácie.

Antikomplementárna aktivita bola testo-vaná na základe úbytku aktivity komple-mentu. Úbytok známej hodnoty aktivity kom-plementu po přidaní známého množstva roz-toku lyofilizovaného gama globulinovéhopreparátu bol stanovený metodou podlá Ka-báta a Mayera (Kabát E. A., Mayer Μ. M.:Experimentální imunochemie ČSAV, Praha,1965, str. 180).

Efekt destilovanej apyrogénnej vody priodstraňovaní antikomplementárnej aktivityje možné dokumentovat u 10 experimentál-nych šarží gama globulínu, ktorý bol izolo-vaný pomocou extrakcie z frakcie III podláCohna a Oncleya. Pokial bola použitá samot-ná destilovaná apyrogénna voda bolo do-siahnuté zníženie antikomplementárnej akti-vity gama globulínu po lyofilizácii o 80 až95 °/o. Použitie vodného roztoku chloridusodného, za použitia toho istého gama glo-bulínového materiálu, v koncentrácii do 30gramov na liter spósobilo zníženie antikom-plementárnej aktivity gama globulínu polyofilizácii iba o 35 až 45 %. Pokial' niesu vroztoku gama globulínu přítomné jeho vyš-šie polyméry sá výsledky testovania anti-komplementárnej aktivity v lyofilizovanomgama globulinovom preparáte, z ktorého bo-lí odstránené nízkomolekulárné látky za po-užitia destilovanej apyrogénnej vody aleboza použitia vodného roztoku chloridu sod-ného do 30 g na liter prakticky rovnaké.

Hypotenzívny účinok bol testovaný na zá-klade poklesu krvného tlaku králíka pria-mou krvnou metodou podlá ČSL 3 (ČSL 3,svazok I., vydanie III., Avicenum Praha 1970,str. 149) s tým, že králíkovi o váhe 2 až 3 kgsa aplikujú 2 ml gama globulinového rozto-ku na kg hmotnosti. Obsah gama globulínuv aplikovanom roztoku je 50 g na 1 000 mlroztoku. U preparátov připravených podlánavrhovaného postupu sa hypotenzívná ak-tivita nevyskytovala v tak výraznej intenzi-tě, čo je možné dokumentoval údajom, žez 10 připravených experimentálnych šaržípodlá předloženého vynálezu bol stanovenýpokles systolického krvného tlaku maximál- 244306 ne o 4 až 8 % v porovnaní s tým istým ma-teriálom v tej istej dávke bez separácie níz-komolekulárnych zlúčenín, kde bol stanove-ný pokles systolickébo krvného tlaku od 20do 30 %.

Obsah histamínu bol testovaný Gadurno-vou modifikáciou (Gadum J. H.: J. Physiol8, 467, 1949) Magnusonovej metody (Mag-nus R.: Pltlg. Arch. 102, 123, 1904). U pre-parátov připravených podl'a navrhovanéhopostupu sa kotraktácie morčacieho čreva ne-vyskytovali, čo je možné dokumentovat úda-jom, že z 10 experimentálnych šarží připra-vených podTa předloženého vynálezu bolonájdené 0,0 mikrogramu histamínu na 100gramu gama globulínu v porovnaní s týmistým materiálom, ktorý bol lyofilizovanýbez predchádzajúcej separácie nízkomole-kulárnych látok, kde bol stanovený obsahhistamínu v koncentrácii 20 až 40 mikrogra-mov na 100 grarnov lyofilizovaného gamaglobulínu. Súčasná technologická prax na jednej stra-ně sice odděluje gama globulín od zmesiiných krvných bielkovín a jednak pri sepa-rácii a taktiež pri znižovaní antikomplemen-tárnej aktivity zanáša do roztoku gama glo-bulínu nízkomolekulárne látky anorganické-ho alebo organického charakteru. Principodstraňovania nízkomolekulárnych látok svyužitím dialýzy, oproti 0,1 až 0,3 %-némuvodnému roztoku chloridu sodného bol po-užitý u gama globulínu (Štěpánek I.: AO č.202 180; Štěpánek I., Uhrík J.: AO 208 868;Štěpánek I., Stachy A., Baria I., Banda I.:AO 204 168), ako aj u zmesného imunoglo-bulinového preparátu na báze IgG + IgA ++ IgM (Štěpánek I., Uhrík J.: AO 208 867).

