Vynález se týká výroby opticky aktivních <f- -aminokyselin v laboratorním nebo v preparativním měřítku. Při výrobě se vychází z N-acyl derivátů racemických směsí aminokyselin a provádí se jejich, stereospecifická hydrolýza pomocí imobilisované aminoacylásy»· Štěpení racemické směsi se provádí pomocí katalysátoru sestávajícího s amynoacylasy imobilisované na nosiči s vynikající chemickou a mecha» nickou stabilitou. Při vazebné imobilisační reakci byl nalezen jednoduchý a efektní jednostupňový postup, který zachovává vysokou katalytickou aktivitu imobilisovaného enzymu. Imobilisace aminoacylasy se provádí na mikroporesním kopolymeru 2-hydroxyethylmethakrylátu s ethylendimethakrylátem, který byl povrchově modifikován epoxidovými skupinami. Imobilisační reakce probíhá v přítomnosti vyšších koncentrací solí, kterých se používá obvykle pro srážení bílkovin. Takto lze štěpit racemické směsi a získat čisté L- a D-aminokyseliny ze surovin přírodních původu i neproteinogenní kyseliny stejně jako aminokyselimy značené radioaktivními nebo stabilními isotopy.

(51) Int ClA

C 12 P 13/04

240 818

Vynález se týká způsobu výroby opticky aktivních -aminokyselin z racemických směsí pomocí enzymu aminoacylasy imobilisováného na makroporesním kopolymeru 2-hydróxyethylmethakrylátu s ethylendimethakrylátem.

Při chemické syntéze <*-aminokyselin se získávají opticky inaktivní racemáty L- a D-isomerů.L-konfigurace aminokyselin představují základní stavební jednotky přírodních bílkovin a tím důležité meziprodukty metabolismů.všech organismů. D-aminoky sel iny jsou významné na příklad jako součást molekul některých antibiotik.Proteinogenní i neproteinogenní opticky aktivní aminokyseliny vyvolávají stále větší zájem farmaceutického průmyslu,potravinářství,biochemického výzkumu a biotechnologie.

L-aminokyselin.y se připravují několika způsoby .Vedle výroby z biologického materiálu a stereospecifické syntézy některými mikroorganismy je chemická syntéza racemických směsí aminokyselin a jejich následné rozdělení hospodářsky velmi významné.Ke štěpení racemátů může být použito řady fysikálně chemických,chemických a biochemických metod (J.P.Gríeenstein and N.Winitz:Chemistry of the aminoacids,J.Wiley &

Sons Inc.New York/London,1961,VolI-III).Význam biochemických metod využívajících vysoké stereospecificity enzymů stále roste,přičemž se využívá enzymů v rozpustné nebo v imobilisované formě.Enzymy (na př.trypsin,chymotrypsin,karboxypeptidasa,pepsin,leucinaminopeptidasa,oxydasa L-aminokyselin) katÁLysují stereospecificky pouze reakci jednoho enantiomeru vhodných derivátů D,L-aminokyselin a ponechávají druhý beze změny.

Aminoacylasa se vyznačuje vysokou stereospecificitou, Širokou specifičností vůči substrátům a vysokým výtěžkem katalysy, takže se jedná o velmi vhodný enzym pro štěpení racemátů Nvacylováných D,L-aminokyselin. Protože však je aminoacylasa v roztoku poměrné málo stálá a rychle se desaktivuje, je stabilisace tohoto enzymu imobilisací na pevném nosiči velmi výhodná.Vazba aminoacylasy na nosiči podstatně zvyšuje jeho stabilitu,umožňuje snadné oddělení aktivního enzymatického

- 2 240 818 katalysátoru vázaného na nosiči od reakčních produktů a jeho opakované použití.

Aminoacylasa může být imobilisována adsorpcí na iontoměničích hospodárným postupem (T.Tosa,T.Moři,N.Fuse,I.Chibata,Enzymologie 31(1966)214;T.Tosa,T.Mori,N.Fuse,I.Chibata,Βιοί echnol.Bioeng. ,9(1967)603;T.Tosa,T.Mori,I.Chibata,Agr.Biol. Chem.,33(1969)1053.). Nevýhodou nekovalentní vazby aminoacylasy na iontoměniče je skutečnost,že se enzym při eluci pufry a roztoky substrátů z nosiče uvolňuje a vymývá.Přitom je nutno pracovat v relativně zředěných roztocích substrátů a životnost katalysátorů je značně omezena.

