CS239424B1 - Dvousložkové činidlo pro fotometrické stanovení celkového bilirubinu - Google Patents

Abstract

Sečení se týká dvousložkového činidla, "které sestává z pevné směsi, obsahující triazen, odvozený od;.2,’4-dichloranilinu, a alkalicky reagující látky a ze směsi kyseliny a neionogenního tensidu. Obě složky činidla jsou prakticky neomezeně stálé, jejich smícháním vzniká reakční směs, v níž se'okamžitě generuje reaktivní diazóniová sůl, · schopná kopulace s bilirubinem. Činidlo podle vynálezu se používá pro ezokopulační stanovení bilirubinu.

Description

Předmětem vynálezu je dvousložkové činidlo pro fotometrické stanoveni celkového bilirubinu.

Zvýšené hodnoty bilirubinu v krevním séru, nazývané souborně hyperbilirubinemie, jsou ukazatelem řady výžných poruch. Proto je stanovení ebsahu bilirubinu jednou z nejčestěji prováděných analýz v klinické biochemii.

Pro stanovení, sérového bilirubinu byla popsána celá řada metod. Jednak jsou to přímé fotometrické metody, založené na abserbanci vzorku séra v pásu 440 až 460 nm, dále fotometrické stanovení bilirubinu po jeho oxidaci na zelený biliverdin, a konečně metody azůr kopulační. Prvé dva principy jsou užívány poměrně málo, nebol při analýze interferuje řada dalších pigmentů krevního séra, stanovení není specifické a je málo citlivé.

Azokopulačni metody využívají k fotometriekému stanovení bilirubinu jeho kopulaci s některými typy diazoniových solí. Přímou kopulační reakci poskytuje jen konjugovaný bilirubin. Volný nekonjugovaný bilirubin reaguje jen v přítomnosti katalyzátorů či akcelerátorů, které uvolňují bilirubin z jeho bílkovinných komplexů a zvyšují jeho rozpustnost. Jako akcelerátory jsou užívány některé alkoholy, ethylenglykol, směs kofeinu s benzoanem sodným a octanem sodným, roztok kofeinu s močovinou a v poslední době povrchově aktivní látky, například neionogenní emulgátory přírodního nebo syntetického původu.

Vhodnou kombinací složek reakční směsi lze analytické postupy upravit tak, že je možné stanovit obsah celkového bilirubinu nebo jen obsah konjugovaného bilirubinu. V naprosté většině případů se stanovuje obsah celkového bilirubinu, zatímco stanovení obsahu konjugovaného bilirubinu je doplňkovým a specializovaným vyšetřením.

Pro azokopulačni stanovení bilirubinu byla dlouhou dobu užívána diazotovaná kyselina sulfanilová. Později byla popsána řada dalších látek na bázi substituovaných anilinů.

Z nich byly, na základě optimálního pH reakční směsi, reakční doby, citlivosti, reprodukovetelnosti a stabilitě výsledného reakčního produktu vybrány diazeniové soli, odvozené od anilinu.

Azokopulačni činidlo se přitom připravuje buň na místě smícháním anilinu nebo jeho derivátů s kyselinou chlorovodíkovou a dusitanem sodným, popřípadě s akcelerátorem. Směs se nechá stát v chladu při teplotě 2 až 8 °C asi 15 min a pak je lze použít k vlastní analýze. Lze ale postupovat i tak, .že se k roztoku akcelerátoru, například k roztoku kyseliny chlorovodíkové s methanolem nebo detergentem, přidá diazoniová sůl příslušného derivátu anilinu s kyselinou fluoroboritou nebo s chloridem zinečnatým, z níž se uvolňuje působením kyseliny aktivní látka: Tyto postupy mají své specifické nedostatky. Příprava reakční směsi na místě diazotací anilinu jé zdlouhavá, musí být prováděna za chladu a nezaručuje činidlo o standardních vlastnostech a stabilitě. Optimální není ani použití tak zvaných stabilních diazoniových solí. Jedná se o látky citlivé na světlo, teplotu a vlhkost a účinkem těchto vlivů se diazoniové soli spontánně rozkládají. Z těchto důvodů například nelze většinu diazoniových solí tabletovat, musí být skladovány za snížené teploty a za nepřístupu světla, jinak nelze zaručit jejich použitelnost. Protože vyšetření obsahu sérového bilirubinu je důležitým biochemickým ukazatelem, má přesnost a správnost těchto analýz mimořádnou důležitost, de proto žádoucí provádět fotometrické stanovení bilirubinu s činidlem, které by nemělo uvedené nedostatky.

