CS234059B1 - Způsob imobilizace mikrobiálních buněk, rostlinných buněk a enzymů - Google Patents
Způsob imobilizace mikrobiálních buněk, rostlinných buněk a enzymů Download PDFInfo
- Publication number
- CS234059B1 CS234059B1 CS957382A CS957382A CS234059B1 CS 234059 B1 CS234059 B1 CS 234059B1 CS 957382 A CS957382 A CS 957382A CS 957382 A CS957382 A CS 957382A CS 234059 B1 CS234059 B1 CS 234059B1
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- particles
- cells
- water
- poly
- solution
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 53
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 title claims description 17
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 83
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 53
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 52
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 38
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 28
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 23
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 23
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 22
- -1 polyethylene terephthalate Polymers 0.000 claims description 17
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 13
- NAQMVNRVTILPCV-UHFFFAOYSA-N hexane-1,6-diamine Chemical compound NCCCCCCN NAQMVNRVTILPCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- JBKVHLHDHHXQEQ-UHFFFAOYSA-N epsilon-caprolactam Chemical compound O=C1CCCCCN1 JBKVHLHDHHXQEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 10
- 229920000139 polyethylene terephthalate Polymers 0.000 claims description 10
- 239000005020 polyethylene terephthalate Substances 0.000 claims description 10
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 claims description 10
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 claims description 10
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 9
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 9
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 claims description 9
- 229920000620 organic polymer Polymers 0.000 claims description 9
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 claims description 8
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 claims description 8
- USIUVYZYUHIAEV-UHFFFAOYSA-N diphenyl ether Chemical compound C=1C=CC=CC=1OC1=CC=CC=C1 USIUVYZYUHIAEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 125000000467 secondary amino group Chemical group [H]N([*:1])[*:2] 0.000 claims description 8
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 claims description 7
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 claims description 7
- 229920001400 block copolymer Polymers 0.000 claims description 7
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 7
- 229920000877 Melamine resin Polymers 0.000 claims description 6
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 claims description 6
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 claims description 6
- 229920000592 inorganic polymer Polymers 0.000 claims description 6
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 5
- JDSHMPZPIAZGSV-UHFFFAOYSA-N melamine Chemical compound NC1=NC(N)=NC(N)=N1 JDSHMPZPIAZGSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229920013730 reactive polymer Polymers 0.000 claims description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 4
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 4
- XTXRWKRVRITETP-UHFFFAOYSA-N Vinyl acetate Chemical compound CC(=O)OC=C XTXRWKRVRITETP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 claims description 3
- 150000001991 dicarboxylic acids Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000000376 reactant Substances 0.000 claims description 3
- 229920003169 water-soluble polymer Polymers 0.000 claims description 3
- 241000186361 Actinobacteria <class> Species 0.000 claims description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 2
- 229920003176 water-insoluble polymer Polymers 0.000 claims description 2
- BZHJMEDXRYGGRV-UHFFFAOYSA-N Vinyl chloride Chemical compound ClC=C BZHJMEDXRYGGRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 235000013877 carbamide Nutrition 0.000 claims 2
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 claims 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 claims 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 claims 1
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 claims 1
- 150000003672 ureas Chemical class 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 64
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 45
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 44
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 37
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- 238000011473 radical retropubic prostatectomy Methods 0.000 description 22
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 21
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 21
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 18
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 description 18
- 235000011073 invertase Nutrition 0.000 description 18
- 239000001573 invertase Substances 0.000 description 17
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 13
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 10
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 10
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 9
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 9
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 7
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Natural products N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 7
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 7
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 7
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 7
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 108010073178 Glucan 1,4-alpha-Glucosidase Proteins 0.000 description 5
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 5
- 238000007444 cell Immobilization Methods 0.000 description 5
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 4
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 4
- STNJBCKSHOAVAJ-UHFFFAOYSA-N Methacrolein Chemical compound CC(=C)C=O STNJBCKSHOAVAJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 description 4
- 235000019371 penicillin G benzathine Nutrition 0.000 description 4
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 description 4
- 239000004753 textile Substances 0.000 description 4
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- XPZDAUKGRAXPIF-UHFFFAOYSA-N azepan-2-one;oxirane Chemical compound C1CO1.O=C1CCCCCN1 XPZDAUKGRAXPIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 3
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 3
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 3
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 3
- OILXMJHPFNGGTO-UHFFFAOYSA-N (22E)-(24xi)-24-methylcholesta-5,22-dien-3beta-ol Natural products C1C=C2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(C)C=CC(C)C(C)C)C1(C)CC2 OILXMJHPFNGGTO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 1,2-Divinylbenzene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OQMZNAMGEHIHNN-UHFFFAOYSA-N 7-Dehydrostigmasterol Natural products C1C(O)CCC2(C)C(CCC3(C(C(C)C=CC(CC)C(C)C)CCC33)C)C3=CC=C21 OQMZNAMGEHIHNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SGNBVLSWZMBQTH-FGAXOLDCSA-N Campesterol Natural products O[C@@H]1CC=2[C@@](C)([C@@H]3[C@H]([C@H]4[C@@](C)([C@H]([C@H](CC[C@H](C(C)C)C)C)CC4)CC3)CC=2)CC1 SGNBVLSWZMBQTH-FGAXOLDCSA-N 0.000 description 2
- BTEISVKTSQLKST-UHFFFAOYSA-N Haliclonasterol Natural products CC(C=CC(C)C(C)(C)C)C1CCC2C3=CC=C4CC(O)CCC4(C)C3CCC12C BTEISVKTSQLKST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 2
- 239000002262 Schiff base Substances 0.000 description 2
- 150000004753 Schiff bases Chemical class 0.000 description 2
- 240000007776 Solanum aviculare Species 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- HZYXFRGVBOPPNZ-UHFFFAOYSA-N UNPD88870 Natural products C1C=C2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(C)=CCC(CC)C(C)C)C1(C)CC2 HZYXFRGVBOPPNZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002433 Vinyl chloride-vinyl acetate copolymer Polymers 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 239000011149 active material Substances 0.000 description 2
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 239000012237 artificial material Substances 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- LGJMUZUPVCAVPU-UHFFFAOYSA-N beta-Sitostanol Natural products C1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(C)CCC(CC)C(C)C)C1(C)CC2 LGJMUZUPVCAVPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SGNBVLSWZMBQTH-PODYLUTMSA-N campesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CC[C@@H](C)C(C)C)[C@@]1(C)CC2 SGNBVLSWZMBQTH-PODYLUTMSA-N 0.000 description 2
- 235000000431 campesterol Nutrition 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- HGAZMNJKRQFZKS-UHFFFAOYSA-N chloroethene;ethenyl acetate Chemical compound ClC=C.CC(=O)OC=C HGAZMNJKRQFZKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004927 clay Substances 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 2
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- VOZRXNHHFUQHIL-UHFFFAOYSA-N glycidyl methacrylate Chemical compound CC(=C)C(=O)OCC1CO1 VOZRXNHHFUQHIL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- HCXVJBMSMIARIN-PHZDYDNGSA-N stigmasterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)/C=C/[C@@H](CC)C(C)C)[C@@]1(C)CC2 HCXVJBMSMIARIN-PHZDYDNGSA-N 0.000 description 2
- 235000016831 stigmasterol Nutrition 0.000 description 2
- 229940032091 stigmasterol Drugs 0.000 description 2
- BFDNMXAIBMJLBB-UHFFFAOYSA-N stigmasterol Natural products CCC(C=CC(C)C1CCCC2C3CC=C4CC(O)CCC4(C)C3CCC12C)C(C)C BFDNMXAIBMJLBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 2
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 2
- 238000005496 tempering Methods 0.000 description 2
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 2
- NOWKCMXCCJGMRR-UHFFFAOYSA-N Aziridine Chemical compound C1CN1 NOWKCMXCCJGMRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000145 Bacillolysin Proteins 0.000 description 1
- 241000194110 Bacillus sp. (in: Bacteria) Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004031 Carboxy-Lyases Human genes 0.000 description 1
- 108090000489 Carboxy-Lyases Proteins 0.000 description 1
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 description 1
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 1
- BRLQWZUYTZBJKN-UHFFFAOYSA-N Epichlorohydrin Chemical compound ClCC1CO1 BRLQWZUYTZBJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide Chemical compound C1CO1 IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000004195 Isomerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 description 1
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 description 1
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 description 1
- 102000035092 Neutral proteases Human genes 0.000 description 1
- 108091005507 Neutral proteases Proteins 0.000 description 1
- 229920002292 Nylon 6 Polymers 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 241000282941 Rangifer tarandus Species 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 235000002591 Solanum aviculare Nutrition 0.000 description 1
- 229930182558 Sterol Natural products 0.000 description 1
- 241000188156 Tamu Species 0.000 description 1
- RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N Titanium Chemical compound [Ti] RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- QCWXUUIWCKQGHC-UHFFFAOYSA-N Zirconium Chemical compound [Zr] QCWXUUIWCKQGHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003082 abrasive agent Substances 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 1
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000008238 biochemical pathway Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000011449 brick Substances 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 229910010293 ceramic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000003413 degradative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 125000005442 diisocyanate group Chemical group 0.000 description 1
- AFOSIXZFDONLBT-UHFFFAOYSA-N divinyl sulfone Chemical group C=CS(=O)(=O)C=C AFOSIXZFDONLBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009088 enzymatic function Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- STVZJERGLQHEKB-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol dimethacrylate Chemical compound CC(=C)C(=O)OCCOC(=O)C(C)=C STVZJERGLQHEKB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 1
- 239000008394 flocculating agent Substances 0.000 description 1
- IVJISJACKSSFGE-UHFFFAOYSA-N formaldehyde;1,3,5-triazine-2,4,6-triamine Chemical compound O=C.NC1=NC(N)=NC(N)=N1 IVJISJACKSSFGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000003622 immobilized catalyst Substances 0.000 description 1
- 239000003262 industrial enzyme Substances 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 239000013618 particulate matter Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- LDPARMXGUKBPBE-UHFFFAOYSA-N phenoxybenzene phthalic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1C(O)=O.C=1C=CC=CC=1OC1=CC=CC=C1 LDPARMXGUKBPBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229910052573 porcelain Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000003134 recirculating effect Effects 0.000 description 1
- 239000004576 sand Substances 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 150000003432 sterols Chemical class 0.000 description 1
- 235000003702 sterols Nutrition 0.000 description 1
- KKEYFWRCBNTPAC-UHFFFAOYSA-L terephthalate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)C1=CC=C(C([O-])=O)C=C1 KKEYFWRCBNTPAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910052719 titanium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010936 titanium Substances 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 229910052726 zirconium Inorganic materials 0.000 description 1
Landscapes
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Description
Vynález se týká způsobu imobilizace mikrobiálních buněk, rostlinných buněk a enzymů na aktivované organické a anorganické polymery za tvorby imobilizováných buněčných nebo enzymových biokatalyzátorů.
