Vynález se týká imobilizované amyloglukosidázy na nosiči na bázi perlové celulózy a způsobu její přípravy.

Současný stav imobilizace amyloglukosidázy charakterizuje následující přehled. V převážné většině prací se imobilizace provádí chemickou vazbou nebo zapolymerováním. Amyloglukosidáza byla imobilizována sorpcí na nosičích na bázi syntetických ionexů, derivátů celulózy i dextranových gelů (M. Moulond, J. Boundrant, J. C. Cheftel: Fr. Demande 2,372.653 (1978)). Amberlitu IRA. 93» což je makroporézní styren-divinylbenzenový kopolymer s diethylaminomethylovými skupinami, bylo použito k imobilizaci ve statických podmínkách při suspendování ionexu v roztoku enzymu při pH 5,2 a 4°C po dobu 5 hodin a bylo dosaženo aktivity imobilizovaného enzymu 60,4 j/g.

Při hydrolýxe 25%-ního roztoku maltodextranů (DE 4-5) v průtočném reaktoru s dobou zdržení 50 minut bylo při pH 4 a 4o°C dosahováno 70$-ní konverse (DE značí glukózový ekvivalent vyjádřený jako procentuální obsah glukózy ve škrobu, oligosacharidu neb produktech jejich hydrolýzy).

Na polyfunkčním slabě basickém anexu (Amberlit IR 45) sorboval amyloglukosidázu Y. K. Park (j. Ferment. Technol. 52,140 (1974)) o aktivitě 1000 j/g pro 4%-ní škrob v 0,1 mol/l acetátovém pufru pH 4 při teplotě 60°C. Na kopolymerů 2,2-dimethylaminoethylmethakrylátu bylo imobilizováno 12,6 mg amyloglukosidázy/g kopolymerů (v. S. Nithianandam, M. Santappaí Biotechnol. Bioeng 23,2273 (ΐ9θΐ))

Lepších výsledků bylo dosaženo sorpcí amyloglukosidázy na derivátech celulózy. Tak například Brouillard (US. pat. 4 029,546 (1977)) regeneroval celulózu do velkých částic-cucků, do kterých zavedl 2-diethylamionoethylové skupiny v koncentraci 0,97 mmol/g.

238 544

Na tomto materiálu sorboval enzym v aktivitě 24,3 IGU/g. V koloně při průtoku 30%-ního maltodextrinu o DE 35 rychlostí 4 ml/min při teplotě 58,9°C a pH 4,2 bylo dosaženo DE produktu 60.

Smiley (Biotechnol. Bioeng 13,399 (l97l)) sorboval amyloglukosidázu na fibrilární celulóze s 2-diethylaminoethylovými skupinami v množství 4,3 j/g. 10 g imobilizovaného enzymu hydrolyzoval 30%-ni roztok zkapalněného škrobu v průtočném míchaném reaktoru o objemu 4 1 při teplotě 55°C a rychlosti průtoku 36^70 ml/hodinu. Měl potíže s mechanickou stabilitou nosiče, konverse na glukosu byla 84 92%.

Předmětem předloženého vynálezu je imobilizovaná amyloglukosidáza, vyznačená tím, že je vázána v množství odpovídajícím aktivitě až 1300 jednotek/g na nosiči na bázi regenerované perlové celulózy obsahující diethylaminové skupiny v koncentraci 0,1 cz Q,2 mmol/g t

celulózy.

Diethylaminové skupiny jsou zaváděny do celulózy regenerované do tvaru perel suspenznim způsobem reakcí (3-chlor-2-hydroxypropyl) -diethylaminhydrochloridu, resp. (2-chlorethyl)-diethylaminchloridu, resp. směsi diethylaminu s l-chlor-2,3-epoxypropanu v 1 - 10 mol/l NaOH, při teplotě 0 oí 70°C po dobu 0,5 ai 48 hodiny podle čs. a. o. 199 420 (Hradil, Musil, Mlejnek).

Způsob přípravy imobilizované amyloglukosidázy spočívá v tom, že imobilizace se provádí nosičem na bázi regenerované perlové celu lozy obsahující diethylaminové skupiny v OH formě suspendovaným v roztoku enzymu ve vodě za přítomnosti 0,5 až 2% hmot. maltózy nebo škrobu o pH 4,0 až 4,7 při teplotě 0 až 50°C nebo nosičem umístěným v koloně průtokem roztoku enzymu za stejných podmínek.

