CS239424B1

CS239424B1 - Two component reagent for photometric determination of total bilirubin

Info

Publication number: CS239424B1
Application number: CS843086A
Authority: CS
Inventors: Vratislav Chromy; Marta Valickova
Original assignee: Vratislav Chromy; Marta Valickova
Priority date: 1984-04-26
Filing date: 1984-04-26
Publication date: 1986-01-16
Also published as: CS308684A1

Abstract

Sečení se týká dvousložkového činidla, "které sestává z pevné směsi, obsahující triazen, odvozený od;.2,’4-dichloranilinu, a alkalicky reagující látky a ze směsi kyseliny a neionogenního tensidu. Obě složky činidla jsou prakticky neomezeně stálé, jejich smícháním vzniká reakční směs, v níž se'okamžitě generuje reaktivní diazóniová sůl, · schopná kopulace s bilirubinem. Činidlo podle vynálezu se používá pro ezokopulační stanovení bilirubinu.The invention relates to a two-component reagent, which consists of a solid mixture containing a triazene derived from 2,4-dichloroaniline and an alkaline reacting substance and a mixture of an acid and a nonionic surfactant. Both components of the reagent are practically indefinitely stable, their mixing creates a reaction mixture in which a reactive diazonium salt is immediately generated, capable of coupling with bilirubin. The reagent according to the invention is used for the isocoupling determination of bilirubin.

Description

Předmětem vynálezu je dvousložkové činidlo pro fotometrické stanoveni celkového bilirubinu.The present invention provides a two-component reagent for the photometric determination of total bilirubin.

Zvýšené hodnoty bilirubinu v krevním séru, nazývané souborně hyperbilirubinemie, jsou ukazatelem řady výžných poruch. Proto je stanovení ebsahu bilirubinu jednou z nejčestěji prováděných analýz v klinické biochemii.Elevated blood serum bilirubin levels, called collectively hyperbilirubinemia, are indicative of a number of serious disorders. Therefore, the determination of bilirubin content is one of the most honestly performed analyzes in clinical biochemistry.

Pro stanovení, sérového bilirubinu byla popsána celá řada metod. Jednak jsou to přímé fotometrické metody, založené na abserbanci vzorku séra v pásu 440 až 460 nm, dále fotometrické stanovení bilirubinu po jeho oxidaci na zelený biliverdin, a konečně metody azůr kopulační. Prvé dva principy jsou užívány poměrně málo, nebol při analýze interferuje řada dalších pigmentů krevního séra, stanovení není specifické a je málo citlivé.A number of methods have been described for the determination of serum bilirubin. These are direct photometric methods based on the absence of a serum sample in the 440-460 nm band, photometric determination of bilirubin after its oxidation to green biliverdin, and finally methods of azo coupling. The first two principles are used relatively little, because many other blood serum pigments interfere in the analysis, the determination is not specific and is less sensitive.

Azokopulačni metody využívají k fotometriekému stanovení bilirubinu jeho kopulaci s některými typy diazoniových solí. Přímou kopulační reakci poskytuje jen konjugovaný bilirubin. Volný nekonjugovaný bilirubin reaguje jen v přítomnosti katalyzátorů či akcelerátorů, které uvolňují bilirubin z jeho bílkovinných komplexů a zvyšují jeho rozpustnost. Jako akcelerátory jsou užívány některé alkoholy, ethylenglykol, směs kofeinu s benzoanem sodným a octanem sodným, roztok kofeinu s močovinou a v poslední době povrchově aktivní látky, například neionogenní emulgátory přírodního nebo syntetického původu.Azocopulation methods utilize its coupling with some types of diazonium salts for photometric determination of bilirubin. Only conjugated bilirubin provides a direct coupling reaction. Free unconjugated bilirubin only reacts in the presence of catalysts or accelerators that release bilirubin from its protein complexes and increase its solubility. Certain alcohols, ethylene glycol, a mixture of caffeine with sodium benzoate and sodium acetate, a solution of caffeine with urea and recently surfactants, for example nonionic emulsifiers of natural or synthetic origin, are used as accelerators.

Vhodnou kombinací složek reakční směsi lze analytické postupy upravit tak, že je možné stanovit obsah celkového bilirubinu nebo jen obsah konjugovaného bilirubinu. V naprosté většině případů se stanovuje obsah celkového bilirubinu, zatímco stanovení obsahu konjugovaného bilirubinu je doplňkovým a specializovaným vyšetřením.By a suitable combination of the components of the reaction mixture, the analytical procedures can be adjusted such that the total bilirubin content or only the conjugated bilirubin content can be determined. In the vast majority of cases, the total bilirubin content is determined while the conjugated bilirubin content is a complementary and specialized examination.