Buněčné nebo enzymové biokatalyzátory podle vynálezu jsou využitelné pro průmyslové biotransformace resp. umožňují vypracovat diskontinuální nebo kontinuální biotechnologie výroby farmaceuticky, potravinářsky či zemědělsky významných produktů či meziproduktů A
Známé způsoby imobilizace buněk a enzymů lze obecná charakterizovat jako fyzikální např. sorpce a.inkluze, fyzikálně chemické např. polární vazba a chemické např. kovalentní vazba. Podrobněji jsou tyto postupy zmíněny pokud jde o imobilizaci buněk např. v přehledných článcích Vandamme /Chem. Ind., 1070, 1976/, Jack a Zajic /Adv, Biochem. Eng., 5, 126', 1977/, Durand a Navarro /Přoc. Biochem., 13, 14, 1978/, Vojtíšek a sp. /Biol. listy, 44, 192, 1979/ a Chibata a losa /Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 10, 197, 1981/, pokud jde o imobilizaci enzymů např. v monografiích Immobilized Enzymes /edit. 0. Zaborsky, CRC Press, A Division of the Chemical Rubber Co., USA Cleveland, Ohio, 1974/, Insolubilized Enzymes /edit. M. Salmona, C. Saronia, S. Gerattini, Raven Press, New York, 1974/ a Industrial Enzymes, Recent Advances /J. C. Johnson, Noyes Data Corporation, Park Ridge, New Yersey, Chemical Technolog/ Review No 85, USA, 1977/.
Jako nosičů pro imobilizaci buněk á enzymů je využívána řada syntetických organických inertních či chemicky aktivních polymerů získaných cíleně vedenou polymerací např. na bázi methakrylaldehydu, glycidylmethakrylátu, hydroxyalkylmethakrylátu, přírodních
234 059 organických polymerů např. celulózy a jejích derivátů, chitinu, pólysacharidů, anorganických přírodních nebo umělých materiálů, např. drti z cihel, písku, porézní hlíny, jílu, keramických materiálů, skla, .anorganických gelů na bázi zirkonia a titanu apod.
Z řady jmenovaných, různých, více či méně chemicky definovaných materiálů, které lze využít jako nerozpustných nosičů pro ímobilizaci buněk a enzymů vyplývá, že tyto materiály se budou lišit především cenou a dostupností a jejich využití pro imobilizaci bude limitováno především teritoriálními podmínkami, zvláš tě u syntetických, chemicky definovaných organických a anorganických polymerů. Tak např. byl popsán způsob imobilizace bakteriálních buněk na povrch modifikovaných makroporézních kopolymerů čs. provenience, zejména glycidylmethakrylátu s ethyléndimethakrylátem a kopolymerů methakrylaldehydu s divinylbenzenem po jejich převodu na aminoderiváty ošetřením organickými aminy a zesítěním glutaraldehydem v čs. autorském osvědčení č. 200 802, dále způsob imobilizace kvasinek na částice organického polymeru Čs. provenience na bázi hydroxyalkylmethakrylátu, po předchozí chemické aktivaci částic nosiče epichlorhydrinem, modifikaci hexamethylendiaminem a následné kovalentní vazbě ..buněk glutaraldehydem,v čs. autorském osvědčení č. 201 786. I když byly získány preparáty imo bilizovaných buněk s dobrými biochemickými a dalšími vlastnostmi, cena a dostupnost a možné způsoby chemické aktivace a modifikace zmíněných typů organických polymerů nedovolují reálný předpoklad průmyslového využití těchto materiálů jako nosičů požadovaných biologických aktivit pro průmyslové biotransformace. Z ekonomicky přitažlivého hlediska se zdají být nejvíce využitelné organické a anorganické umělé nebo přírouní materiály typu různých sorbentů jejichž cena a dostupnost významně neovlivňuje jejich průmyslové využití.
V Československu byly vyvinuty, a některé z nich jsou průmys lově vyráběny, různé syntetické organické a anorganické polymerní sorbenty. Jedná se o polymerní mikroporézní organický sorbent na bázi polyethylentereftalátu /SOHSILEN/, jehož způsob výroby je uveden v čs. autorském osvědčení č. 171 917 a polymerní mikroporézní organické sorbenty na bázi poly/-2,6-dimethyl/fenyloxidu
- 4 234 OSB /SOSFIX/, na áci poly-6-kaprolaktamu /APA a SILQNA lišící se stupněm polymerace/, na bázi kopolyméru poly-6-kaprolaktawu s póly e thy lenoxidem /AMEDAP/ a na bázi blokového kopolyméru vinylchloridu s vinylacetótem, jejichž způsoby výroby jsou uvedeny v čs. autorském osvědčení č. 202 215. Z dalších organických sorbentů čs. provenience lze uvést polykondenzáty melaminu a formaldehydu /W/ a močoviny a formaldehydu /MOR/, jejichž způsob výroby je předmětem čs. autorského osvědčení č. 205 586. Konečně je v Československu průmyslově vyráběn anorganický mikroporézní sorbent na bázi polymerního oxidu křemičitého pod komerčním označením SILOXID. Všechny uvedené typy polymerních organických a anorganických sorbentů lze principiálně připravit v požadované kvalitě, zejména o požadované distribuci velikosti částic, specifickém povrchu, porositě, bobtnavosti apod., což umožňuje využití těchto materiálů jak pro imobilizaci celých buněk tak enzymů.
Limitujícím faktorem universálního využití těchto polymerních sorbentů čs. provenience, jako nosičů pro imobilizaci biologicky aktivních materiálů, je však universální způsob imobilizace celých enzymově aktivních buněk a enzymů, s cílem dosažení vysoké specifické aktivity získaných imohilizováných katalyzátorů a vysokého výtěžku imobilizace při zachování vysoké stability biologických resp. enzymových funkcí, bez ohledu na chemické složení těchto polymerních sorbentů na jedné straně, organický a anorganický s.orbent, základní chemické složení monomeru, typ chemických vazeb a stupeň polymerace, a druhu a kvality výchozího biologicky resp. enzymově aktivního materiálu, který je imobilizován, mikrobiální buňky, rostlinné buňky, enzymy mikrobiálního, živočišného či rostlinného původu, na stráně druhé.