Výše uvedená nedostatky Odstraňuje dvousložkové činidlo pro fotometr!cké stanoveni celkového bilirubinu podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tem, že činidlo sestává z pevná emási obsahující na mel triazenu popřípadě alkalické soli triazenu obecného vzorce

Cl

N=N~N

Cl v němž substituenty R, a R₂ značí nezávisle na sebž vodík, fenyl, alkyl s 1 až 4 atomy uhlíku, hydrexylalkyl s 1 až 4 atomy uhlíku, karhexyalkyl s 1 až 4 atomy uhlíku nebe SUlfealkyl s 1 až 4 atomy úhlíku, 0,01 až 1,2 mald alkalicky reagující látky, jak· například uhličitanů, fasfarečnanů nebe tetraberitanů alkalických kovů a popřípadě 0,01 až 50 molů neutrálních plnidel, jaké například chloridů, síranů nebe chleristenů alkalických kovů, laktesy nebe glukosy; a jejich smísí v poměru 1:10 až 10:1, a ze směsi, obsahující ne 1 mel anorganická nebe organická kyseliny, jaka například kyseliny chlorevodíková, sírová, fosforečná, chloristé, citrónová, emidosulfonová nebo fenylsulfonová nebo naftylsulfonová, 0,05 až 0,8 kg neionogenního tensidu, jako například ethoxylovaného oleylalkoholu, polyoxyethylenlauryletheru nebo p-isooktylfenoxypolyethoxyethanolu a popřípadě 2 až 2 500 molů vody.

Dvousložková činidlo podle vynálezu neobsahuje diazoniovou sůl nebo jednotlivé komponenty, nutné k jejímu vzniku, ale přísluěný výěe uvedený triazen, z něhož se azokopulace schopná diazóniová sůl generuje působením kysele reagující látky v okamžiku jejich smíchání v reakčním roztoku.

Výhodou činidla podle vynálesu je jeho prakticky neomezená stálost, nebol výěe uvedené triaseny tvoří pevné látky s většinou dobře definovaným bodem tání, které lze sušit nebo zahřívat nebo vystavit účinku světla, aniž by docházelo k jejich pozorovatelnému rozkladu a ke změnám jejich funkčních vlastností.

Výěe uvedené triazeny jsou zejména v pevném stavu mimořádně stálé, jejich vodné alkalické roztoky jaou stabilní několik dnů. Přítomnost neutrálních plnidel má za účel doplnit objám pevná směsi triazenu a alkalicky reagující látky na takový objem, který usnadňuje další technologické zpracování buň navalováním pevné směsi nebo jejím tabletováním. Proto může popřípadě pevná směs obsahovat ještě další látky, jako jsou klousadla a rosvolňpvadla tablet, pokud neruší při vlastním stanovení bilirubinu.

Složení druhá, kyselá reagující složky, je voleno tak, aby byl po přídavku pevná směsi s triazenea zaručen jeho okamžitý rozklad na příslušnou diazoniovou sůl, která je schopna kopulační reakce 8/ Óllirubinem. Neionogenní tensid v činidle podle vynálezu má své specifická funkce.' V případě krevního séra působí jako akcelerátor reakce volného bilirubinu, stabilizuje reakcí vytvořená azobarvivo v roztoku a zabraňuje tvorbě zákaiu v reakční směsi se sárem. Reakční směs, obsahující vodu a obě složky činidle podle vynálezu je pro dané analytická účely dostatečně stálá a lze ji bezpečně používat během 8 až 10 hodin po její přípravě.

činidlo podle vynálezu lze s výhodou připravit tak, že prvá alkalicky reagující, složka tvoří pevnou směs, druhá, kyselá, složka také pevnou směs nebo kapalný koncentrát či vodný zředěný roztok vhodný k přímému použití, což zaručuje dokonalou stabilitu činidla podle vynálezu jak při výrobě, tak i při expedici a vlastním ooužití, přičemž podle formy přípravy druhé, kyselé, složky, lze výhodně modifikovat pracovní postup při vlastním stanovení bilirubinu.

Lze například zředěním obou složek činidla vodou připravijt pracovní roztok činidla, k němuž se přidá vzorek s bilirubinem, což je vhodná pro sériově prováděné analýzy. Při jednotlivých analýzách lze s výhodou postupovat tak, že k vodnému roztoku kyselé složky činidla se přidá vzorek a reakce se startuje vhozením tablety s alkalickou složkou činidla.

