CS241341B1

CS241341B1 - Spílsob detekcie α-amyláz v géloch

Info

Publication number: CS241341B1
Application number: CS880584A
Authority: CS
Inventors: Peter Biely; Oskar Markovic; Danica Mislovicova
Original assignee: Peter Biely; Oskar Markovic; Danica Mislovicova
Priority date: 1984-11-19
Filing date: 1984-11-19
Publication date: 1986-03-13

Description

241341 4

Vynález sa týká sposobu detekcie a-arny-láz v géloch, a-amylázy sú súčasíou komplexu enzýmovživočišných a miikrobiálnych buniek kataily-zujúceho konverziu škrobu a glykogénu naglukózu. Predstavujú významná enzýmovúzložku biologických tekutin 1'udského orga-nizmu, ako je napr. krvná plazma, sliny amoč, kde sa vyskytujú vo viacerých formáchlíšiacich sa izoelektrickými bodmi.

Ceilková hladina «-amylázy v biologickýchtekutinách ako aj vzájomné zastúpenie jed-notlivých foriem alebo ich počet sú závisléod zdravotného stavu člověka a sú indiká-ciou niektorých ochorení ako je napr. hy-peramylazémia a pankreatitída [W. B. Salt,S. Schenker: Medicíně (Paris) 55, 269 (1976)].

Analýza mnohotných foriem amyláz sauskutočňuje aplikáciou účinných metod se-parácie bielkovín iv géloch (elektroforézou,izoelektrickoiu fokusáciou, připadne chroma-tografiou na tenkých vrstvách). Na sepa-račný krok musí však navazovat' spolahliváa rýchla metoda detekcie, resp. lokalizácieenzýmovej aktivity.

Najnovšie spósoby detekcie α-amyláz vgéloch využívají! ako substrát nerozpustnýškrob alebo amyilopektín sieťovaný epichlór-hydrínom s kovalentne naviazaným farbi-vom [J. Kamarýt, J. Zemek, E. Kuniak: ].Clin. Chem. Clin. Biochem. 20, 451 (1982);L. Royse, D. M. Jensen: Clin. Chem. 30, 387(1984)].

Principem. detekcie, ktorú povodně ,navr-hoil M. Česka, je uvofňovanie rozpustnýchfarebných fragmentov polysacharidu do roz-toku z nerozpustného substrátu v miestekontaktu substrátu s enzýmom lokalizova-ným vseparačno m géli [M. Česka: Biochem. J. 121, 575 (1971)].

Nerozpustný substrát sa aplikuje na se-paračný gél buď vo formě suspenzie v aga-rovom géli [M. Česka: Biochem. J. 121, 575(1971)], bud sa ním separačný gél posypea obraz ď-amyláz sa získá po převedení od-tlačku pomocou filtračnéhO' papiera [J. Ka-marýt, J. Zemek, E. Kuniak: J. Clin. Chem.Biochem. 20, 451 (1982)] alebo' separačnýgél sa priamo máča v suspenzii nerozpust-ného chromogénneho substrátu [L. Royse,D. M. Jensen: Clin. Chem. 30, 387 (1984)].

Pri posledně citovanej metóde dochádzak vyfarbovaniu miesta, kde sa nachádza en-zým iv separačnom géli, v důsledku difúzienízkomolekulárnych fragmentov polysacha-ridu do gélu v mieste štiepenia nerozpust-ného substrátu. Poměrně dobrá difúzia níz-komolekulárnych fragmentov však spósobu-je, že zóny na získaných zymogramoch súdosť neostré a z tohoto dóvodu nie přílišvhodné na detekciu minoritných a elektro-foreticky příbuzných foriem os-amyláz, kto-ré sa javia důležité právě z klinického hfa-diska [J. J. Zakowski, D. E. Bruns: Clin.Chem. 29, 2 095 (1982); P. Leclerc, J. C. Fo-rest: Clin. Chem. 1 020 (1983)].

Uvedené nevýhody v podstatnej miere od-straňuje spósob detekcie oj-amyláz v gélochpodfa vynálezu, kterého podstata spočíváv tom,že sa na agarový gél obsahujúci ko-valentne vyfarbený hydroxyetylškrob s dvoj-sodnou sofou l-amíno-2-sulfo-4-[3-(2-sulfá-toetylsulfonylanilíno) jantrachinénu, s obsa-hom 5,8 až 13,2 % hmot. tohto farbiva, po-sobí agarovým gélom obsahujúcim a/aleboneobsahujúcim αΐ-amylázy, načo sa vyfarbe-ný gél oddělí a vymyje vodným roztokemobsahujúcim 1 objem 0,05 až 0,2 mol. 1_1acetátového ipufru o pH 4,5 až 6,0 a 2 až 5objemov zmesi etanol—aceton 2:1 až 5:1obj., čím sa z gélu v mieste posobenia αι-a-myláz vymyjú enzýmom uvolněné farebnéfragmenty a miesta, kde α-amylázy neposo-bia, zostanú nezmenené. Výhodou tohto farebného substrátu je, žeje rozpustný vo vodě a v pufroch, ale dá saz týchto roztokov kvantitativné vyzrážaťzmesou etanolu a acetonu. Enzýmom uvol-něné fragmenty sa za podobných podmienoknezrážajú, čo umožňuje selektívne vymýva-nie degradovaného polysacharidu z agaro-vého gélu ‘v mieste kontaktu s «-amylázou. Výhodou sposobu detekcie týmto substrá-tom je, že pri detekcii «-amylázy v gélochposkytuje ostrejšie zóny mnohotných foriemenzýmu ako doteraz popísané metody, že jemimoriadne citlivý a umožňuje detekovatsubmikrogramové množstvá enzýmu a tiežumožňuje stanovit správnu dížku expozíciesubstrátu enzýmu tým, že transparentnostgélov umožňuje vizuálně sledovanie zmienv agarovom géli so substrátom. Přikladl