Pro azokopulačni stanovení bilirubinu byla dlouhou dobu užívána diazotovaná kyselina sulfanilová. Později byla popsána řada dalších látek na bázi substituovaných anilinů.Diazotized sulphanilic acid has been used for a long time for the azocopulation determination of bilirubin. A number of other substituted aniline-based compounds have been described later.

Z nich byly, na základě optimálního pH reakční směsi, reakční doby, citlivosti, reprodukovetelnosti a stabilitě výsledného reakčního produktu vybrány diazeniové soli, odvozené od anilinu.From these, diazenium salts derived from aniline were selected based on the optimum pH of the reaction mixture, reaction time, sensitivity, reproducibility and stability of the resulting reaction product.

Azokopulačni činidlo se přitom připravuje buň na místě smícháním anilinu nebo jeho derivátů s kyselinou chlorovodíkovou a dusitanem sodným, popřípadě s akcelerátorem. Směs se nechá stát v chladu při teplotě 2 až 8 °C asi 15 min a pak je lze použít k vlastní analýze. Lze ale postupovat i tak, .že se k roztoku akcelerátoru, například k roztoku kyseliny chlorovodíkové s methanolem nebo detergentem, přidá diazoniová sůl příslušného derivátu anilinu s kyselinou fluoroboritou nebo s chloridem zinečnatým, z níž se uvolňuje působením kyseliny aktivní látka: Tyto postupy mají své specifické nedostatky. Příprava reakční směsi na místě diazotací anilinu jé zdlouhavá, musí být prováděna za chladu a nezaručuje činidlo o standardních vlastnostech a stabilitě. Optimální není ani použití tak zvaných stabilních diazoniových solí. Jedná se o látky citlivé na světlo, teplotu a vlhkost a účinkem těchto vlivů se diazoniové soli spontánně rozkládají. Z těchto důvodů například nelze většinu diazoniových solí tabletovat, musí být skladovány za snížené teploty a za nepřístupu světla, jinak nelze zaručit jejich použitelnost. Protože vyšetření obsahu sérového bilirubinu je důležitým biochemickým ukazatelem, má přesnost a správnost těchto analýz mimořádnou důležitost, de proto žádoucí provádět fotometrické stanovení bilirubinu s činidlem, které by nemělo uvedené nedostatky.The azo coupling agent is prepared by the cell in situ by mixing aniline or its derivatives with hydrochloric acid and sodium nitrite, optionally with an accelerator. The mixture is allowed to stand in the cold at 2-8 ° C for about 15 minutes and can then be used for analysis. However, it is also possible to add a diazonium salt of the corresponding aniline derivative with fluoroboric acid or zinc chloride from which the active substance is released by the action of an accelerator, for example to a solution of hydrochloric acid with methanol or detergent. specific shortcomings. The preparation of the reaction mixture on site by diazotization of aniline is tedious, must be carried out in the cold and does not guarantee an agent of standard properties and stability. The use of so-called stable diazonium salts is also not optimal. They are substances sensitive to light, temperature and humidity and due to these effects diazonium salts decompose spontaneously. For these reasons, for example, most diazonium salts cannot be tabletted, they must be stored at a reduced temperature and in the absence of light, otherwise their usability cannot be guaranteed. Since the examination of serum bilirubin content is an important biochemical indicator, the accuracy and accuracy of these assays is of utmost importance, therefore it is desirable to perform a photometric determination of bilirubin with an agent that does not have these deficiencies.

Výše uvedená nedostatky Odstraňuje dvousložkové činidlo pro fotometr!cké stanoveni celkového bilirubinu podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tem, že činidlo sestává z pevná emási obsahující na mel triazenu popřípadě alkalické soli triazenu obecného vzorceThe two-component reagent for the photometric determination of total bilirubin according to the invention is characterized in that the reagent consists of a solid emulsion containing triazene or alkali salts of triazene of the general formula