Podstatou vynálezu je odstránenie balast-ných negamaglobulínových příměsí, ktorémajú, vzhiadom ku gama globulínu nižšiumolekulární! hmotnost. Za hraničně hodno-ty možno považovat údaje okolo 50 000 mo-lekulárnej hmotnosti. Východziou surovinou može byť pastafrakcie II, izolovaná metodou podlá Cohnaa Oncleya z normálnej alebo hyperimún-nej plazmy, připadne z normálneho aleboretroplacentárneho, připadne hyperimúnne-ho séra. Taktiež však možu byť použité biel-kovinné gama globulínové materiály izolo-vané pomocou iných metod.

Bielkovinný materiál sa rozpúšťa v takommnožstve destilovanej apyrogénnej vody oteplote 0 °C až +6 °C, aby sa hodnota kon-centrácie bielkovín nachádzala v rozmedzí10 až 180 gramov na liter, s optimom 60 až100 gramov na liter. Rozpúšťanie sa urých-l'uje miešaním. Po rozpuštění sa gama glo-bulínový roztok vyčíri, například filtráciou. V technologických pomeroch sú vyššie u-vedené optimálně podmienky zpravidla za-chované vtedy ak rozpúšťame 1 kg gamaglobulínovej pasty v 2 000 ml destilovanejapyrogénnej vody o teplote 0 °C až +6 °C.Hodnota pH takto připraveného gama glo-bulínového roztoku bývá spravidla v rozme- 8 dzí 4,0 až 8,0 a koncentrácia bielkovín vrozmedzí 60 až 100 gramov na liter. Taktopřipravený roztok gama globulínu sa vyčíri,například filtráciou, a nízkomolekulárnezlúčeniny do molekulárnej hmotnosti 50 000sa oddelia sposobom podl'a vynálezu ultra-filtráciou, diafiltráciou, gélovou filtráciou adialýzou, oproti destilovanej apyrogénnejvodě při teplote 0 °C až + 6 °C, pri pH 4,0 až8,0. Ďalej sa gama globulínový roztok pooddělení nízkomolekulových zlúčenín steri-lizuje, například filtráciou alebo pomocouiných metod, a potom sa zakoncentrováva,například lyofilizáciou alebo pomocou mem-brán, vákuovou destiláciou, vymrazovanímalebo inými metodami a v případe potřebysa podrobí ďalšiemu spracovaniu.

Vynález je ďalej objasněný na príkladochprevedenia, ktorými jeho rozsah nieje aniobmedzený ani vyčerpaný. Příklady prevedenia Příklad 1 Východzou surovinou može byť pasta frak-cie II izolovaná metodou podl'a Cohna a On-cleya z normálnej alebo hyperimúnnej plaz-my, připadne z normálneho alebo retropla-centárneho, připadne hyperimúnneho séras antibakteriálnou, antitoxickou alebo anti-virovou protilátkovou aktivitou. Bielkovin-ný gama globulínový materiál sa rozpúšťav takom množstve destilovanej apyrogénnejvody o teplote 0 °C až +6 °C, aby hodnotakoncentrácie bielkovín sa nachádzala v roz-medzí 10 až 180 gramov na liter, s optimom60 až 100 gramov na liter. Rozpúšťanie saurýchluje miešaním. Po rozpustnení sa ga-ma globulínový roztok vyčíri, například filt-ráciou. V technologických pomeroch sú vyššie u-vedené podmienky optima spravidla zacho-vané vtedy, ak rozpúšťame 1 kg gama glo-bulínovej pasty v 2 000 ml destilovanej apy-rogénnej vody o teplote 0°C až +6 °C. Hod-nota pH gama globulínového roztoku býváspravidla v rozmedzí 4,0 až 8,0 a koncen-trácia bielkovín v rozmedzí 60 až 100 gra-mov na liter. Takto připravený roztok puri-fikovaného gama globulínu sa vyčíri, na-příklad filtráciou a nízkomolekulárne zlú-čeniny sa z gama globulínového roztoku od-stránia: A. Gélovou filtráciou B. Dialýzou C. Ultrafiltráciou D. Diafiltráciou A. V súčasnosti existuje celá rada komerč-ných materiálov pre gélovú filtráciu na bá-ze dextranových gélov, pod označením Se-phadex, polyakrylamidových gélov, pod o- značením Biogel, hydroxyalkylmetakryláto-vých gélov, pod označením Spheron, poly-styrénových gélov, pod označením Styragel,polyvlnylacetátových gélov pod označenímMerckogel, porůzných silikátov, pod ozna-čením Porasil, a poréznych skiel pod ozna-čením Bloglas, ktoré majú odstupňovanévelkosti pórov v gélových časticiach a u-možňujú gélovň filtráciu v poměrně širo-kých rozmedziach molekulárnych hmotností.

