CS238544B1 - Imobilizovaná amyloglukosidáza a způsob její přípravy - Google Patents

Imobilizovaná amyloglukosidáza a způsob její přípravy Download PDF

Info

Publication number
CS238544B1
CS238544B1 CS842074A CS207484A CS238544B1 CS 238544 B1 CS238544 B1 CS 238544B1 CS 842074 A CS842074 A CS 842074A CS 207484 A CS207484 A CS 207484A CS 238544 B1 CS238544 B1 CS 238544B1
Authority
CS
Czechoslovakia
Prior art keywords
immobilized
cellulose
enzyme
parts
regenerated
Prior art date
Application number
CS842074A
Other languages
English (en)
Other versions
CS207484A1 (en
Inventor
Jiri Hradil
Frantisek Svec
Dagmar Mrazova
Original Assignee
Jiri Hradil
Frantisek Svec
Dagmar Mrazova
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiri Hradil, Frantisek Svec, Dagmar Mrazova filed Critical Jiri Hradil
Priority to CS842074A priority Critical patent/CS238544B1/cs
Publication of CS207484A1 publication Critical patent/CS207484A1/cs
Publication of CS238544B1 publication Critical patent/CS238544B1/cs

Links

Landscapes

  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)

Abstract

Imobilizovaná amyloglukosidáza na nosiči na bázi perlové celulózy a způsob její přípravy. Podstatou je imobilizovaná amyno^lukosidáza vázaná v množství odpovídajícím aktivitě až 1 300 jednotek/g na nosiči na bázi regenerované perlové celulózy obsahující diethylaminové skupiny v koncentraci 0,1 až 0,2 mmol/g celulózy. Způsob přípravy imobilizované amynoglukosidázy podle vynálezu se provádí nosičem na bázi regenerované perlové celulózy obsahující diethylaminové skupiny v 0H”formě suspendovaným v roztoku enzymu ve vodě za přítomnosti 0,5 až 2 % hmot. maltózy nebo škrobu o pH 4,0 až 4,7 při teplote O až 50 °C nebo nosičem umístěným v koloně průtokem roztoku enzymu za stejných podmínek. Vyšší účinek ve srovnání se současným^technickým stavem spočívá především v řádově vyšší aktivitě imobilizované amyloglukosidázy, úspoře nativního enzymu při imobilizaci, delší životnosti imobilizovaného enzymu a snadné regenerovatelnosti nosiče.