V československé patentové literatuře byly již popsány určité způsoby imobilizace především enzymů na některé z uvedených typů polymerních mikroporézních sorbentů čs. provenience. Jedná se především o čs. autorské osvědčení č. 214 096, kde je popsáno využití mikroporézních částic polymerů na bázi polyethylentereftalétu /SORSIIEN/, polydimethylfenyloxidu /SORFIX/ a polykaprólaktamu /APA/ pro výrobu imobilizovaných enzymů jejich sorpcí a ná- 5 234 059 sledně kovalentní vazby pomocí sorbovaných sítovacích činidel, zejména glutaraldehydu, tót ue*r.diisokyanátu, divinylsulfonu apod., nebo sorpcí'roztoků enzymů na částice těchto organických polymernich sorbentů a následujícího kovalentního zesítění sórbovaných enzymů těmito polyfunkčními sítovacími činidly. Citované autorské osvědčení zahrnuje pouze využití uvedených tří typů mikroporézních organických polymernich sorbentů a je omezeno pouze na způsob výroby zmobilizovaných enzymů popsaným způsobem. V čs. autorském osvědčení č.w209 743 je popsán opět pouze způsob imobilizace enzymů s omezením na mikroporézní organické polymerní sorbenty čs. provenience na bázi poly-6-kaprolaktamu, ‘lišících se různým stupněm polymerace a polykondenzátů melaminu s formaldehydem a močoviny s formaldehydem, tedy výhradně organických polymernich sorbentů, obsahujících v molekule polymeru primární nebo sekundární aminoskupiny, přičemž vlastní imobilizace enzymů spočívá v předchozí chemické reakci částic těchto syntetických aminopolymerfc. s volným glutaraldehydem, za současné chemické aktivace těchto polymernich částic, vymytí nadbytku glutaraldehydu a následující kovalentní vazby enzymů prostřednictvím chemicky aktivních aldehydových skupin, za tvorby Schiffových baží mezi enzymovou bílkovinou a částicemi uvedených, popsaným způsobem aktivovaných, sorbentů.. Konečné-v čs. autorském osvědčení č. 217 857 je popsán způsob přípravy zmobilizovaných buněk kvasinek s omezením na využití jediného typu organického polymerního sorbentů čs. provenience na bázi polydimethylfenyloxidu /SOBFIX/, spočívající v ošetření tohoto sorbentů glutaraldehydem, následného vymytí glutaraldehydu a zakotvení buněk kvasinek kombinací sorpce a kovalentní vazby. Citované autorské osvědčení je tedy omezeno pouze na jediný typ využití daného organického polymerního sorbentů, na jediný typ mikrobiální buňky - kvasinku a jediný způsob imobilizace pomocí sorbovaného glutaraldehydu. Stejným způsobem imobilizované rostlinné buňky, na stejný typ mikroporézního organického polymerního sorbentů, byly popsány v odborné litaratuře /Biotechnol. Lett., 3, No. 8447, 1981/.
Zjistili jsme v nedávné době, že lze výhodně zmobilizovat různé mikrobiální a rostlinné buňky, jejich podbunečné částice a buněčné fragmenty a různé enzymy mikrobiálního, rostlinného či
- 6 234 059 živočišného původu, pomocí reaktivních, ve vodě rozpustných polymerů, obsahujících nejméně dvě primární a/nebo sekundární aminoskupiny v molekule, zejména na bázi polyethyleniminu, pólylysinu a hexamethylendiaminu a bifunkčních sítovacích činidel, zejména glutaraldehydu. Tyto, do značné míry univerzální a z ekonomického hlediska přijatelné způsoby imobilizace buněk a enzymů, však v některých případech poskytují měkké preparáty imobiliz©váných biokatalyzátorů houbovitého charakteru, s horšími hydrodynamickými vlastnostmi a zvláště za použití buněk vyšších organismů jako výchozího imobilizováného biologického materiálu, zejména buněk vyšších hub a rostlinných buněk, nebo enzymů atakujících vysokomolekulární substráty /proteázy - bílkoviny, amyloglukosidáza - škrob apod./, poskytují preparáty s nižší biologickou/i?esp· enzymovou. aktivitou a s kratšími operačními poločasy při jejich vsádkovém opakovaném nebo kontinuálním využití požadovaným směrem biotransformace.
Ověřili jsme proto experimentálně možnost využití těchto reaktivních rozpustných polymerů k aktivaci všech mikroporézních polymerní ch organických a anorganických sorbentů čs. provenience, a vypracovali způsoby imobilizace biologicky resp. enzymově aktivních mikrobiálních a rostlinných buněk a enzymů mikrobiálního, rostlinného a živočišného původu, s cílem získání imobilizováných biokatalyzátorů se zdokonalenými hydrodynamickými a dalšími výhod nými vlastnostmi, umožňujícími jejich průmyslová využiti požadovaným směrem biotransformace ve farmaceutickém a potravinářském průmyslu a v zemědělství.
Způsob imobilizace mikrobiálních a rostlinných buněk a enzymů podle vynálezu spočívá v tom, že částice ve vodě nerozpustných organických polymerů, zejména na bázi polyethylentereftalátu, poly-2,6-dimethylfenyloxidu, poly-6-kaprolaktamu, blokového kopolymeru poly-6-kaprolaktamu s polyethylenoxidem, kopolymeru vinylchloridu a vinylacetótem, polykondensótů melaminu s formaldehydem a močoviny s formaldehydem a anorganických polymerů, zejména na bázi polymerního oxidu křemičitého se zaktivují s chemicky reaktivními ve vodě rozpustnými polymery, které se připraví reakcí ve vodě rozpustných látek obsahujících nejméně 2 primární a/nebo
- 7 234 059 sekundární amineskupiny, zejména větveného polyethylenxminu o molekulové hmotnosti 50 000 až 1 000 000, popřípadě pólylysinu o molekulové hmotnosti 1 000 až 50 000, lysinu nebo hexamethylendiaminu a bifUnkčních aldehydů dikarboxylových kyselin jako je glutaraldehyd, načež se k aktivovaným částicím nerozpustných polymerních materiálů přidá vodná nebo pufTovaná vodná suspenze celých mikrobiálních nebo rostlinných enzymově aktivních buněk a/nebo vodný nebo pudrovaných vodný roztok enzymu a vzniklý imobilizovaný biokatalysátor se separuje a promyje. £ imobilizaci buněk a enzymů se použije ve vodě nerozpustných částic organických a anorganických polymerů o velikosti 0,001 až 5 mm, specifickém povrchu od l do 700 m^/g a porositě částic od 0,01 do 2,5 em?/g. Aktivace ve vodě nerozpustných částic polymeru zejména na bázi polyethylentereftalátu, poly-2,6-dimethylfenyloxidu, blokového kopolymeru vinylchloridu s vinylacetátem a polymerního oxidu křemičitého se provádí jejich smísením s předem připravenými reaktivními rozpustnými polymery, které se připraví reakcí ve vodě rozpustných látek obsahujících nejméně dvě primární a/nebo sekundární aminaskupiny s bifunkčními aldehydy dikarboxylových kyselin, načež se? po odstranění přebytku roztoku vystaví kontaktu s buněčnou suspensí či roztokem enzymu. Částice polymerů na bázi poly-6-kaprolaktamu, blokového kopolymeru poly-6-kaprolaktamu s polyethylenoxidem a polykondenzátů melaminu s formaldehydem a močoviny s formaldehydem se uvádí do kontaktu s jednotlivými reakčními složkami reaktivních rozpustných polymerů postupně, přičemž v prvé fázi se částice uvedených polymerů vystaví kontaktu s roztokem polyethylenxminu, polylysinu, lysinu nebo hexamethylendiaminn a po sorpci těchto látek a po odstranění přebytečného roztoku se tyto částice vystaví účinku bxfunkčního aldehydu dikarboxylových kyselin, například glutaraldehydu, načež se po vytvoření reaktivního polymeru na povrchu částic přebytečný roztok opět odstraní a uvedené aktivované polymerní částice se vystaví kontaktu s buněčnou suspenzí, či roztokem enzymů.
Jako výchozího biologického materiálu pro imobilizaci se použije celých neporušených enzymově aktivních buněk mikroorganismů,
234 0S9 zejména grampozitivních a gramnegativních bakterií, aktinomycet, acidoresistentních bakterií, kvasinek a dalších imperfektních hub a enzymově aktivních rostlinných buněk a surových technických nebo do různého stupně čistých enzymů mikrobiálního, rostlinného či živočišného původu.
V následujících příkladech provedení se jako látky obsahující nejméně dvě primární a/nebo sekundární aminoskupiny používá komerč nich flokulantů na bázi polyethyleniminu o molekulové hmotnosti 200 000 až 300 000 v koncentraci přibližně 30 hmotnostních procent ve flokulantu, nebo pólylysin s molekulovou hmotností od 25 000 do 50 000 či oligomery polylysinů vzniklé reakcí technického lysinu s glutaraldehydem.
Enzymové aktivity zmobilizovaných biologických materiálů byly hodnoceny za míchání a temperace definovaného množství částic v roztoku substrátu za podmínek měření v oblasti kinetiky nultého řádu enzymové reakce a enzymová aktivita resp. specifická aktivita vyjadřována jako množství vytvořených umolů produktu resp. produktů/mg nebo g vlhké či suché hmoty částic, pokud není v příkladech uvedeno jinak.
Pro způsob imobilizace buněk podle vynálezu lze používat produkčních buněk obsahujících různé enzymy, přičemž je výhodné použití pro imobilizaci buněk mutantních organismů, získaných šlechtěním, selekcí a nahromaňovacími metodami a genetickou manipulací, nebot získané zmobilizované preparáty pak mají vysokou specifickou aktivitu.
Imobilizováné mikrobiální a rostlinné buňky mohou nést různé enzymové aktivity, zejména hydrolázy, lyázy, izomerázy, dekarboxylázy, oxidoredůktázy a jiné aktivity a/nebo části či celé sekvence enzymů logického sledu biochemické dráhy, zejména degradativního metabolismu, glykolýzy, enzymů katalyzujících biotransformace hormonů, produkci solanových alkaloidů, fytosterolu, tosteralu, kampesterolu, stigmasterolu a dalších látek.
- 9 234 059
V dalším je vynález blíže objasněn v příkladech provedení, aniž by se jimi omezoval.