Odstránenie nízkomolekulárnych zlúčenínsa prevádza elučnou gélovou chromatogra-fiou s destilovanou apyrogénnou vodou priteplote 0 °C až +6 °C, pri pH 4,0 až 8,0 s vy-lučovacou medzou gélu vyjádřenou moleku-lérnou hmotnosťou do 50 000, pričom je po-třebné uvedené materiály používat v opti-málnom zrnění zaručujúcom prietok v tech-nologických podmienkach.

Do kolony naplnenej s napučaným gélo-vým materiálom necháváme nasávat gamaglobulínový roztok takou rýchlosťou, abyprietok spodnou plochou kolony sa pohybo-val medzi 0,01 ml až 3,0 ml za minútu naplochu 1 cm2. Množstvo gama globulínové-ho roztoku nasadeného na kolonu nemá pře-kročit 25 až 30 % objemu gélovej časti ko-lony. Účinnost delenia je možné sledovatpodlá stupňa oddelenia etylalkoholu, chlo-roformu a ninhydrin pozitívnych látok z ga-ma globulínového roztoku. Pokial' by nedo-šlo ku dokonalému oddeleniu je potřebnézmenšit obsah vkládaného gama globulíno-vého roztoku na kolonu a spomalit prietok.Po separácii nízkomolekulárnych zlúženínz gama globulínového roztoku sa tento ďa-lej spracováva. B.

Dialýza sa v poslednom desaťročí znovuzačína uplatňovat najma pri výrobě liečivako technologická metoda separácie týchzmesí prírodných alebo syntetických látok,ktorých molekuly majú podstatné rozdielnúhmotnost. V súčasnosti existuje celá rada komerč-ných membrán pre dialýzu či už v podoběrovinnej membrány, alebo v podobě potru-bia o menlivom priemere a menlivej velkos-ti pórov na báze regenerovanej celulózy a-lebo jej derivátov, připadne na báze koló-dia a taktiež aj na báze vinylových polymé-rov.

Sterilný roztok purifikovaného gama glo-bulínu sa opatrné přesaje do sterilného dia-lyzačného potrubia, ktoré sa před zaháje-ním presávania v spodněj časti uzatvorí uz-lom a po přesátí sa vrchná část uzatvoríuzlom so smyčkou, za ktorú sa naplněné po-trubie zavěsí na háčik, ktorý je tak umiest-nený, aby roztok gama globulínu v dialy-začnom potrubí bol v styku s pretekajúcoudestilovanou apyrogénnou vodou pri teplo-tě 0 °C až +6 °C pri pH 4,0 až 8,0, pričomvelkost pórov v dialyzačnej membráně bymala byť tak velká, aby umožnila separá- ciu nízkomolekulárnych zlúčenín vyjádřenámolekulárnou hmotnos^ou do 50 000.

Koniec dialýzy je indikovaný negativnoureakciou na etanol, chlóroform a na ninhyd-rin pozitivně látky v pretekajúcej dialyzač-nej tekutině ako aj negativnou reakciou naetanol a chloroform v gama globulínovomroztoku. Po skončení dialýzy sa dialyzačnépotrubie s gama globulínovým roztokomzvesí z háčika, opatrné sa vyberie a po roz-strihnutí sa gama globulínový roztok prele-je do zbernej nádoby a ďalej sa spracováva. C.

Separácia relativné nízkomolekulárnychzlúčenín do molekúlovej hmotnosti do 50 000sa móže uskutočniť aj pomocou ultrafiltrá-cie, ktorú je možné uskutočniť v podobě du-tých nití, pričom gama globulínový roztokpreteká pod tlakom do 800 kP vo vnútri ni-ťovej membrány a cez póry v stene niťovejmembrány prestupujú relativné nízkomole-kulárne látky vo vodnom roztoku do zber-nej nádoby. Vzhladom na to, že roztok ga-ma globulínu sa pri ultrafiltrácii zakoncen-trováva prevedieme opatovné nariedenie sdestilovanou apyrogénnou vodou a toto za-koncentrovávanie, například na polovičnýobjem a narieďovanie na povodný objem pre-vádzame dovtedy pokial je reakcia gamaglobulínového roztoku na přítomnost chlo-roformu a etanolu pozitivna.