Description

Vynález se týká imobilizované amyloglukosidázy na nosiči na bázi perlové celulózy a způsobu její přípravy.
Současný stav imobilizace amyloglukosidázy charakterizuje následující přehled. V převážné většině prací se imobilizace provádí chemickou vazbou nebo zapolymerováním. Amyloglukosidáza byla imobilizována sorpcí na nosičích na bázi syntetických ionexů, derivátů celulózy i dextranových gelů (M. Moulond, J. Boundrant, J. C. Cheftel: Fr. Demande 2,372.653 (1978)). Amberlitu IRA. 93» což je makroporézní styren-divinylbenzenový kopolymer s diethylaminomethylovými skupinami, bylo použito k imobilizaci ve statických podmínkách při suspendování ionexu v roztoku enzymu při pH 5,2 a 4°C po dobu 5 hodin a bylo dosaženo aktivity imobilizovaného enzymu 60,4 j/g.
Při hydrolýxe 25%-ního roztoku maltodextranů (DE 4-5) v průtočném reaktoru s dobou zdržení 50 minut bylo při pH 4 a 4o°C dosahováno 70$-ní konverse (DE značí glukózový ekvivalent vyjádřený jako procentuální obsah glukózy ve škrobu, oligosacharidu neb produktech jejich hydrolýzy).
Na polyfunkčním slabě basickém anexu (Amberlit IR 45) sorboval amyloglukosidázu Y. K. Park (j. Ferment. Technol. 52,140 (1974)) o aktivitě 1000 j/g pro 4%-ní škrob v 0,1 mol/l acetátovém pufru pH 4 při teplotě 60°C. Na kopolymerů 2,2-dimethylaminoethylmethakrylátu bylo imobilizováno 12,6 mg amyloglukosidázy/g kopolymerů (v. S. Nithianandam, M. Santappaí Biotechnol. Bioeng 23,2273 (ΐ9θΐ))
Lepších výsledků bylo dosaženo sorpcí amyloglukosidázy na derivátech celulózy. Tak například Brouillard (US. pat. 4 029,546 (1977)) regeneroval celulózu do velkých částic-cucků, do kterých zavedl 2-diethylamionoethylové skupiny v koncentraci 0,97 mmol/g.
238 544
Na tomto materiálu sorboval enzym v aktivitě 24,3 IGU/g. V koloně při průtoku 30%-ního maltodextrinu o DE 35 rychlostí 4 ml/min při teplotě 58,9°C a pH 4,2 bylo dosaženo DE produktu 60.
Smiley (Biotechnol. Bioeng 13,399 (l97l)) sorboval amyloglukosidázu na fibrilární celulóze s 2-diethylaminoethylovými skupinami v množství 4,3 j/g. 10 g imobilizovaného enzymu hydrolyzoval 30%-ni roztok zkapalněného škrobu v průtočném míchaném reaktoru o objemu 4 1 při teplotě 55°C a rychlosti průtoku 36^70 ml/hodinu. Měl potíže s mechanickou stabilitou nosiče, konverse na glukosu byla 84 92%.
Předmětem předloženého vynálezu je imobilizovaná amyloglukosidáza, vyznačená tím, že je vázána v množství odpovídajícím aktivitě až 1300 jednotek/g na nosiči na bázi regenerované perlové celulózy obsahující diethylaminové skupiny v koncentraci 0,1 cz Q,2 mmol/g t
celulózy.
Diethylaminové skupiny jsou zaváděny do celulózy regenerované do tvaru perel suspenznim způsobem reakcí (3-chlor-2-hydroxypropyl) -diethylaminhydrochloridu, resp. (2-chlorethyl)-diethylaminchloridu, resp. směsi diethylaminu s l-chlor-2,3-epoxypropanu v 1 - 10 mol/l NaOH, při teplotě 0 oí 70°C po dobu 0,5 ai 48 hodiny podle čs. a. o. 199 420 (Hradil, Musil, Mlejnek).
Způsob přípravy imobilizované amyloglukosidázy spočívá v tom, že imobilizace se provádí nosičem na bázi regenerované perlové celu lozy obsahující diethylaminové skupiny v OH formě suspendovaným v roztoku enzymu ve vodě za přítomnosti 0,5 až 2% hmot. maltózy nebo škrobu o pH 4,0 až 4,7 při teplotě 0 až 50°C nebo nosičem umístěným v koloně průtokem roztoku enzymu za stejných podmínek.