ClCl

N=N~NN = N ~ N

Cl v němž substituenty R, a R₂ značí nezávisle na sebž vodík, fenyl, alkyl s 1 až 4 atomy uhlíku, hydrexylalkyl s 1 až 4 atomy uhlíku, karhexyalkyl s 1 až 4 atomy uhlíku nebe SUlfealkyl s 1 až 4 atomy úhlíku, 0,01 až 1,2 mald alkalicky reagující látky, jak· například uhličitanů, fasfarečnanů nebe tetraberitanů alkalických kovů a popřípadě 0,01 až 50 molů neutrálních plnidel, jaké například chloridů, síranů nebe chleristenů alkalických kovů, laktesy nebe glukosy; a jejich smísí v poměru 1:10 až 10:1, a ze směsi, obsahující ne 1 mel anorganická nebe organická kyseliny, jaka například kyseliny chlorevodíková, sírová, fosforečná, chloristé, citrónová, emidosulfonová nebo fenylsulfonová nebo naftylsulfonová, 0,05 až 0,8 kg neionogenního tensidu, jako například ethoxylovaného oleylalkoholu, polyoxyethylenlauryletheru nebo p-isooktylfenoxypolyethoxyethanolu a popřípadě 2 až 2 500 molů vody.Cl wherein R 1 and R _{2 are each} independently hydrogen, phenyl, C 1 -C 4 alkyl, C 1 -C 4 hydroxyalkyl, C 1 -C 4 carhexyalkyl or C 1 -C 4 alkyl, C 1 -C 4 alkyl; 01 to 1.2 mald alkaline reacting substances, such as, for example, carbonates, phosphates or alkali metal tetraberates and optionally 0.01 to 50 moles of neutral fillers such as chlorides, alkali metal chlorides, sulfates or lactose or glucose; and mixtures thereof in a ratio of 1:10 to 10: 1, and from a mixture containing no inorganic or organic acids, such as hydrochloric, sulfuric, phosphoric, perchloric, citric, emidosulfonic or phenylsulfonic or naphthylsulfonic acids, 0.05 to 0 8 kg of a non-ionic surfactant such as ethoxylated oleyl alcohol, polyoxyethylene lauryl ether or p-isooctylphenoxypolyethoxyethanol and optionally 2 to 2500 moles of water.

Dvousložková činidlo podle vynálezu neobsahuje diazoniovou sůl nebo jednotlivé komponenty, nutné k jejímu vzniku, ale přísluěný výěe uvedený triazen, z něhož se azokopulace schopná diazóniová sůl generuje působením kysele reagující látky v okamžiku jejich smíchání v reakčním roztoku.The two-component reagent according to the invention does not contain the diazonium salt or the individual components necessary for its formation, but the corresponding triazene mentioned above, from which the azocopulation-capable diazonium salt is generated by the action of an acidic reagent when mixed in the reaction solution.

Výhodou činidla podle vynálesu je jeho prakticky neomezená stálost, nebol výěe uvedené triaseny tvoří pevné látky s většinou dobře definovaným bodem tání, které lze sušit nebo zahřívat nebo vystavit účinku světla, aniž by docházelo k jejich pozorovatelnému rozkladu a ke změnám jejich funkčních vlastností.An advantage of the inventive agent is its virtually unlimited stability, since the above-described triasses are solids with a mostly well-defined melting point which can be dried or heated or exposed to light without causing any noticeable decomposition and alteration of their functional properties.

Výěe uvedené triazeny jsou zejména v pevném stavu mimořádně stálé, jejich vodné alkalické roztoky jaou stabilní několik dnů. Přítomnost neutrálních plnidel má za účel doplnit objám pevná směsi triazenu a alkalicky reagující látky na takový objem, který usnadňuje další technologické zpracování buň navalováním pevné směsi nebo jejím tabletováním. Proto může popřípadě pevná směs obsahovat ještě další látky, jako jsou klousadla a rosvolňpvadla tablet, pokud neruší při vlastním stanovení bilirubinu.The above-mentioned triazenes are particularly stable in the solid state, their aqueous alkaline solutions being stable for several days. The presence of neutral fillers is intended to replenish the volume of the solid mixture of triazene and the alkaline reactant to a volume that facilitates further technological processing of the cells by rolling the solid mixture or tableting it. Accordingly, the solid mixture may optionally contain other substances, such as tablet tasters and tablet disintegrants, as long as they do not interfere with the bilirubin assay.