Sodná sol' O-{2-[3-(l-amíno-2-sulfoantra-chinón-4-ylamíno) f enylsulf onyl ] etyljhyd-roxyetylškrobu (150 mg) s obsahom 13,2 %'hmot. farbiva sodnéj soli 2-[3-(l-amíno-2--sulfoantrachinón-4-ylamíno)f enylsulf on-yl ]etyl- sa rozpustí za miešania v 10 ml des-tilovanej vody, zmieša sa s 20 ml 80, °C tep-lého roztoku 60 mg agaru v 0,2 mol. I-1acetátovéhoi pufru pH 4,5 a okamžité sa na-leje medzi dve priehfadné polyesterové fó-lie přilepené tenkou vrstvou silikonovéhooleja (DC-200) na skleněných doškách od-dělených od seba rámom z polyvinylchlori-du o hrúbke 0,8 mm.

Po stuhnutí sa farebný agarový gél použi-je na detekciu α-amyláz v separačných po-lyakrylamidových alebo agarózových gé-loch, připadne na inom materiáli. Gél, naktorom sa uskutoční separácia analyzova-ných bielkovín obsahujúcich α-amylázy, saokamžité po separácii překryje tenkým a-garovým gélom s farebným substrátom.

Na zamedzenie tvorenia bublin medzi o- boma gélmi je vhodné agarový gél so sub-

strátom predtým vyhriaf na teplotu 40 °C nad horúcou platňou. Spojené gely sa inku- bujú pri teplote 20 °C, kým sa v agarovej

Claims

241341 5 vrstvě se substrátom nezačnu objavovaťmiesta so změněným odtieňom modrej far-by, čo je spósobené degradáciou polymér-neho substrátu v mieste jeho· dotyku s en-zýmom. Po oddělení agarového gélu so substrátemod separačného gélu, na iktorom sa objavianevýrazné modré zóny v mieste výskytu «--amyláz, sa gél so substrátem ponoří dozmesi 0,05 mol. i-1 acetátový pufor (pH 4,5]— etanol—aceton (1:3:1, obj.], v ktorejsa ipóvodný enzýmom neatakovaný substrátnerozpúšťa a ani nezráža, ktorá však vymý-vá z gélu kratšie, enzýmom uvolněné fareb-né fragmenty. Po 5 hodinách držania agarovej replikyv odfarbovacom roztoku sa miesta cdpove-dajúce lokalitě os-amyláz objavia ako bledo-modré až úpilne bezfarebné zóny na tmavo-modrom pozadí. Příklad
2 Postupuje sa ako v příklade 1, s tým roz-dielom, že sa použije sodná sof 0-(2-(3-(1--amíno-2-sulfoantrachinón-4-ylamíno]fenyl-sulfonyljetyljhydroxyetylškrobu s obsahom5,8 % hmot. sodnéj soli 2-[3-(l-amíno-2--sulfoantrachinón-4-ylamíno)fenylsulfonyl]-etyl-, ktorej 300 mg sa rozpustí v 10 ml dest.vody a zmieša sa s 20 ml 80 °C teplého roz-toku 600 mg agaru v 0,2 mol. 1_1 acetáto-vého pufru ipH 4,5. Vynález má použitie v klinickéj biochemii,diagnostike a vo fermentačnom priemyslena detekciu a lokalizáciu α-amyláz v gélochso separovanými bielkovinami po> tenkovrst-venej chromatografii, elektroforéze aleboizoelektrickej fokusácii. PREDMET Sposob detekcie os-amyláz v géloch s hyd-roxyetylškrobom s kovalentne naviazanoudvojsodnou sofou l-amíno-2-sulfo-4-[3-(2--sulf átoetylsulf onylanilíno) ] antrachinónuvyznačujúci sa tým, že sa na agarový gélobsahujúci hydroxyetylškrob kovalentne vy-farbený s dvojsodnou sofou l-amíno-2-silfo--4- [ 3- (2-sulfátoetylsulf onylanilíno ] ] antra-chinónu, s obsahom 5,8 až 13,2 % hmot.tohto farbiva, působí agarovým gélom ob-sahujúcim a/alebo neobsahujúcim a-amylá- VYNALEZU zy, načo sa gél obsahujúci kovalentne vy-farbený hydroxyetylškrob s dvojsodnou so-fou l-amíno-2-sulf O-4- [ 3- (2-sulf átoetylsulf o-nylanilíno) ] antrachinónu oddělí a vymyjevodným roztoikom obsahujúcim 1 objem 0,05až 0,2 mol. i-1 acetátového ipufru o pH 4,5až 6,0 a 2 až 5 objemov zmesi etanol—ace-ton 2:1 až '5:1 obj., čím sa z gélu v mies-te posobenia os-amyláz vymyjú enzýmom u-vofnené farebné fragmenty a miesta, kdeα-amylázy neposobia, zostanú nezmenené.