Příklad 1
Bylo připraveno 100 ml 2 % /hmota/objem/ vodného roztoku póly ethyleniminu /Sedipuru CL-930/ a roztok byl vakuově sfiltrován přes porcelánovou fritu S4 tak, aby byl odstraněn nepatrný nerozpustný podíl obsažený v tomto komerčním flokulaňtu. Ke 100 ml dokonale rozpuštěného čilého roztoku Sedipuru byl přidán 25 % /objem /objem/ vodný roztok glutaraldehydu tak, aby jeho výsledná koncentrace v uvedeném objemu činila 1 % /objem/objem/. Reakční směs, jejíž pH činilo 6,8, byla přelita do 500 ml skleněj&é varné baňky jejíž hrdlo bylo překryto hliníkovou folií a baňka umístěna na rotační třepací stroj o počtu otáček 250/min a směs nepřetržitě; míchána po dobu 24 hod. při teplotě 3Q°C. Tímto postupem byl připraven roztok reaktivního polymeru.
g suché hmoty mikroporézniho nosiče SOSFIX poly-/2,6-dimethyl/fenyloxidu o průměrné distribuci velikosti částic 0,2 až 0,5 mm, porozitě částic 0,459 cm^/g a specifickém povrchu 400 m^/g, bylo suspendováno v 100 ml směsi etanol:voda /objemový poměr, 1:3/ a ponecháno bobtnat v této směsi přes noc. Následující den byla suspenze částic nosiče vakuově zfiltrována a materiál důkladně promyt jedním litrem vody a odsát.
g vlhké hmoty nosiče bylo suspendováno ve 100 ml roztoku reaktivního vodorozpustného p0l5nne.ru /dále jen RRP/ a po homogenizaci částic byla směs 1 hodinu nepřetržitě míchána na reciprokém shakeru a poté ponechána 2 hodiny stát při teplotě místnosti, načež byla vakuově sfiltrována a dobře odsátý aktivovaný nosič byl rozdělen, na 5 stejných hmotnostních dílů a 2 g vlhké hmoty do 5ti 50 ml skleněných kádinek. Dále bylo připraveno 5 vodných suspenzí celých nativních buněk kvasinky Saccharomyces cerevisiae obsahujících 100, 200, 250, 300 a 400 mg vlhké, dobře odstředěné buněčné hmoty/ml. Potom 4 ml homogenních vodných suspenzí buněk o jejich různé koncentraci bylo přidáno vždy ke 2 g vlhké hmoty aktivovaného nosiče, suspenze promíchána, kádinky překryty fólií a umístěny na reciproký shaker a po dobu 7 hodin nepřetržitě míchány. Po uvedené době byly vzorky postupně několikrát dekantovány
- 10 234 059 vodou tak dlouho, až nedocházelo k zákalu horní vrstvy kapaliny po kvantitativní sedimentaci částic. Poté byly vzorky postupně pře neseny na Buchnerovu nálevku jejíž dno. bylo překryto textilním, materiálem Aalolisová plachétka/ a vakuově dobře odsáty a na nálevce ještě důkladně promyty vodou, po odsátí usušeny do konstantní hmotnosti /105°C/ a výtěžek imobilizace buněk orientačně sledován v závislosti na jejich'koncentraci při stejné hmotnosti stejným způsobem aktivovaného nosiče, podle přírůstku vázaného dusíku. Výsledky jsou shrnuty v následující tabulce.
| Koncentrace buněk | |||||
| /mg/ml/ | 100 | 200 | 250 | 300 | 400 |
| Přírůstek dusíku /%/ | 1,25 | 2,03 | 2,68 | 3,02 | 3,16 |
Z uvedených hodnot v tabulce vyplývá logika volby koncentrace buněk 300 mg/ml na množství stejným způsobem aktivovaného nosiče, která je použita v následujících příkladech provedení, kde jsou jako vázaný materiál použity mikrobiální buňky.
Příklad 2
Vzhledem ke skutečnosti, že doba styku buněk s aktivovaným nosičem, jak je popsána v příkladu 1, byla empiricky zvolena /7 hodin/, byla dále sledována časová závislost kontaktu buněk se stejným typem a stejným způsobem aktivovaného nosiče.
100 ml 1-t? bylo připraveno způsobem uvedeným v příkladu 1, stejně tak jako způsob ošetření stejného typu nosiče před aktivací včetně aktivace samotné. K 5ti stejným množstvím dobře odsátého, vlhkého, aktivovaného nosiče byly přidány vždy a 4 ml vodné suspense buněk obsahující 300 mg vlhké hmoty nativních kvasinek Saccharomyces cerevisiae a imobilizace byla prováděna mícháním způsobem jak je uvedeno v příkladu 1. V různých časových intervalech byly reakční směsi postupně dekantovány, vakuově, sfiltrovány, promyty a sušeny způsobem, který je rovněž uveden v příkladu 1 a optimální doba kontaktu buněk s aktivovaným nosičem kalkulována z množství zachyceného biologického dusíku. Výsledky jsou shrnuty v následující tabulce.
- 11 234 059
| Doba kontaktu /h/ | 1 | 2 | 3 | 4 | 24 |
| Přírůstek dusíku /%/ | 3,72 | 3,73 | 3,73 | 3,68 | 3,55 |
Z hodnot uvedených v tabulce byla zvolena experimentálně nalezená doba kontaktu buněk s aktivovaným nosičem 3 hodiny, která je použita v následujících příkladech provedení, stejně tak jako experimentálně nalezená koncentrace buněk uvedená v příkladu 1.
Příklad 5
Bylo připraveno 400 ml RRP postupem uvedeným v příkladu 1. Materiál SORFIX /10 g/ byl před aktivací ošetřen směsí ethanol/ voda rovněž jak je uvedeno v příkladu 1» Další mikroporézní nosiče typu SILOXID /s různou distribucí velikostí částic/ a typu SORSILEN v množství a 10 g suché hmoty, byly smočeny přibližně 1 litrem vody, několikrát dekantovány a vakuově dobře sfiltrovány. Dále bylo připraveno 100 ml vodné suspense Saccharomyces cerevisiae s invertázovou aktivitou v množství 300 mg vlhké hmoty buněk/ ml. Aktivita invertázy v této suspensi činila 13,8 j/mg suché hmoty buněk.
Vždy 10 g vlhké hmoty dobře odsátých mikroporézních nosičů zmíněných komerčních názvů bylo suspendováno v a 100 ml RRP a suspenze částic těchto materiálů aktivována způsobem popsaným v příkladu 1. Po aktivaci a odděleném odsátí RRP od aktivovaných nosičů byly tyto odděleně suspendovány vždy ve 20 ml vodné suspenze buněk a po homogenizaci a suspendaci byla imobilizace buněk prováděna 1 hodinovým mícháním a následujícím 2 hodinovým stáním při teplotě místnosti. Poté byly suspenze odděleně několikrát dekantovány vodou tak dlouho, až nedocházelo k zákalu horní vrstvy kapaliny po kvantitativní sedimentaci částic. Poté byly postupně materiály separovány filtrací přes textilní materiál na filtru ještě důkladně promyty vodou a dobře odsáté vlhké materiály zváženy a dále analyzovány. Výsledky jsou shrnuty v následující tabulce.
- 12 234 059
| Typ nosiče | Poly-/2,6-di- Polymerní oxid methyl/fenyl- křemičitý | Polyethylen- tereftalát /SORSILEN/ | ||
| oxid /SORFIX/ | I /SILOXID/II | |||
| Prům. distribuce | ||||
| velikosti částic | 0,2 až 0,5 | í | 0,2 až 0,5 | 0,02 až 0,03 |
| /mm/ | 1 | 0,01 až §80 | ||
| Porosita částic | 0,048 | |||
| /cm5/g/ | 0,459 | neznámá | 0,800 | |
| Specifický povrch | 400,0 | 62,0 | 66,0 | |
| /nr/g/ | 100,0 | |||
| /+/ Spec. aktivita | ||||
| u imobil.kvasine<k | 563,0 | 110,0 | 145,0 | |
| na nosičích /j/g | 263,0 | |||
| suché hmoty | ||||
| Přírůstek dusíku /%/ | 0,09 | 0,43 0,11 | 0,26 |
A/ Aktivita invertázy se sacharózou jako substrátem byla stanovena podle J.B. Lloyda a W.J. Whelana /Analyt. Biochem., 30,
No 3, 467, 1969/.
Příklad 4
Byla provedena imobilizace celých bakteriálních buněk Escherichia coli s benzylpenicilinamidohydrolázovou aktivitou na pevné částice mikroporézních nosičů typu SORFIX, SILOXID a SORSILEN aktivovaných pomocí RRP. Příprava RRP, smáčení nosičů a jejich aktivace, koncentrace výchozího buněčného materiálu o specifické aktivitě 14,5 j/mg suché hmoty buněk, imobilizačni technika, dekantace, promývání a filtrace materiálů imobilizováných buněk byla provedena jako v příkladu 3. Výsledky jsou shrnuty v následující tabulce.
| Typ nosiče | Poly-/2,6-di- Polymerní oxid methyl/fenyl- křemičitý oxid /SORFIX/ /SILOXID/ | Pólyethylén tereftalát /SORSILEN/ |
| Prům.distribuce velikosti částic /mm/ | 0,2 až 0,5 0,2-0,5 0,01-0,8 | 0,02-0,03 |
| Porosita částic /cm?/g/ | 0,459 0,048 neznámá | 0,80 |
Specifický povrch /m2/g/ 400,0
62,0
100,0
66,0
- 13 234 059
| /+/ Spec. aktivita enzymu u imobil. bakterií na nosičích /j/g suché hmoty/ | 2760,0 | 8830,0 | 7560,0 | 9530,0 |
| Přírůstek dusíku /%/ | 5,10 | 5,44 | 4,82 | 4,49 |
/+/ Aktivita benzylpěnicilinamidohydrolézy s benzylpenicilinem jako substrátem byla měřena podle Balasinghama et al., Biochem. Biophys. Acta, 276, 250, 1972.