Před imobilizací je vhodné přivést skupiny nosiče promytím roz tokem hydroxidu alkalického kovu do formy volné báse.

Stabilitu imobilizovaného enzymu pile vynálezu lze zvýšit tím způsobem, že po sorpci enzymu na nosiči na bázi regenerované perlové celulózy obsahující diethylaminová skupiny se provede zesítění reakcí s glutaraldehydem při 25°C po dobu 2 hodin a při pH 6,8.

Tento nosič sorbuje az 407 j/g (jednotka aktivity reprezentuje

- 3 238 544 aktivitu enzymu, který z 1%-ního roztoku škrobu uvolní za 1 minutu při pH 4,7 a teplotě 30°C 1 /Umol glukózy (0,18 mg) vztažených na 1 g suchého nosiče) a 370 mg bílkoviny/g.

Hydrolýzu roztoku škrobu nebo oligosacharidů (l 35 hmot. %

DE 12 - 35) lze výše popsaným zmobilizovaným enzymem provádět při teplotě 40 (jŽ 60°C při pH 3 už 7 jak v míchaném vsádkovém reaktoru, tak i průtočném míchaném nebo kolonovém reaktoru. Životnost zmobilizovaného enzymu dostatečně charakterizuje skutečnost, že zdánlivá aktivita (v 30%-ním roztoku škrobu) poklesla pouze během prvních 200 hodin (z 1240 na 500 j/g), ale po 400 hodinách se ustálila na 300 j/g.

S výhodou lze provést imobilizaci v průtočném dynamickém uspořádání nosičem umístěným v koloně, přes který je čerpán, případně opakovaně, roztok enzymu. Oproti sorpci ve statických podmínkách se sorbentem míchaným v roztoku enzymu poskytuje výše popsaný způsob za srovnatelných podmínek zmobilizovaný enzym s vyšší měrnou aktivitou o 29%.

Další předností vynálezu je, že nosič je plně regenerovatelný 0,1 až 1 mol/l roztokem chloridu sodného a/nebo 0,1 až 0,5 mol/l roztokem kyseliny chlorovodíkové a/nebo 0,1 až 0,5 mol/l roztokem hydroxidu sodného. Perlová celulóza s diethylamžnovými skupinymi má také afinitu k nečistotám obsaženým roztocích oligosacharidů. Sorpcí těchto nečistot se však nesnižuje enzymatickcí aktivita zmobilizovaného enzymu a nebrání regeneraci ve smyslu výše uvedeného.

Základním předpokladem pro toto universální použití zmobilizovaného enzymu je dostatečná pevnost a nestlacitelnost nosiče.

Zrna nosiče jsou dostatečně odolná i na otěr, při práci v míchaném reaktoru po dobu 473 hodin se rozpadlo méně než 7% částic.

Vyšší účinek vynálezu ve srovnání se současným technickým stavem spočívá především v řádově vyšší aktivitě zmobilizované amyloglukosidázy, úspoře nativního enzymu při imobilizaci, delší životnosti zmobilizovaného enzymu a snadné regenerovatelnosti nosiče.

Předmět vynálezu charakterizují následující příklady, kterými se předmět vynálezu nikterak neomezuje.

Příklad 1 238 544 dílů vlhké odsáté celulózy, regenerované suspenzním způsobem do tvaru perel, bylo promyto roztokem 5)3 dílů hydroxidu sodného (NaOH) v 5,3 dílech deionisované vody předložena do reaktoru a po částech přidáno v pěti dávkách 12,2 dílů l-chlor-2?3-epoxypropylu a 9,7 dílů diethylaminu při teplotě 63 až 80°C mícháno 3 hodiny. Pak promyto ethanolem (50 díly) a deionisovanou vodou (250 díly). Bylo získáno 30 dílů perlové celulózy s 3'diethylamino-2-hydroxypropylovými (DEAHP) skupinami v koncentraci 1,2 mmol/g a zádrži vody 5,12 g HgO/g (podle čs. a. o. 199 420). 100 dílů odsáté perlové celulózy s 3-diethylamino-2-hydroxypropylovými (DEAHP) skupinami převedené 150 díly 0,5 mol/l hydroxidu sodného (NaOH) do OH formy, promyté 1000 díly dest. vody umístěné v koloně bylo prokapáno 2000 díly roztoku enzymu připraveného suspendováním ÓO g stabilizované amyloglukosidázy ve 100 dílech destilované vody doplněné po odfiltrování a přidání 6,8 dílů maltózy 0,01 mol/l acetátovým pufrem pH 4,2 během 4 hodin.