Ultrafiltráciu je možno realizovat aj v po-době kazetového systému, kde v rovinnomusporiadaní je alebo vyměnitelná membrá-na, alebo doska z umelej hmoty s definova-nými velkosťami pórov. Gama globulínovýroztok pod tlakom do 800 kP preteká, na-příklad nad membránou a cez póry v stenerovinnej membrány alebo došky z umelejhmoty prestupujú relativné nízkomolekulár-ne látky vo vodnom roztoku do zbernej ná-doby. Gama globulínový roztok sa v přípa-de potřeby ďalej spracováva.

Sterilizácia ultrafiltračného zariadenia saprevádza alebo parou alebo chemickou ces-tou, například prepláchnutím aparatúry vod-ným roztokom formalínu o koncentrácii do50 g na liter a následným vymytím formalí-nu sterilnou destilovanou apyrogénnou vo-dou. D.

Odstraňovanie relativné nízkomolekulár-nych zlúčenín do molekulárnej hmotnosti50 000 je možné uskutočniť aj pomocou dia-filtrácie čo je kombinácia dialýzy a ultra-filtrácie. Diafiltráciu je možné uskutočniťjednak v podobě dutých nití, pričom gamaglobulínových roztok preteká pod miernýmtlakom do 200 kP vo vnútri niťovej membrá-ny a cez póry v stene niťovej membrány pre-stupujú relativné nízkomolekulárne látky doz vonkajšej strany pretekajúceho roztoku 9 destilovanej apyrogénnej vody pri teplote0 CC až +6 °C pri pH 4,0 až 8,0, ktorý nízko-molekulárne látky odplavuje od niťovejmembrány do odpadu.

Diafiltráciu je možné realizovat aj v po-době kazetového systému, kde v rovinnomusporiadaní je alebo vyměnitelná membrá-na, připadne doska z umelej hmoty s defi-novanou veíkosťou pórov. Gama globulíno-vý roztok pod mierným tlakom do 200 kPpreteká, například nad membránou a cezpóry v stene rovinnej membrány alebo po-réznej došky prestupujú reálne velmi po-malým prietokom relativné nízkomolekulár-ne látky do pretekajúceho roztoku destilo-vané] apyrogénnej vody, ktorá preteká, na-příklad pod doskou alebo membránou a od-plavuje nízkomolekulárne látky do odpadu.

Vzhladom na to, že roztok gama globulí-nu sa pri diafiltrácii zakoncentrováva pre-vedieme opatovné nariedenie s destilovanouapyrogénnou vodou a toto zakoncentrováva-nie, například na polovičný objem a narie-dovanie na póvodný objem prevádzame do-vtedy, pokial je reakcia gama globulínové-ho roztoku na přítomnost chloroformu a e-tanolu pozitivna. Gama globulínový roztoksa preleje do zbernej nádoby a ďalej sa spra·cováva.

Sterilizácia diafiltračného zariadenia saprevádza alebo parou alebo chemickou ces-tou, například prepláchnutím aparatury vod-ným roztokom formalínu o koncentrácii do50 g na liter a následným vymytím formalí-nu sterilnou destilovanou vodou.

Dokaž chloroformu sa prevádza Fujiwaro-vou reakciou (Fujiwara: Sitzber. Naturw.Ges. Rostock 6, 33, 1916), či už v povodnomusporiadaní alebo v novších aplikáciach po-dlá Seta a Schultzeho (Seto T. A., SchultzeM. O.: Anal. Chem. 28, 1 625, 1956), Hildeb-rechta (Hildebrecht C. D.: Anal. Chem. 29,1 037, 1957), Friedmana a Coopera (Fried-man P. J., Cooper J. R.: Anal. Chem. 30, 1 674,1958).

Ninhydrin pozitivně látky stanovujemesposobom podlá Ruhemanna (Ruhemann S.:J. Chem. Soc. 97, 1 438, 1910). Stanovenie e-tanolu sa prevádza Agulhonovou reakciou(Agulhon H.: Bull. soc. chim. France /4/, 9,881, 1911) či už v původnom usporiadaní, a-lebo v novších aplikáciach podlá Kelletta(Kellett E. G.: Analyst 62, 728, 1937) alebo 10

Webba (Webb D. A.: Sci. Proč. Roy DublinSoc. 21, 281, 1936).