Příklad 5
Na rozdíl od postupů uvedených v předcházejících příkladech provedení byly v tomto případě pro přípravu RRP použity 2 typy poly-L-lysinů lišících se molekulovou hmotností, /a/ polylysin hydrochlorid o molekulové hmotnosti od 40 000 do 50 000 a /b/ polylysin o molekulové hmotnosti 26 200. Oba typy polylysinů byly připraveny v Ústavu organické chemie a biochemie ČSAV. Reaktivní polymer byl v případě /a/ získán 24 hod. reakcí vodného roztoku reakční směsi v poměru koncentrací 0,1 % polylysin . HC1 /hmota/ objem/ a 0,3 % glutaraldehyd /'objem/objem/ v celkovém objemu 20 ml za nepřetržitého míchání na trepacím stroji při teplotě 30°C a v případě /b/ za stejných reakčních podmínek jako /a/ s tím rozdílem, že 20 ml vodného roztoku reakční směsi obsahovalo 1 % póly lysinu /hmota/objem/ a 0,5 % glutaraldehydu /objem/objem/.
K aktivaci mikroporézního nosiče typu SORFIX, jehož fyzikálněchemická a fyzikální charakteristika je uvedena v příkladu 1, bylo použito á 10 g vlhko hmoty částic nosiče, které byly smíchány s 20 ml každého z popsaným způsobem připravených RRP /a; b/. Aktivace nosiče, způsob imobilizace vodné suspenze buněk kvasinky Saccharomyces cerevisiae s invertázovou aktivitou, včetně koncentrace buněk a dekantace, promytí a filtrace získaného materiálu byla provedena způsobem uvedeným v příkladu 3. U získanéno materiálu byl .stanoven přírůstek biologického dusíku a specifická aktivita invertázy u imobilizováných buněk. Výsledky jsou shrnuty v následující tabulce.
Typ nosiče Poly-/'2,6-dimethyl/fenyloxid /SORFIX/
- 14 234 059
| Použitý typ SRP pro aktivaci čádtic nosiče | /a/ | /b/ |
| /+/ Specifická aktivita invertázy u imobilizovaných kvasinek na nosiči /j/g suché hmoty/ | 9 492,3 | 1 901,3 |
| Přírůstek dusíku /%/ | 3,39 | 1,57 |
/+/ uvedeno v příkladu 3. ·
Příklad 6
Byla provedena řada spektrofotometriekých měření sledujících kinětiku reakce L-lysinu . HG1 s glutaraldehydem za tvorby barevných Schiffových bází. Na základě, získaných výsledků byl použit RRP, pro následnou aktivaci popsaných mikroporézních nosičů, který byl získán 24 hod. reakcí směsi reakčnich složek v aktuálním, poměru Koncentrací 5 % /hmota/objem/ L-lysinu . HC1 a 4 % /objem/ objem/ glutaraldehydu v prostředí 60 ml 0,1 M fosfátového pufru o pH 8,0, za neustálého míchání na třepacím stroji při teplotě 30°c.
Vždy 10 g vlhké hmoty mikroporézních nosičů typu SOSFIX, SILOXID a SORSILEN bylo oddělené smícháno s 20 ml tohoto RRP. Aktivace nosičů, technika imobilizace, včetně hmotnostních poměrů vodné suspenze buněk ku hmotě aktivovaných nosičů, dekantace, pro mytí a separace byla provedena jako v příkladu 3. K imobilizací bylo použito buněk kvasinek s invertázovou aktivitou, rovněž jak je uvedeno v příkladu 3. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce.
| Typ nosiče | Poly-/2,6-dimethyl/fenyloxid /SOBFIX/ | Polymerní oxid křemičitý /SILOXID/ | Polyethylen- tereftalát /SOSSILSN/ |
| Prům. distribuce velikosti částic /mm/ | 0,2 až 0,5 | 0,01 až 0,80 | 0,02 až 0,03 |
| Porosita Částic /cm3/g/ | 0,459 | neznámá | 0,800 |
| Specifický povrch částic /ř»í^/g/ | 400,0 | 100,0 | 66,0 |
/+/ Spec. aktivita invertázy u imobil, 2>28 θ kvasinek na nosičích ,y /j/g suché hmoty/'
1831,8
56,2
234 059
Přírůstek dusíku
1,47
1,51
1,76 /+/ Uvedeno v příkladu 5.
Příklad 7
Pro imobilizaci celých buněk bylo, na rozdíl od předchozích příkladů, použito pevných mikroporézních nosičů, připravených na bázi polyamidů, které obsahují primární a sekundární aminoskupiny Bylo použito tří typů nosičů .komerčního označení APA, AMIDAP a SILONA. Chemické složení těchto polymerů je uvedeno níže. Způsob přípravy RSP a aktivacě částic těchto nosičů bylo, na rozdíl od dříve uvedených příkladů, provedeno v přímém kontaktu s částicemi nosičů. Z řady zkoumaných způsobů aktivace těchto typů mikropo* rézních polyamidových nosičů byl zvolen postup, který poskytuje nejvyšší zachycenou specifickou aktivitu imobilizovanych buněk, spočívající v tom, že v prvé fázi se na povrch částic nosiče adsorbuje polyethylenimin a v druhé fázi se částice nosiče ošetří glutaraldehydem za současně chemické aktivace částic nosičů podle následujícího postupu.
Vždy 10 g uvedených typů polyamidových nosičů, které byly promyty vodou a vakuově odsáty, bylo suspendováno ve . 40 ml 2 % /hmota/objem/ vakuově sfiltrovaného vodného iroztoku Sedipuru CL-930 a suspenze byla 1 hod. míchána při teplotě místnosti. Poté bylý částice nosičů odděleně vakuově odsáty a suspendovány vždy ve 40 ml 1 % /objem/objem/ vodného roztoku glutaraldehydu. Po 1 hod. reakci v průběhu nepřetržitého míchání při teplotě místnosti byly částice aktivovaných nosičů vakuově sfiltrovány a použity pro imobilizaci buněk. Buněčná suspenze Saccharomyces cerevisiae, o koncentraci 500 mg vlhké hmoty buněk/ml destilované vody, byla v množství 10 ml smíchána vždy s 5 g vlhkého odsátého, aktivovaného nosiče a umístěna na laboratorní shaker· a dále bylo při imobilizaci postupováno, jak je uvedeno v předchozích příkladech, s tím rozdílem, že byla sledována účinnost imobilizace buněk v zá vislosti na době jejích kontaktu s částicemi aktivovaných nosičů v průběhu nepřetržitého míchání při teplotě místnosti. Stupeň imobilizace byl zjištován ve dvou časových intervalech, 1 a 5 hodiny, po předchozí kvantitativní dekantaci, promytí a odsátí způ- 16
234 059 soby uvedenými v předchozích případech provedení. Výsledky jsou shrnuty v následující tabulce.
| Typ nosiče | Poly-6-kaprolaktam, polymerační stupeň 160 /APA/ | Kopolymer poly6-kaprolaktamu s polyethylenoxidem /AMIDAP/ | Poly-6kaprolaktam, polymerační stupen 90 /SILONA/ |
| Prům. distribuce velikosti částic /mm/ | 0,25 | 0,2 až 0,5 | 0,5 |
| Porosita částic /cm5/g/ | 0*67 | 0,393 | neznámá |
| Spec. povrch částic /m2/g/ | 6,6 | 1,6 až 2,0 | 0,5 |
| Doba kontaktu /h/ | 1 . 5 | 1 5 | 1 3 |
| /+/ Spec. aktivita | |||
| invertázy imobil. kvasinek na nosičích /j/g/suché hmoty/ | 8353,3 1900,,0 | 105,0 10473,6 | 438,0 152,0 |
| Přírůstek dusíku /%/ | 0,27 0,28 | 0,58 0,52 | 0,68 1,17 |
/+/ Uvedeno v příkladu 3.
Příklad 8
Byla připravena vodná suspenze čerstvých.nativních promytých buněk imperfektní vláknité houby Aspergillus niger o, koncentraci 300 mg vlhké hmoty buněk/ml vodné.suspenze. Specifická aktivita invertázy u tohoto mikroorganismu činila 0,3 j/g suché hmoty buněk. Buňky byly sklizeny po 24 hod. submersní jednorázové kultivace ve fermentačním tanku za podmínek zabraňujících růstu buněk v peletách v živné půdě se sacharózou jako zdrojem uhlíku. Dále bylo připraveno 50 ml vodného roztoku RRP 24 hod. reakcí reakčních složek Sedipur CL-930/glutaraldehyd v poměru jejich koncentrací a způsobem uvedeným v příkladu 1.