Před imobilizací je vhodné přivést skupiny nosiče promytím roz tokem hydroxidu alkalického kovu do formy volné báse.
Stabilitu imobilizovaného enzymu pile vynálezu lze zvýšit tím způsobem, že po sorpci enzymu na nosiči na bázi regenerované perlové celulózy obsahující diethylaminová skupiny se provede zesítění reakcí s glutaraldehydem při 25°C po dobu 2 hodin a při pH 6,8.
Tento nosič sorbuje az 407 j/g (jednotka aktivity reprezentuje
- 3 238 544 aktivitu enzymu, který z 1%-ního roztoku škrobu uvolní za 1 minutu při pH 4,7 a teplotě 30°C 1 /Umol glukózy (0,18 mg) vztažených na 1 g suchého nosiče) a 370 mg bílkoviny/g.
Hydrolýzu roztoku škrobu nebo oligosacharidů (l 35 hmot. %
DE 12 - 35) lze výše popsaným zmobilizovaným enzymem provádět při teplotě 40 (jŽ 60°C při pH 3 už 7 jak v míchaném vsádkovém reaktoru, tak i průtočném míchaném nebo kolonovém reaktoru. Životnost zmobilizovaného enzymu dostatečně charakterizuje skutečnost, že zdánlivá aktivita (v 30%-ním roztoku škrobu) poklesla pouze během prvních 200 hodin (z 1240 na 500 j/g), ale po 400 hodinách se ustálila na 300 j/g.
S výhodou lze provést imobilizaci v průtočném dynamickém uspořádání nosičem umístěným v koloně, přes který je čerpán, případně opakovaně, roztok enzymu. Oproti sorpci ve statických podmínkách se sorbentem míchaným v roztoku enzymu poskytuje výše popsaný způsob za srovnatelných podmínek zmobilizovaný enzym s vyšší měrnou aktivitou o 29%.
Další předností vynálezu je, že nosič je plně regenerovatelný 0,1 až 1 mol/l roztokem chloridu sodného a/nebo 0,1 až 0,5 mol/l roztokem kyseliny chlorovodíkové a/nebo 0,1 až 0,5 mol/l roztokem hydroxidu sodného. Perlová celulóza s diethylamžnovými skupinymi má také afinitu k nečistotám obsaženým roztocích oligosacharidů. Sorpcí těchto nečistot se však nesnižuje enzymatickcí aktivita zmobilizovaného enzymu a nebrání regeneraci ve smyslu výše uvedeného.
Základním předpokladem pro toto universální použití zmobilizovaného enzymu je dostatečná pevnost a nestlacitelnost nosiče.
Zrna nosiče jsou dostatečně odolná i na otěr, při práci v míchaném reaktoru po dobu 473 hodin se rozpadlo méně než 7% částic.
Vyšší účinek vynálezu ve srovnání se současným technickým stavem spočívá především v řádově vyšší aktivitě zmobilizované amyloglukosidázy, úspoře nativního enzymu při imobilizaci, delší životnosti zmobilizovaného enzymu a snadné regenerovatelnosti nosiče.
Předmět vynálezu charakterizují následující příklady, kterými se předmět vynálezu nikterak neomezuje.
Příklad 1 238 544 dílů vlhké odsáté celulózy, regenerované suspenzním způsobem do tvaru perel, bylo promyto roztokem 5)3 dílů hydroxidu sodného (NaOH) v 5,3 dílech deionisované vody předložena do reaktoru a po částech přidáno v pěti dávkách 12,2 dílů l-chlor-2?3-epoxypropylu a 9,7 dílů diethylaminu při teplotě 63 až 80°C mícháno 3 hodiny. Pak promyto ethanolem (50 díly) a deionisovanou vodou (250 díly). Bylo získáno 30 dílů perlové celulózy s 3'diethylamino-2-hydroxypropylovými (DEAHP) skupinami v koncentraci 1,2 mmol/g a zádrži vody 5,12 g HgO/g (podle čs. a. o. 199 420). 100 dílů odsáté perlové celulózy s 3-diethylamino-2-hydroxypropylovými (DEAHP) skupinami převedené 150 díly 0,5 mol/l hydroxidu sodného (NaOH) do OH formy, promyté 1000 díly dest. vody umístěné v koloně bylo prokapáno 2000 díly roztoku enzymu připraveného suspendováním ÓO g stabilizované amyloglukosidázy ve 100 dílech destilované vody doplněné po odfiltrování a přidání 6,8 dílů maltózy 0,01 mol/l acetátovým pufrem pH 4,2 během 4 hodin.