Gama globulínový roztok po oddělení níz-komolekulárnych látok sa sterilizuje, napří-klad filtráciou alebo inými metodami, a po-tom sa zakoncentrováva, například lyofili-záciou alebo pomocou membrán, vákuovoudestiláciou, vymrazovaním alebo inými me-todami, a v případe potřeby sa podrobí ďal-šiemu spracovaniu.

Použitie destilovanej apyrogénnej vody vporovnaní s použitím 0,1 %-ného až 3,0 %--ného roztoku chloridu sodného v destilova-nej apyrogénnej vodě je operatívnejšie atechnologicky 1'ahšie realizovatelné. Umož-ňuje použiť horúcu destilovaná apyrogénnuvodu, ktorá priamo vytiekla z destilačnéhoaparátu, po jej ochladení v prietokovom vý-menníku tepla bezprostredne ku technolo-gické] aplikácii, čím sa na minimum znižu-je možnost vzniku bakteriálněj kontaminá-cie. Použitie 0,1 %-ného až 3,0 %-ného roz-toku chloridu sodného v destilovanej apyro-génnej vodě vyžaduje nádobu na jeho zhoto-venie a skladovanie pri zvýšenej teplote, vy-lučujúcej možnost vzniku kontaminácie, akoaj zariadenie na zhomogenizovanie roztoku.Plynulý Chod technologickej linky využíva-júcej vodný roztok chloridu sodného vyža-duje minimálně 2 takéto nádoby.

Oddelovanie nízkomolekulárnych látok smolekulárnou hmotnosťou do 50 000 pomo-cou ultrafiltrácie, diafiltrácie, gélovej filt-rácie alebo dialýzy, proti 0,1 %-nému až3,0 %-nému roztoku chloridu sodného v des-tilovanej apyrogénnej vodě bolo vyššie po-písanými metodami, taktiež úspěšně odskú-šané v technologickom měřítku. Příklad 2 Východzou surovinou može byť bielkovin-ná pasta gama globulínu izolovaná aj po-mocou iných metod. Bielkovinná pasta ale-bo bielkovinný roztok sa spracováva v ďal-šom postupe podobné ako v případe č. 1 stým rozdielom, že kritérium odstránenia níz-komolekulárnycb zlúčenín z roztoku gamaglobulínu nesúvisí s prítomnosfou liehu a-lebo chloroformu, ale s prítomnosfou pre-cipitačnej látky, ktorá bola na oddelenie ga-ma globulínu použitá alebo s gama globulí-nom vytvára přechodný rozrušitefný kom-plex.

Claims (2)

11 12 244306 PREDMET

1. Spósob přípravy krvného gama globu-línu so zníženym hypotenzívnym a antikom-plementárnym účinkom spočívajúci v tom,že sa bielkovinný materiál obsahujúci puri-fikovaný gama globulín suspenduje za asep-tických podmienok v takom množstve apy-rogénnej destilovanej vody o teplote 0 °C až+6 °C, aby hodnota koncentrácie bielkovínsa nachádzala v rozmedzí 10 až 180 g/1, ga-ma globulínový roztok sa vyčíri, napříkladfiltráciou, oddelia sa nízkomolekulárne lát-ky pomocou ultrafiltrácie, diafiltrácie, gé-lovej filtrácie alebo dialýzy, oproti roztokuchloridu sodného v destilovanej apyrogén-nej vodě, potom sa gama globulínový roztoksterilizuje, například filtráciou a následné vynalezu sa zakoncentrováva, například lyofilizácioualebo pomocou membrán, vakuovou destilá-ciou, vymrazením a v případe potřeby sapodrobí ďalšiemu spracovaniu, vyznačujúcisa tým, že oddefovanie nízkomolekulárnychlátok s molekulovou hmotnosfou do 50 000sa prevádza pomocou ultrafiltrácie, diafilt-rácie, gélovej filtrácie alebo dialýzy, opro-ti destilovanej apyrogénnej vodě.

2. Spůsob přípravy podfa bodu 1, vyzna-čujúci sa tým, že bielkovinný materiál jenormálna alebo hyperimúnna plazma, při-padne normálně, retroplacentárné alebo hy-perimúnné sérum s definovanou antibakte-riálnou, antitoxickou alebo antivírusovouprotílátkovou aktivitou.