Vždy k 20 g vlhké, dobře odsáté hmoty promytých mikroporézních nosičů typu SORFIX a SORSILEN bylo přidáno 25 ml RRP a aktivace nosičů byla prováděna mícháním a stáním způsobem uvedeným v příkladu 1, včetně popsaného způsobu separace chemicky aktivovaných částic obou typů nosičů.
g vlhké, odsáté hmfrty promytého mikroporézního nosiče typu SILONA, bylo aktivojř^no v přímém sekvenčními kontaktu způsobem
-17 23« 059 principiálně popsaným v příkladu 7, tak, že toto množství bylo suspendováno v 80 ml sfiltrovaného 2 % /hmota/objem/ vodného roztoku SEDIPURU CL-930, 10 min. směs byla míchána a poté suspenze ponechána 50 min. stát, částice odsáty a k dobře odsátým částicíqi bylo přidáno 80 ml 1 % /objem/objem/ vodného roztoku glutaraldehydu a dále bylo postupováno v aktivaci mícháním a stáním ve stejných časových intervalech, načež byla provedena separace částic nosiče a jejích kvantitativních odsátí.
K a 20 g vlhké hmoty popsaným způsobem aktivovaných nosičů typu SORPXX, SORSILEN a SILONA bylo přidáno 40 ml vodné buněčné suspenze Aspergillus niger a imobilizace buněk probíhala 1 hod. mícháním a 2 hod. stáním. Poté byly částice jednotlivých preparátů imobilizováných buněk vakuově sfiltrovány přes textilní materiál, několikrát dekantovány vždy několika litry destilované vody, znovu odsáty a několikrát důkladně promyty vodou. Dále byly preparáty hodnoceny na specifickou aktivitu invertázy a obsah biologického dusíku. Výsledky jsou shrnuty v následující tabulce.
| Typ nosiče | Poly-/2,6-di- methyl/fenyl- oxid /SORFIX/ | Polyethylen- tereftalát /SORSILEN/ | Poly-6-kaprolaktam; polymerační stupen 90 /SILONA/ |
| Prům.distribuce velikosti. částic /mm/ | 0,5 až 1,0 | 0,5 až 1,2 | 0,5 |
| Porosita částic /cm3/g/ | 0,459 | 2,14 | 0,5 |
| Spec.povrch částic /m2/g/ | 400,0 | 56,0 | 0,5 |
| /+/ Spec.aktivita invertázy u imobil. vláken A. niger na nosičích /j/g suché hmoty/ | 1,5 . 10-5 | 1,2 . 10’5 | 7,3 . 10-4 |
| Přírůstek dusíku /<$>/ | 0,06 | 0,08 | 1,3.2, |
/+/ Uvedeno v příkladu 3.
Příklad 9
Z 24 hodinové a 48 hodinové kultury buněk Aspergillus niger s invertázovou aktivitou, byly připraveny homogenní vodné suspenze promytých vláken o koncentraci buněk 300 mg vlhké hmoty/ml
- 18 2M0ST suspenze. Specifická aktivita invertázy buněk 24 hod. kultury činila 0,3 j/g suché hmoty, specifická aktivita téhož enzymu v buňkách 48 hod. kultury činila 0,138 j/g suché hmoty buněk.
Dále byl připraven RRP na bázi polylysin/glutaraldehyd, principiálně způsobem popsaným v příkladu 5 tak, že bylo předem připraveno 25 ml 1 % /hmota/objem/ roztoku póly lysinu s molekulovou hmotností 26 200, který byl rozpuštěn v 0,1 M tris pufru pH 8,0 a do tohoto roztoku byl přidán 25 % vodný roztok glutaraldehydu tak, aby jeho počáteční koncentrace v reakční směsi činila 0,5 % /objem/objem/, přičemž reakce probíhala za nepřetržitého míchání po dobu 24 hod. při teplotě 30°G.
g vlhké hmoty polymerního nosiče typu, SORFIX bylosmícháno s 25 ml zmíněným způsobem připraveného RRP a aktivace částic nosiče probíhala 1 hod. mícháním a 2 hod. stáním při teplotě místnosti, načež byly částice vakuově odsáty a produkt byl rozdělen na 2 stejné hmotnostní díly /a 10 g vlhké hmoty/ a k jedné části bylo přidáno 20 ml 24 hod. kultury buněčné suspenze, k druhé části 20 ml 48 hod. kultury buněčné suspenze téhož mikroorganismu. Imobilizace buněk probíhala stejným způsobem jako aktivace nosičů, tj. 1 hod. míchání a 2 hod. stání při teplotě místnosti. Poté byly oba materiály odděleně separovány, dekantovány a promyty vodou způsobem popsaným v předchozích příkladech provedení. Výsledky jsou shrnuty v následující tabulce.
Typ nosicče Poly-/2,6-dimethyl/fenyloxid /SORFIX/
Distribuce velikosti částic
| /mm/ | 0,5 až 1,0 | ||
| Porosita částic | |||
| /cm5/g/ . ...................... .. | 0,459 | ||
| Specifický povrch /m^/g/ | 400,0 | ||
| Stáří kultury buněčných vláken A. niger /h/ | 24 | 48 | |
| A/ Výchozí spec. aktivita invertázy u nativních vláken A. niger /j/g suché hmoty/ | 3 . | 10“! | 1,38 . 10-1 |
| /+/ Spec. aktivita invertázy u imobil.vláken A. niger na | . 10“5 | ||
| 1,5 | 2,8 . 10^ | ||
| nosičích /j/g suché hmoty/ | |||
| Přírůstek dusíku /%/ | 0,10 | 0,13 |
/+/ Uvedeno v příkladu 3.
- 19 Přikladlo 234 059
Bylo připraveno 50 ml RRP na bázi polyethylenimin/glutaraldehyd 24 hod. reakci obou reakčních složek způsobem a za podmínek uvedených v příkladu 1.
g vlhké hmoty polymerního nosiče typu SORFIX /Poly-2,6dimethylfenyloxid/ o velikosti částic 0,25 až 0,5 mm, specifickém povrchu 600 m^/g a porositě 0,5 cm^/g bylo po předchozím smočení, nabotnání, promytí a odsátí způsobem uvedeným v příkladu 1, smícháno s 50 ml RRP a aktivace nosiče probíhala 1 hod. mícháním a 2 hod. stáním způsobem rovněž uvedeným v příkladu 1 včetně separace částic aktivovaného, nosiče.
Suspenze jednobuněčné kultury rostlinných buněk Solanum aviculare, získaná aseptickou kultivací za konstantní aerace bez fofoperiody, byla sfiltrována, jednotlivé buňky po oddělení media promyty 0,05 M fosfátovým pufrem obsahujícím 0,75 M KG1 o pH 5,7 a připravena suspenze v tomto pufru obsahuje 150 mg vlhké hmoty promytých rostlinných buněk/ml. K 3 g vlhké odsáté hmoty aktivovaného nosiče bylo přidáno 12 ml suspenze rostlinných buněk a dále bylo při imobilizaci postupováno 1 hod. mícháním a 2 hod. stáním za podmínek a postupem uvedeným v příkladu 2. Poté byl zmobilizovaný materiál několikrát dekantován zmíněným pufrem, sfiltrován, na filtru odsát a znovu tímto pufrem promyt.
Získaný zmobilizovaný materiál byl naplněn do skleněné kolony opatřené pláštěm na temperaci /Pharmacia Fine Chemicals K 26/ 40/ a pevným ložem tohoto biokatalyzátoru bylo směrem shora dolů recirkulačním způsobem čerpáno 100 ml 8 % /hmota/objem/ sterilního vodného roztoku sacharozy rychlostí 1,5 ml/min při teplotě 26°C.
. Ve 24 hod. časových intervalech nepřetržité recirkulace byla analyticky sledována extracelulární produkce-cytosterolu, kampesterolu., stigmasterolu a další, chemicky blíže neidentifikované sterolové komponenty, pomocí HPLC chromatografie popsané Jirků a spol, /Biotechnol. Lett., 3, No. 8, 447, 1981,/. Bylo zjištěno, že během sedmidenní nepřetržité recirkulace pevným ložem biokatalyzátoru dochází k extracelulární produkci uvedených komponent v rozmezí koncentrací 10 až 20 ug/24 hod/100 ug vlhké hmoty zmobilizovaných rostlinných buněk nezměněnou intenzitou a v zachovaných biorytmech.
Přikladli 234 059 g vlhké promyté hmoty anorganického nosiče typu. SILOXID /polymerní oxid křemičitý/ o průměrné velikosti’částic 0,2 až 0,5 mm, specifickém povrchu 62 m2/g a porositě 0,048 cm^/g bylo aktivováno 50 ml RRP na bázi polyethylenimin/glutaraldehyd jako v předcházejícím příkladu. Imobilizace rostlinných buněk S. aviculare byla provedena rovněž jako v příkladu 10 včetně separace, dekantace a promytí uvedeným pufrem.
Extracelulární biochemická aktivita stejných steroidních sloučenin byla sledována v recirkulačním reaktoru s pevným ložem biokatalyzátoru za podmínek a způsobem uvedeným v příkladu 10.