100 dílů zmobilizovaného enzymu bylo umístěno v koloně s pláštěm temperovaným na 55°C. Kolonou byl čerpán roztok zkapalněného škrobu (sušina 29)7^· hmot. %, DE 20,2) rychlostí 0,45 g/minutu. Obsah glukózy v efluentu byl 26, 66 g/100 g což odpovídá konver-zi 88,7$·

Příklad 2 dílů vlhké perlové celulózy bylo suspendováno v roztoku 5,3 dílů NaOH v 5,3 dílech deionisované vody a pak přidáno 22 dílů (3.-chlor-2-hydroxypropyl)diethylaminhydrochloridu. Teplota postupně zvýšená z 10°C na 80°C, na které udržováno za míchání po dobu 3 hodin. Po promytx ethylalkoholem (50 díly) a deionisovanou vodou (lOO díly) obsahovala připravená perlová celuJftza s 3-dietb.ylamino-2-h.ydroxypropylovými (DEAHP) skupinami 1,07 mmol diethylaminových skupin/g. 10 díly perlové celulózy s 3-dieth.ylamino-2-hydroxypropylovými (DEAHP) skupinami promyté 50 díly 0,5 mol/l roztoku hydroxydu sodného (NaOH) a 100 díly destilované vody bylo prolito 2200 dílů roztoku 2,2 dílů stabilizované amyloglukosidázy v acetátovém pu238 544

- 5 fru 0,01 mol/l a pH 4,2. Aktivita imobilizovaného enzymu za standardních podmínek byla 3Ó2 j/g.

Toto množství zmobilizovaného enzymu bylo suspendováno v reaktoru temperovaném na 55°C v 1240 dílech zkapalněného roztoku škrobu (29,7$ sušiny, DE 20,2). Po 34,4 hodinách zahřívání a míchání bylo dosaženo 81,5%-nz konverze na glukózu, obsah glukózy v roztoku byl 24,45 g/lOOg roztoku. Zdánlivá aktivita zmobilizované amyloglukosidázy byla za těchto podmínek 470j/g.

Příklad 3 dílů imobilizováné amyloglukosidázy podle příkladu 1 o zrnitosti 0,3 1 mm bylo suspendováno v průtočném míchaném reaktoru temperovaném na 55°C v 1240 dílech zkapalněného škrobu (29,74% sušiny, DE 20,2). Produkt z reaktoru byl odtahován měnitelnou rychlostí 0,3 αί. 3,2 dzlů/minutu, převážně však 1 díl/minutu, přičemž bylo doplňováno automaticky stejné množství čerstvého substrátu. V tomto uspořádání pracoval reaktor s imobilizováným enzymem po dobu

473,5 hodin. Konečná zdánlivá aktivita imobilizovaného enzymu za těchto podmínek byla 310 j/g. Na tuto hodnotu poklesla aktivita z výchozí hodnoty 1240 j/g.

Imobilizovaný enzym po tomto použiti ztmavnul, zachoval si však pravidelný kulový tvar (7% částic se rozpůlilo). Promytím 50 díly 0,5 mol/l kyseliny solné (HCl) 100 díly destilované vody, 50 díly 0,5 mol/l hydroxydu sodného (NaOH) a 100 díly destilované vody byl připraven k opakované imobilizaci enzymu, která za podmínek pokusu 1 byla uskutečněna v množství 316 j/g.

Přzkad 4 dzl perlove celulózy s 3-džethylamino—2—hydroxypropylovými (DEAHP) skupinami pile příkladu 1 převedeného do 0H~ formy bylo suspendováno v roztoku 0,1 dílu amyloglukosidázy ve 100 dílech 0,02 mol/l acetátového pufru pH 4,2. Enzym sorbován za občasného promíchání po dobu 47 hodin při 4°C. Aktivita takto imobilizovaného enzymu po promytz 200 díly destilované vody byla l48 j/g.