Složení druhá, kyselá reagující složky, je voleno tak, aby byl po přídavku pevná směsi s triazenea zaručen jeho okamžitý rozklad na příslušnou diazoniovou sůl, která je schopna kopulační reakce 8/ Óllirubinem. Neionogenní tensid v činidle podle vynálezu má své specifická funkce.' V případě krevního séra působí jako akcelerátor reakce volného bilirubinu, stabilizuje reakcí vytvořená azobarvivo v roztoku a zabraňuje tvorbě zákaiu v reakční směsi se sárem. Reakční směs, obsahující vodu a obě složky činidle podle vynálezu je pro dané analytická účely dostatečně stálá a lze ji bezpečně používat během 8 až 10 hodin po její přípravě.The composition of the second acidic reactant is selected such that upon addition of the solid mixture with triazene, its immediate decomposition to the corresponding diazonium salt capable of coupling with 8 / irllirubin is guaranteed. The nonionic surfactant in the agent of the invention has its specific function. In the case of blood serum, it acts as an accelerator of the reaction of free bilirubin, stabilizes the reaction-formed azo dye in solution, and prevents formation of haze in the reaction mixture with the serum. The reaction mixture containing water and both components of the reagent of the present invention is sufficiently stable for analytical purposes and can be safely used within 8 to 10 hours of its preparation.

činidlo podle vynálezu lze s výhodou připravit tak, že prvá alkalicky reagující, složka tvoří pevnou směs, druhá, kyselá, složka také pevnou směs nebo kapalný koncentrát či vodný zředěný roztok vhodný k přímému použití, což zaručuje dokonalou stabilitu činidla podle vynálezu jak při výrobě, tak i při expedici a vlastním ooužití, přičemž podle formy přípravy druhé, kyselé, složky, lze výhodně modifikovat pracovní postup při vlastním stanovení bilirubinu.the agent according to the invention can be advantageously prepared so that the first alkaline reacting component forms a solid mixture, the second acidic component also a solid mixture or a liquid concentrate or an aqueous dilute solution ready for use, which guarantees perfect stability of the agent according to the invention and in the case of expedition and self-use, whereby the method for preparing the second acidic component can advantageously be modified to modify the bilirubin assay itself.

Lze například zředěním obou složek činidla vodou připravijt pracovní roztok činidla, k němuž se přidá vzorek s bilirubinem, což je vhodná pro sériově prováděné analýzy. Při jednotlivých analýzách lze s výhodou postupovat tak, že k vodnému roztoku kyselé složky činidla se přidá vzorek a reakce se startuje vhozením tablety s alkalickou složkou činidla.For example, by diluting both reagent components with water, a working solution of the reagent can be prepared to which a bilirubin sample is added, which is suitable for serially performed analyzes. In the individual assays, it is advantageous to add a sample to the aqueous solution of the acidic component of the reagent and start the reaction by inserting the tablet with the alkaline component of the reagent.

Příprava činidla podle vynálezu je objasněna v následujících příkladech.The preparation of an agent of the invention is illustrated in the following examples.

Příklad 1Example 1

Připraví se pevná směs triazenu, obsahující 90 g 1-methyl-1-k^rbexymethyl-3-(2,4-dichlorfenyl)triazenu, 6,6 g uhličitanu sodného, 26 g laktózy a 460 g chloridu sodného.A solid mixture of triazene is prepared containing 90 g of 1-methyl-1-methylbenzyl-3- (2,4-dichlorophenyl) triazene, 6.6 g of sodium carbonate, 26 g of lactose and 460 g of sodium chloride.

Ze směsi se připraví tablety o hmotnosti 0,35 g. Před použitím ee 1 tableta rozpustí v 10 ml vody.Tablets weighing 0.35 g are prepared from the mixture. Dissolve 1 tablet in 10 ml of water before use.

Připraví se 8 000 sil koncentrovaného rozteku kyselé sležky, obsahujícího 2 400 g polyoxyethylenlauryletheru, 560 ml kyseliny chlorovodíkové 36 % a vodu. Před použitím se koncentrovaný roztek ředí v peměru 1:2 vodou.Prepare 8,000 forces of concentrated acid slurry containing 2,400 g of polyoxyethylene lauryl ether, 560 ml of 36% hydrochloric acid and water. Before use, the concentrated solution is diluted 1: 2 with water.

Pracovní roztok pro stanovení bilirubinu se připraví smícháním roztoků triazenu a kyselé sležky v poměru 1:2.The working solution for the determination of bilirubin is prepared by mixing the solutions of triazene and acid slurry in a ratio of 1: 2.

Příklad 2Example 2

Připraví se pevná směs triazenu, obsahující 100 g 1-methyl-1-eulfoethyl-3-(2,4-dichlor fenyl)triazenu, 10 g tetraboritanu sodného a 500 g síranu sodného.A solid mixture of triazene is prepared containing 100 g of 1-methyl-1-eulfoethyl-3- (2,4-dichlorophenyl) triazene, 10 g of sodium tetraborate and 500 g of sodium sulfate.