Příprava činidla podle vynálezu je objasněna v následujících příkladech.

Příklad 1

Připraví se pevná směs triazenu, obsahující 90 g 1-methyl-1-k^rbexymethyl-3-(2,4-dichlorfenyl)triazenu, 6,6 g uhličitanu sodného, 26 g laktózy a 460 g chloridu sodného.

Ze směsi se připraví tablety o hmotnosti 0,35 g. Před použitím ee 1 tableta rozpustí v 10 ml vody.

Připraví se 8 000 sil koncentrovaného rozteku kyselé sležky, obsahujícího 2 400 g polyoxyethylenlauryletheru, 560 ml kyseliny chlorovodíkové 36 % a vodu. Před použitím se koncentrovaný roztek ředí v peměru 1:2 vodou.

Pracovní roztok pro stanovení bilirubinu se připraví smícháním roztoků triazenu a kyselé sležky v poměru 1:2.

Příklad 2

Připraví se pevná směs triazenu, obsahující 100 g 1-methyl-1-eulfoethyl-3-(2,4-dichlor fenyl)triazenu, 10 g tetraboritanu sodného a 500 g síranu sodného.

Připraví se vodný roztok kyselé sležky, obsahující 100 g kyseliny sírové a 50 g p-isooktylfenoxypolyethoxyethanolu v 10 1 vody.

Pracovní roztok pro stanovení bilirubinu se připraví tak, že se ve 100 ml rozteku kyselé složky rozpustí 1 g pevné směsi s triazenem.

Přiklad 3

Připraví se pevná směs triazenu, obsahující 50 g draselné seli 3-(2-karboxy-5-sulfefenyl)-1-(2,4-dichlerfenyl)triazenu a 350 g hydrogenfesforečnanu lithného. Ze směsi se připraví tablety o hmotnosti 0,050 g.

Připraví se kyselá složka ve formě pevné směsi, obsahující 200 g bezvedé kyseliny citrónové a 90 g ethoxylovaného oleylalkoholu. Před použitím se celé množství směsi rozpustí v 1 000 ml vody.

Reakční směs pro stanovení bilirubinu se připraví tak, že ke 3,0 ml rozteku kyselé sležky se přidá vzorek a 1 tableta směsi triazenu.

Přikládá

Připraví se pevné směs triazenu, obsahující 100 g 1-methyl-1-karbexymethyl-3-(2,4-dichlorfenyl)triazenu, 50 g hydrogenuhličitanu sodného, 25 g laktázy a 5 000 g chloridu sodného.

Ze směsi se připraví tablety o hmotnosti 0,050 g. Připřeví se 1 000 ml vodného roztoku kyselé složky, obsahujícího 0,15 melu kyseliny chleristé a 50 g pelyexyethylenlauryletheru.

Reakčnl směs pro stanovení bilirubinu obsahuje 2,0 ml roztoku kyselé složky a tabletu činidla s triazenem a vzarek.

Claims (1)

1. Dvousložkové činidlo pro fotometrické stanovení bilirubinu, vyznačené tím, že sestává z pevné smési, obsahující na 1 mol triazenu, popřípadě alkalické soli triazenu, obecného vzorce

   Cl v němž substituenty Rj a Rg značí nezávisle ne sobé vodík, fenyl, alkyl s 1 až 4 atomy uhlíku, hydroxyalkyl s 1 až 4 atomy uhlíku, karboxyalkyl s 1 až 4 atomy uhlíku nebo sulfoelkyl s 1 až 4 atomy uhlíku, 0,01 až 1,2 molů alkalicky reagující látky jako například uhličitanů, fosforečnanů nebo tetraboritanů alkalických kovů a popřípadě 0,01 až 50 molů neutrálních plnidel jako například chloridů, síranů nebo chloristanů alkalických kovů, laktózy nebo glukózy a jejich smési v poměru 1:10 až 10:1, a ze směsi obsahující na 1 mol anorganické'nebo organické kyseliny jako například kyseliny chlorovodíkové, sírové, fosforečné, chloristé, citrónové, amidosulfonové nebo fenylsulfonové nebo naftyleulfonové 0,05 až 0,8 kg neionogennl tensidu jako například ethoxylovaného oleylaikoholu, polyoxyethylenlaurylether nebo p-isooktylfenoxypolyethoxyethenolu a popřípadě 2 až 2 500 molů vody.