100 dílů zmobilizovaného enzymu bylo umístěno v koloně s pláštěm temperovaným na 55°C. Kolonou byl čerpán roztok zkapalněného škrobu (sušina 29)7^· hmot. %, DE 20,2) rychlostí 0,45 g/minutu. Obsah glukózy v efluentu byl 26, 66 g/100 g což odpovídá konver-zi 88,7$·
Příklad 2 dílů vlhké perlové celulózy bylo suspendováno v roztoku 5,3 dílů NaOH v 5,3 dílech deionisované vody a pak přidáno 22 dílů (3.-chlor-2-hydroxypropyl)diethylaminhydrochloridu. Teplota postupně zvýšená z 10°C na 80°C, na které udržováno za míchání po dobu 3 hodin. Po promytx ethylalkoholem (50 díly) a deionisovanou vodou (lOO díly) obsahovala připravená perlová celuJftza s 3-dietb.ylamino-2-h.ydroxypropylovými (DEAHP) skupinami 1,07 mmol diethylaminových skupin/g. 10 díly perlové celulózy s 3-dieth.ylamino-2-hydroxypropylovými (DEAHP) skupinami promyté 50 díly 0,5 mol/l roztoku hydroxydu sodného (NaOH) a 100 díly destilované vody bylo prolito 2200 dílů roztoku 2,2 dílů stabilizované amyloglukosidázy v acetátovém pu238 544
- 5 fru 0,01 mol/l a pH 4,2. Aktivita imobilizovaného enzymu za standardních podmínek byla 3Ó2 j/g.
Toto množství zmobilizovaného enzymu bylo suspendováno v reaktoru temperovaném na 55°C v 1240 dílech zkapalněného roztoku škrobu (29,7$ sušiny, DE 20,2). Po 34,4 hodinách zahřívání a míchání bylo dosaženo 81,5%-nz konverze na glukózu, obsah glukózy v roztoku byl 24,45 g/lOOg roztoku. Zdánlivá aktivita zmobilizované amyloglukosidázy byla za těchto podmínek 470j/g.
Příklad 3 dílů imobilizováné amyloglukosidázy podle příkladu 1 o zrnitosti 0,3 1 mm bylo suspendováno v průtočném míchaném reaktoru temperovaném na 55°C v 1240 dílech zkapalněného škrobu (29,74% sušiny, DE 20,2). Produkt z reaktoru byl odtahován měnitelnou rychlostí 0,3 αί. 3,2 dzlů/minutu, převážně však 1 díl/minutu, přičemž bylo doplňováno automaticky stejné množství čerstvého substrátu. V tomto uspořádání pracoval reaktor s imobilizováným enzymem po dobu
473,5 hodin. Konečná zdánlivá aktivita imobilizovaného enzymu za těchto podmínek byla 310 j/g. Na tuto hodnotu poklesla aktivita z výchozí hodnoty 1240 j/g.
Imobilizovaný enzym po tomto použiti ztmavnul, zachoval si však pravidelný kulový tvar (7% částic se rozpůlilo). Promytím 50 díly 0,5 mol/l kyseliny solné (HCl) 100 díly destilované vody, 50 díly 0,5 mol/l hydroxydu sodného (NaOH) a 100 díly destilované vody byl připraven k opakované imobilizaci enzymu, která za podmínek pokusu 1 byla uskutečněna v množství 316 j/g.
Přzkad 4 dzl perlove celulózy s 3-džethylamino—2—hydroxypropylovými (DEAHP) skupinami pile příkladu 1 převedeného do 0H~ formy bylo suspendováno v roztoku 0,1 dílu amyloglukosidázy ve 100 dílech 0,02 mol/l acetátového pufru pH 4,2. Enzym sorbován za občasného promíchání po dobu 47 hodin při 4°C. Aktivita takto imobilizovaného enzymu po promytz 200 díly destilované vody byla l48 j/g.