Připraví se vodný roztok kyselé sležky, obsahující 100 g kyseliny sírové a 50 g p-isooktylfenoxypolyethoxyethanolu v 10 1 vody.An aqueous acid slurry solution is prepared containing 100 g of sulfuric acid and 50 g of p-isooctylphenoxypolyethoxyethanol in 10 l of water.

Pracovní roztok pro stanovení bilirubinu se připraví tak, že se ve 100 ml rozteku kyselé složky rozpustí 1 g pevné směsi s triazenem.The working solution for the determination of bilirubin is prepared by dissolving 1 g of the solid mixture with triazene in 100 ml of the acid component solution.

Přiklad 3Example 3

Připraví se pevná směs triazenu, obsahující 50 g draselné seli 3-(2-karboxy-5-sulfefenyl)-1-(2,4-dichlerfenyl)triazenu a 350 g hydrogenfesforečnanu lithného. Ze směsi se připraví tablety o hmotnosti 0,050 g.A solid mixture of triazene is prepared containing 50 g of potassium sell of 3- (2-carboxy-5-sulfephenyl) -1- (2,4-dichlorophenyl) triazene and 350 g of lithium hydrogen phosphate. Tablets weighing 0.050 g are prepared from the mixture.

Připraví se kyselá složka ve formě pevné směsi, obsahující 200 g bezvedé kyseliny citrónové a 90 g ethoxylovaného oleylalkoholu. Před použitím se celé množství směsi rozpustí v 1 000 ml vody.An acid component is prepared in the form of a solid mixture containing 200 g of anhydrous citric acid and 90 g of ethoxylated oleyl alcohol. Before use, the entire amount of the mixture is dissolved in 1000 ml of water.

Reakční směs pro stanovení bilirubinu se připraví tak, že ke 3,0 ml rozteku kyselé sležky se přidá vzorek a 1 tableta směsi triazenu.The reaction mixture for the determination of bilirubin is prepared by adding a sample and 1 tablet of triazene mixture to 3.0 ml of acidic slurry.

PřikládáHe attaches

Připraví se pevné směs triazenu, obsahující 100 g 1-methyl-1-karbexymethyl-3-(2,4-dichlorfenyl)triazenu, 50 g hydrogenuhličitanu sodného, 25 g laktázy a 5 000 g chloridu sodného.A solid mixture of triazene is prepared containing 100 g of 1-methyl-1-carbexymethyl-3- (2,4-dichlorophenyl) triazene, 50 g of sodium bicarbonate, 25 g of lactase and 5000 g of sodium chloride.

Ze směsi se připraví tablety o hmotnosti 0,050 g. Připřeví se 1 000 ml vodného roztoku kyselé složky, obsahujícího 0,15 melu kyseliny chleristé a 50 g pelyexyethylenlauryletheru.Tablets weighing 0.050 g are prepared from the mixture. 1000 ml of an aqueous solution of the acid component containing 0.15 mole of hypochlorous acid and 50 g of pelyexyethylene lauryl ether are added.

Reakčnl směs pro stanovení bilirubinu obsahuje 2,0 ml roztoku kyselé složky a tabletu činidla s triazenem a vzarek.The reaction mixture for the determination of bilirubin contains 2.0 ml of the solution of the acid component and the triazene reagent tablet and a sample.

Claims

A two-component reagent for the photometric determination of bilirubin, characterized in that it consists of a solid mixture containing per mole of triazene or triazene alkali salt of the general formula:

Cl wherein R 1 and R 8 are independently hydrogen, phenyl, C 1 -C 4 alkyl, C 1 -C 4 hydroxyalkyl, C 1 -C 4 carboxyalkyl or C 1 -C 4 sulfoalkyl, 0.01 up to 1.2 moles of an alkali reactant such as alkali metal carbonates, phosphates or tetraborates and optionally 0.01 to 50 moles of neutral fillers such as alkali metal chlorides, sulfates or perchlorates, lactose or glucose and mixtures thereof in a ratio of 1:10 to 10 And from a mixture containing per mole of inorganic or organic acids such as hydrochloric, sulfuric, phosphoric, perchloric, citric, amidosulfonic or phenylsulfonic or naphthylleulfonic acids 0.05 to 0.8 kg of nonionic surfactant such as ethoxylated oleyl alcohol, polyoxyethylene lauryl ether, or p-isooctylphenoxypolyethoxyethenol and optionally 2 to 2500 moles of water.