Koncentrace uvedených sloučenin se pohybovala v rozmezí 8 až 16 ug/24 h/100 ug vlhké hmoty imobližováných rostlinných buněk a extracelulární produkce probíhala nezměněnou intenzitou a v zachovaných biorytmech po celou dobu 7 denního sledování.
Příklad 12
Vždy 0,5 g suché hmoty polymemích nosičů typu ΔΡΔ, AKIDAP, SORj/IX,. SORSILEN a PVG-PVA 37 /chemické složení, fyzikální a fyzi xólně chemické charakteristiky nosičů jsou uvedeny níže/ bylo sus pendováno v 10 ml 96 % ethanolu a ponecháno stát po dobu 30 min. za občasného promíchání. Poté byly nosiče suspendovány ve vodě, sfiltrovány, na filtru důkladně promyty vodou a vakuově odsáty.
Dále bylo připraveno 50 ml RRP na bázi polyethylenimin/glutaraldehyd principiálně způsobem uvedeným v příkladu 1 s těmi roz díly, že poměr aktuálních koncentrací reakčnich složek činil 4 %' /limo ta/objem/' Sedipur CL-930 a 2 % /objem/objem/ glutaraldehyd, reakční doba byla 16 hod. a reakční teplota byla 28°C. Promyté vlhké částice jednotlivých nosičů byly odděleně smíchány vždy s 10 ml popsaným způsobem získaného RRP a aktivace materiálů probíhala za neustálého míchání při 25°G po dobu 16 hod. Po uvedené době byly jednotlivé nosiče dekantovány 3krát 50 ml vody a vakuově odsáty. Bylo získáno 1,2 až 1,4 g vlhké hmoty jednotlivých aktivovaných materiálů.
Vždy k 0,5 g vlhké hmoty promytých aktivovaných nosičů bylo přidáno 20 ml roztoku chymotrypsinu rozpuštěného v 0,05 M fosfátovém pufru o pH 7,0. Roztok obsahoval 10. mg/ml bílkovino specifické aktivitě 4,6 j/mg. Imobilizace této proteázy na aktivova- 21 234 059 ných. nosičích probíhala v průběhu nepřetržitého míchání po dobu 18 hodin při teplotě 28°C. Poté byly jednotlivé materiály odděleně vakuově sfiltrovány, na filtru promyty vždy 2krát 50 ml vody, 2krát 50 ml 1M roztoku NaCl, 2krát 50 ml vody a dobře odsáty. Výsledky jsou shrnuty v následující tabulce.
| Typ nosiče | Poly-6-ka- Kopolymer prolaktam; poly-6polymeraČ- kaprolakní stupeň tamu s po- | Poly-2,6- Polyethydimethyl- lenterefenyloxid ftalát | Kopolymer vinylchloridu s viny láce tátem obsahující 20 % vinylacetátových jednotek | ||
| 160 | lyethylen- oxidem | ||||
| Označení | /APA/ | /AMIDAP/ | /SORFIX/ | /SORSXLEN/ /PVG-PVA 57/ | |
| Prům. distribuce velikosti částic /mm/ | 0,2 až | 0,5 0,2 až 0,5 | 0,2 až 0, | 5 0,5 | 0,25 až 1,2 |
| Porosita částic /onč/g/ | 0,588 | 0,420 | 0,459 | 2,454 | neznámá |
| Specifický 6,0 povrch částic /m2/g/ | 7,4 | 575 | ' 100 | 7,8 | |
| /+/ Spec. aktivita imobil. chymo trypsinu na nosičích /j/g vlhké hmoty/' | 26,0 | 27,0 | 55,0 | 52,0 | 25,0 |
/+/ Proteolytická aktivita rozpustného a imobilizovaného chymotrypsinu s kaseinem jako substrátem byla měřena podle Methods of Enzymatic Analysis, Bergmayer, H. U„, /edit./, str. 1006, Verlag Chemie, 1974.
Příklad 15 ííHP byl připraven způsobem uvedeným v příkladu 12. Stejné množství a stejné typy nosičů, jejichž chemické, fyzikální a fyzikálně chemické charakteristiky jsou uvedeny v příkladu 12, byly aktivovány rovněž způsobem uvedeným v příkladu 12, včetně jejich separace a promytí. Imobilizace roztoku neutrální proteázy z Bacillus spo, v 0,05 M fosfátovém pufru o pH 7,0 a aktivitě 1,15
- 22 234 059 j/mg bílkovin, byla provedena rovněž stejným způsobem a za podmínek jak je uvedeno v příkladu 12, včetně promytí vo^ou a roztokem NaCl a separace imobilizovaného enzymu. Výsledky jsou shrnuty v následující tabulce.
/+/ Označení nosiče_APA /+/ Spec. aktivita imobil. neutrálAMIDAP SOBFIX
SORSILEN PVC-PVA 37 ní proteázy na nosičích /j/g vlhké hmoty/
2.6,0
18,0 33,0
35,0 31,0 /+/ Uvedeno v příkladu 12.
Příklad 14
Nosiče typu SORPIX, SORSILEN a PVC-PVA 37, jejichž chemické a fyzikální charakteristiky jsou uvedeny v příkladu 12, byly aktivovány způsobem a za podmínek uvedených rovněž v příkladu 12, způsob /a/, a mícháním se 4 % /objem/objem/ vodným roztokem glutaraldehydu 18 hod. při teplotě 28°0, principiálně způsobem uvedeným v čs. autorském osvědčení č. 214 096, způsob /b/. Promyté částice aktivované oběma způsoby /a; b/ byly v množství 0,5 g vlhké hmoty odděleně suspendovány ve 20 ml 0,05 M fosfátového pufru.o pH 7,0 obsahujícího benzylpenieilinamidohydrolázu o obsahu bílkovin 100 mg/ml a specifické aktivitě enzymu 300 j/mg bílkovin. Po 20 hod. nepřetržitého míchání při 25°G byly nosiče promyty a odsáty způsobem uvedeným v příkladu 12. Výsledky jsou' shrnuty v následující tabulce.
| /+/ Označení nosiče | SORPIX | SORSILEN | PVC-PVA 37 |
| kpůsob akti- vace | /a/ /b/ | /a/ /b/ | /a/ /b/ |
| Spec. aktivita |
imobiliz.benzylpenicilinamidon 0,25 0,24 3,48 1,85 0,22 0,22 hydrolázy na nosičích /j/mg vlhké hmoty/,/ή-/ .
/+/ Uvedeno v příkladu 12 /a/ Předmětný způsob aktivace nosičů pomocí RRP /b/ Kontrolní způsob aktivace nosičů vycházející z čs. AO 214 096
234 059 /++/ Aktivita rozpustné a imobilizované benzylpenicilinamidohydro lézy s benzylpenicilinem jako substrátem byla měřena podle Balasinghama a spol. Biochim. Biophys. Acta, 276, 250, 1972.
Příklad 15
Nosiče typu SORFIX a SORSILEN, jejichž chemické a fyzikální charakteristiky byly uvedeny v příkladu 12, byly aktivovány RRP o složení a způsobem uvedeným rovněž v příkladu 12, včetně separace a způsobu promytí aktivovaných částic vodou, roztokem NaCl a opět vodou.
Vždy 0,5 g vlhké hmoty aktivovaných promytých mikroporézních nosičů bylo odděleně suspendováno ve 20 ml roztoku enzymu amyloglukosidázy v 0,05 M fosfátovém pufru o pH 7,2, získané srážením síranem amonným a odsolemm ultrafiltrací z komerčního preparátu AL1G 150 L firmy NOVO Terapeutisk /Dánsko/. Roztok obsahoval 9 mg/ ml bílkovin, aktivita rozpustné amyloglukosidázy činila 12 j/mlo Imobilizace probíhala za nepřetržitého míchání po dobu 18 hodin při teplotě 12°C. Po uvedené době byly imobilizované materiály promyty 2krát 50 ml vody, 2krát 50 ml 1 M roztoku NaCl a poté opět vodou a dobře odsáty. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce.
Typ nosiče Poly-/2,6-dimethyl/- Polyethylentere/+/ fenyloxid ftalát /SORFIX/ /SORSILEN/ /++/ Spec. aktivita imobil. amyloglukosi- θ 15 0 dázy na nosičích ’ ’ /j/g vlhké hmoty/ /+/ Uvedeno v příkladu 12 /++/ Aktivita rozpustné a imobilizované amyloglukosidázy s rozpustným škrobem jako substrátem byla měřena podle GLUCOSE SIRUPE, NOVO Enzyme in der Starke- Industrie, Novo Ind., Gopenhagen, 1976.