Při kovalentní imobilisaci enzymů na pevném nosiči se vytvářejí stabilní chemické vazby,takže je možno pracovat s poměrně koncentrovanými roztoky substrátů.Je známa řada speciálních postupů pro kovalentní imobilisaci aminoacylasy nebo její zabudování do polymerní sítě (T.SÁTO,T.Moři,T.Tosa,

I.Chibata,Arch.Biochem.Biophys.,147(1971)788;I.Chibata,T.Tosa, T.Sáto,T.Moři,Y.Matsuo,Proc.IV.IFS/Ferment.Technol.Today,

383(1972)383;M.Mašková, T.Barth,B.Jirovský,I.Rychlík,Coli. Czechosl.Chem.Commun.,38(1973)943,H.N.Weetall,C.C.Detar,Βίοι echnol.Bioeng. ,16(1974)1537;B.Szajani,K.Ivony,L.Boross,Acta Biochim.et Biophys.Acad.Sci.Hung.,15(196O)295;I.Willhardt,P. Hermann,DPR Pat.Anm.DD WP 123 188(1981).

Nevýhoda známých a citovaných kovalentně vázaných preparátů aminoacylasy spočívá především v tom,že se z části používá imobilisace na biopolymery,jejichž životnost je omezena na př. mikrobiálním odbouráváním.Jinou nevýhodou je pracnost, případně vysoké náklady na provedení aktivační reakce (některé aktivační procesy jsou zdravotně Škodlivé),které slouží k umožnění vzniku kovalentní vazby mezi nosičem a enzymem.

To se týká na př. aktivace polysacharidových nosičů rozpustnými karbodiimidy nebo bromkyanem.

Vynález je určen k přípravě opticky aktivních aminokyselin štěpením racemátů pomocí imobilisované aminoacylasy s použitím vysoce hospodárného postupu,který lze provádět v laboratorním měřítku v mikromolovém nebo v milimolovém objemu Zpracovávat lze směsi racemátů aminokyselin značených stabil-3 240 818 nimi isotopy nebo racemické směsi radioaktivních či neproteinogenních aminokyselin stejně jako proteinogenních aminokyselin v měřítku preparativním a výrobním.Přitom lze odstranit shora uvedené nedostatky známých postupů využívaných k imobilisaci aminoacylasy zejména při použití biopolymerů jako nosičů.

Podle vynálezu se dosahuje podstatného zvýšení mechanické a chemické stability,odolnosti vůči mikrobielní hydrolyse a získávají se výhodné .hydrodynamické vlastnosti imobilisováného enzymu.Další výhodou je odstranění některých aktivačních kroků,které představují,které představují technologickou komplikaci.

Předmětem vynálezu je způsob vazby aminoacylasy,která je určena ke štěpení racemických směsí na povrchově epoxidovaný makroporesní sférický kopolymer 2-s-hydroxymethakrylátu s ethylendimethakrylátem s vysokým výtěžkem enzymatické aktvity,prodloužením životnosti a stability vázaného enzymu.

Přitom odpadá pro kovalentní vazbu aminoacylasy obvykle nutná aktivace nosiče na př. sloučeninami obsahujícími aminoskupiny nebo aktivace sloučeninami jako rozpustný karbodiiipid, bromkyan nebo glutaraldehyd.

Podle vynálezu probíhá imóbilisace aminoacylasy jednoduchým procesem,přičemž se enzym rozpustí v tlumivém roztoku (při 7,O-8,5;O’,O5 - 0,2 mol/1),přidá se nosič (stupeň epoxidace 0,7-2,0 mmol/g; velikost částic 100-200/Um;vylučovací limit molekulové hmotnosti .200 000 - 5»10 ) a směs se za občasného protřepáni ponechá reagovat 5-40 hodin při teplotě 0 - 10°C.Pro dosažený stupeň enzymatické aktivity imobilisované aminoacylasy je přítomnost vyšší koncentrace soli jako na př. síranu amonného nebo fosforečnanu amonného (1,0 - 1,7 mol/1) v reakční směsi nutnou podmínkou.Obsah soli v tlumivém roztoku při vazebné reakci stabilisuje aminoacylasu a má za následek získání vysoce aktivního preparátu imobilisovaného enzymu.Takto imobilisovaná acylasa se ponechá reagovat s N-e<-acyl-DyL aminokyselinou známým způsobem v kontinuálním procesu v koloně nebo vsádkovým způsobem.Oddělení aktivní imobilisované aktivní aminoacylasy z reakční směsi na př.fil- 4 - 240 818 trací nebo odstředěním je následováno isolací L—aminokyšeliny známým postupem.N- ácyl+D-aminokyseliny,které nebyly aminoacylasou transformovány je možno následně chemicky hydrolysovat a tak získat D-aminokyseliny.Je možno též

-acyl-D-aminokyseliny opět raeemisovat a znova racemickou směs podrobit štěpení.