Claims (3)

  1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU
    1. Imobilizovaná amyloglukosidáza, vyznačená tím, že je vázána v množství odpovídajícím aktivitě až 1300 jednotek/g na nosiči na bázi regenerované perlové celulózy obsahující diethylamiv / nové skupiny v koncentraci 0,142 2,0 mmol/g celulózy.
  2. 2. Způsob přípravy imobilizované amyloglůkosidázy podle bodu 1, vyznačený tím, že imobilizace se provádí nosičem na bázi regenerované perlové celulózy obsahující diethylaminové skupiny v OH formě suspendovaným v roztoku enzymu ve vodě za přítomnosti 0,5 až 2% hmot. maltózy nebo škrobu o pH 4,0 až 4,7 při teplotě 0 až 50°C nebo nosičem umístěným v koloně průtokem roztoku za stejných podmínek.
  3. 3· Způsob přípravy imobilizované amyjoglukosidázy podle bodu 2, vyznačená tím, že po sorpci enzymu na nosiči na bázi regenerovat né perlové celulózy obsahující diethylaminové skupiny se provede zesítění reakcí s glutaraldehydem při 25°C po dobu 2 hodin a při pH 6,8.
CS842074A 1984-03-23 1984-03-23 Imobilizovaná amyloglukosidáza a způsob její přípravy CS238544B1 (cs)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CS842074A CS238544B1 (cs) 1984-03-23 1984-03-23 Imobilizovaná amyloglukosidáza a způsob její přípravy

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CS842074A CS238544B1 (cs) 1984-03-23 1984-03-23 Imobilizovaná amyloglukosidáza a způsob její přípravy

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CS207484A1 CS207484A1 (en) 1985-04-16
CS238544B1 true CS238544B1 (cs) 1985-11-13

Family

ID=5356765

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS842074A CS238544B1 (cs) 1984-03-23 1984-03-23 Imobilizovaná amyloglukosidáza a způsob její přípravy

Country Status (1)

Country Link
CS (1) CS238544B1 (cs)

Also Published As

Publication number Publication date
CS207484A1 (en) 1985-04-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI85384C (fi) Foerfarande foer hydrolysering av hemicellulosa med immobiliserade enzymer och produkt som omfattar ett immobiliserat hemicellulolytiskt enzym.
EP0641859B1 (en) Method for preparing immobilized enzyme conjugates and immobilized enzyme conjugates prepared thereby
Chibata et al. Immobilized tannin—a novel adsorbent for protein and metal ion
JPH0626667B2 (ja) サイクロデキストリン吸着材及びその用途
Fonseca et al. Immobilization studies of an industrial penicillin acylase preparation on a silica carrier
JPH0338B2 (cs)
JPS638749B2 (cs)
US4355117A (en) Process for preparing agglomerated fibrous cellulose
Sakai et al. Immobilization of chitinolytic enzymes and continuous production of N-acetylglucosamine with the immobilized enzymes
EP0915986A1 (en) Process and carrier for the production of isomaltulose by immobilized micro-organisms
JPS6219835B2 (cs)
Solomon et al. Adsorption of amyloglucosidase on inorganic carriers
CS238544B1 (cs) Imobilizovaná amyloglukosidáza a způsob její přípravy
US4933284A (en) Regenerable dialkylaminoalkyl cellulose support matrix for immobilizing biologically active materials
US5177005A (en) Method for maintaining immobilized glucose isomerase activity during continuous isomerization of glucose to fructose
CN100398646C (zh) 一种新型亲和载体的制备方法
Watanabe et al. Preparation of immobilized tannins for protein adsorption
Hradil et al. Inversion of sucrose with β-d-fructofuranosidase (invertase) immobilized on bead DEAHP-cellulose: Batch process
JP2000513570A (ja) 固定化された微生物によるイソマルツロースの製造方法およびそのための担体
CA1281675C (en) Product and process for increasing enzyme adsorption
NO144633B (no) Fremgangsmaate for fremstilling av 6-aminopenicillansyre
US5001063A (en) Treatment of cellulosic ion exchange composites in hot aqueous medium to increase adsorption of macromolecules
GB2085449A (en) Process for preparing agglomerated fibrous cellulose ion exchange composites
Kučera Preparation of cellulose derivatives for affinity chromatography and immobilization of enzymes. Activation by epichlorohydrin
Tramper Oxidation of azaheterocycles by free and immobilized xanthine oxidase and xanthine dehydrogenase