Imobilisace aminoacylasy na povrchu epoxiskupinami modifikovaného kopolymeru 2-hydroxyethylmethakrylátu s ethylendimethakrylátem dovoluje podstatnou úsporu času při přípravě vázaného enzymu.Jednostupňové vazebná reakce je jednoduchá, zdravotně nezávadná a velmi hospodárné.Díky dosažené vysoké stabilitě a životnosti (na př. aktivita po 4 týdnech představuje 85% výchozí aktivity,po 12 týdnech 57»5% a. po 5 měsících 33,25 % počáteční aktivity) může být vázaný enzym použit ke štěpení racemické směsi mnohonásobně a v delším časovém období.

V následujícím je předmět vynálezu vysvětlen na příkladech,které jej však nikterak neomezují...

Příklad 1.

Jako zdroje aminoacylasy bylo použito vepřových ledvin, z nichž byl enzym získán známým postupem (S.M.Birnbaum,L. Levintow,R.P.Kingsley,J.B.Grienstein,J.Biol.Chem.l94(1952) 455).Po lyofilisaci byl enzym jako suchý prášek uchováván v lednici,aniž byla pozorována při skladování změna jeho aktivity.

Částečně znečištěná aminoacylasa připravená shora uvedeným postupem byla rozpuštěna v 0,1 mol/1 fosfátovém pufru pH 7,0-8,5,byl přidán diamonium hydrogenfosfát v množství* které bylo menší než odpovídá koncentraci,při níž se začíná bílkovina srážet z roztoku a dále byl přidán makroporesní kopolymer 2-hydroxyethylmethakrylátu s ethylendimethakrylátem (vylučovací limit 200 000 - 700 000;velikost částic 100 až 200/Um; epoxidační stupeň 1,5-2,0 mmol/g) a směs byla udržována při teplotě 0 - 10°C při občasném protřepání po dobu 20 hodin. Po uplynutí reakční doby byl nosič odfiltrován a promyt roztokem NaCl 1,0 mol/1,roztokem substrátu a fosfá240 818 tovými tlumivými roztoky byly pak z něj odstraněny adsorbované bílkoviny .Imobilisovaná aminoacylasa na nosiči byla použita ve vsádkovám procesu ke štěpení 0,01 - 0,05 mol/1 chloracetyl-D,L-fenylalaninu.Obor pH 7,0-8,5,při teplotě 3O-55°C.

Po úplné deacylaci L-formy byl nosič odsát a uchováván ve vodném roztoku substrátu za přídavku thymolu.Reakční roztok obsahující L-fenylalanin,chloroacetát a chloracetyl-D-fenylalanin byl veden na silně kyselý katex v H⁺formě,na němž bylo provedeno rozdělení sloŽek.Chloracetyl-D-fenylalanin a chloroctová kyselina iontoměničem procházejí,zatímco na ionexů zadržený L-fenylalanin se v následujícím kroku des-orbuje vodným amoniakem az amoniakálního roztoku se získá krystalisací.

Příklad 2.

Imobilisace aminoacylasy byla provedena za podmínek analogických jako v příkladů 1 s tím roždílem,že místo fosfátu byla reakce provedena v přítomnosti síranu amonného a že kopolymér 2-hydroxyethylmethakrylátu s ethylendimethakrylátem měl vylučovací limit 5 000 000,velikost částic 100-300 yum_t stupeň epóxidace 0,7 - 1,2 mmol/g.Nosič promytý stejným způsobem jako v příkladu 1 byl naplněn do temperované skleněné kolony.Roztok 0,01 - 0,1 mol/1 acetyl-D,L-methioninu v pufru 7,0 - 8,5 byl při teplotě 3O-55°C čerpán kolonou tak,že na výstupu byla stanovena stoprocentní hydrolysa acetyl-L-methioninu.Eluét obsahuje L-methionin,kyselinu octovou a.acetyl-Dmethionin a zpracovává se dále způsobem analogickým jak bylo uvedeno v příkladu l.Acetyl-D-methionin byl po zahuštění známým postupem znova racemisován a vrácen na kolonu s imobilisovanou aminoacylasou.Vodným roztokem amoniaku z katexu desorbovaný L-methionin byl po zahuštění získán v.krystalické formě.