Příklad 16
Organické mikroporézní nosiče typu SORFIX a SORSILEN a anorganický mikroporézní nosič typu SILOXID byly aktivovány způsobem uvedeným v příkladu 5, včetně složení a způsobu přípravy RRP,
- 24 234 059 způsob /a/. Tytéž nosiče byly aktivovány 15 hod. mícháním se 4 % /objem/objem/ vodným roztokem glutaraldehydu při teplotě. 3O°C, principiálně způsobem uvedeným v čs, autorském osvědčení č. 214 096, způsob /b/. Všechny 3 typy nosičů aktivované oběma popsanými způsoby byly separátně odsáty a každý ze 6 materiálů rozdělen na dva stejné hmotnostní díly /a 1 g/, celkem tedy na 12 stejných hmotnostních podílů. Šest podílů oběma způsoby aktivovaných částic bylo promyto 250 ml destilované vody, 1 M roztokem NaCl a opět vodou a dobře odsáty a smíchání s 10 ml vodného roztoku kvasničné invertázy o koncentraci bílkovin 11,5 mg/ml a aktivitě 86 j/ml a imobilizace enzymu probíhala 1 hod. mícháním a 2 hod. stáním při teplotě, místnosti. Zbývajících 6 hmotnostních podílů dobře odsátých avšak nepromytých, oběma způsoby aktivovaných částic /a; b/ bylo suspendováno 10 ml roztoku uvedeného enzymu o stejné aktivitě. a koncentraci bílkovin, přičemž imobilizace probíhala opět;
hod. mícháním a 2 hod. stáním popsaným způsobem.
Po uvedené době. bylo všech 12 vzorků zmobilizovaných materiálů dobře vakuově odsáto přes textilní materiál a promyto vždy 200 ml vody, 200 ml 1 M roztoku NaCl a opět vodou a materiály dobře vakuově odsáty. U získaných materiálů zmobilizovaného enzymu byla hodnocena specifická aktivita zmobilizované invertázy. Výsledky jsou shrnuty v následující tabulce.
| Typ. nosiče Poly-/2,6-dimethyl/- Polyethylen- Polymerní oxid | ||||
| fenyloxid /SORFIX/ | tereftalát /SORSILEN/ | křemičitý /SÍLOXID/ | ||
| Prům.distr. velikosti částic /mm/ | 0,5 až 1,0 | 0,5 až 1,2 | 0,2 až 0,5 | |
| Porosita částic /cm^/g/ | 0,459 | 2,14 | 0,048 | |
| Spec. povrch částic /m^/g/ | 400,0 | 56,0 | 62,0 | |
| Způsob aktivace nosičů | /a/ | /b/ | /a/ /b/ | /a./ /b/ |
| Promytí částic po aktivaci | + - | + — + | — -h — + | |
| /++/ Specifická aktivita imobil. | ||||
| invertázy na nosičích | 16,2 | 19,8 3,6 2,8 | 14,1 22,0 8,2 19,6 2,4 3,9 1/ | |
| /j/mg vlhké hmoty/ |
- 25 234 039 /a/ Předmětný způsob aktivace nosičů pomocí K2P /b/ Kontrolní způsob aktivace nosičů vycházející z čs. AO 214 0$6 /+/ Promytí odsátých částic nosičů po aktivaci /-/ Nepromytí odsátých částic nosičů po aktivaci /++/ Uvedeno v příkladu 5
Claims (4)
1. Způsob imobilizace mikrobiálních buněk, rostlinných buněk a enzymů, vyznačující se tím, že částice ve vodě nerozpustných organických polymerů, zejména na bázi polyethylentereftalátu, poly-/2,6-dimethyl/fenyloxidu, poly-6-kaprolaktamu, blokového kopolymeru poly-6-kaprolaktamu s polyethylenoxidem, kopolymeru vinylchloridu s vinylacetótem, polykondensótů melaminu s formaldehydem a močoviny s formaldehydem a anorganických polymerů, zejména na bázi polymerního oxidu křemičitého se zaktivují s chemicky reaktivními ve vodě rozpustnými polymery, které se připraví reakcí mezi ve vodě rozpustnými látkami obsahujícími nejméně 2 primární a/nebo sekundární aminoskupiny, zejména větveným polyethyleniminem o molekulové hmotnosti 50 000 až 1 000 00Q, popřípadě polylysihem o molekulové hmotnosti 1 000 až 50 000, lysinem nebo hexamethylendiaminém a bifunkčními aldehydy dikarboxylových kyselin, jako je například glutaraldehyd, načež se k aktivovaným částicím nerozpustných polymerních materiálů přidá vodná nebo pufrovanó vodné suspenze celých mikrobiálních nebo rostlinných enzymově aktivních buněk a/nebo vodný nebo pufrovaný vodný roztok enzymu, a vzniklý ímobilizovaný biokatalyzátor se separuje a promyje.
2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se k imobilizaci buněk a enzymů použije ve vodě nerozpustných částic organických a anorganických polymerů o velikosti 0,001 až 5 mm, specifickém povrchu od 1 do 700 m^/g a porositě částic od 0,01 do 2,5 cm^/g.
5. Způsob podle bodu 1 a 2,vyznačující se tím, že se aktivace ve vodě nerozpustných částic polymeru zejména na baZzi polyethylentereftalátu, poly-/2,6-dimethyl/fenyloxidu, blokového kopolymeru vinylchloridu s vinylacetátem a polymerního oxidu křemičitého provádí jejich smíšením s předem připravenými reaktivními rozpustnými polymery, které se připraví reakcí ve vodě rozpustných látek obsahujících nejméně dvě primární a/nebo sekundární aminoskupiny s bifunkčními aldehydy dikarboxy- 27 234 059 lových kyselin, načež se po odstranění přebytku roztoku reaktivních polymerů vystaví kontaktu s buněčnou suspenzí či roztokem enzymu.
4. Způsob podle bodu 1 až 2^ vyznačující se tím, že se částice polymerů na bázi poly-6-kaprolaktamu, blokového kopolymeru poly-6-kaprolaktamu s polyethylenoxidem a polykondenzátů melaminu s formaldehyděm a močoviny s formáldehydem uvádí do kontaktu s jednotlivými reakčními složkami reaktivních rozpustných polymerů postupně, přičemž v prvé fázi se částice uvedených polymerů vystaví kontaktu s roztokem polyethyleniminu, pólylysinu, lysinu nebo hexamethylendiaminu a po sorpci těchto látek a po odstranění přebytečného roztoku se tyto částice vystaví účinku bifunkčního aldehydu dikarboxylových ky-selih, například glutaraldehydu, načež se po vytvoření reaktivního polymeru na povrchu částic přebytečný roztok opět odstraní a uvedené aktivované polymemí částice se vystaví kontaktu s buněčnou suspenzí, či roztokem enzymu. ,
5o Způsob podle bodů 1 až 4/vyznačující se tím, že se imobilizují celé, neporušené, enzymově aktivní buňky mikroorganismů, zejména gramnegativní a grampozitivní bakterie, acidoresistentní bakterie, aktinomycety, kvasinky a další imperfektní houby, enzymově aktivní rostlinné buňky a enzymy mikrobiálního, rostlinného či živočišného původu.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS957382A CS234059B1 (cs) | 1982-12-22 | 1982-12-22 | Způsob imobilizace mikrobiálních buněk, rostlinných buněk a enzymů |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS957382A CS234059B1 (cs) | 1982-12-22 | 1982-12-22 | Způsob imobilizace mikrobiálních buněk, rostlinných buněk a enzymů |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS234059B1 true CS234059B1 (cs) | 1985-03-14 |
Family
ID=5445472
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS957382A CS234059B1 (cs) | 1982-12-22 | 1982-12-22 | Způsob imobilizace mikrobiálních buněk, rostlinných buněk a enzymů |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CS (1) | CS234059B1 (cs) |
-
1982
- 1982-12-22 CS CS957382A patent/CS234059B1/cs unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5300564A (en) | Doped sol-gel glasses for obtaining chemical interactions | |
| DK172669B1 (da) | Fremgangsmåde til fremstilling af et immobiliseret enzymkonjugat samt ved fremgangsmåden fremstillet, immobiliseret enzymko | |
| EP0104571B1 (en) | Immobilization of biocatalysts on granular carbon | |
| EP1042458A1 (en) | A process for immobilisation of enzymes | |
| US6582942B1 (en) | Immobilization of enzymes on particulate porous carriers for use in organic mediums | |
| US4337313A (en) | Immobilization of biocatalysts | |
| EP0641859A1 (en) | Method for preparing immobilized enzyme conjugates and immobilized enzyme conjugates prepared thereby | |
| JPS6321474B2 (cs) | ||
| Valentova et al. | Comparison of different methods of glucose oxidase immobilization | |
| JPS6133557B2 (cs) | ||
| SE423718B (sv) | Samtidigt immobiliserade enzym(er) och mikroorganism(er) och deras framstellning | |
| Orth et al. | Carrier‐Bound Biologically Active Substances and Their Applications | |
| Bahulekar et al. | Immobilization of penicillin G acylase on functionalized macroporous polymer beads | |
| Rosa et al. | A new application of humic substances: activation of supports for invertase immobilization | |
| EP0197784A1 (en) | Method for immobilizing a biological material | |
| RU2135582C1 (ru) | Фиксированный на носителе фермент и способ его получения | |
| CS234059B1 (cs) | Způsob imobilizace mikrobiálních buněk, rostlinných buněk a enzymů | |
| JPS6331538A (ja) | 固定化用担体 | |
| CN1059759A (zh) | 复合固定化酶的制备方法 | |
| CN110777133A (zh) | 一种溶菌酶的共交联固定化方法 | |
| Srinivasa Rao et al. | Immobilization of urease on gelatin—poly (HEMA) copolymer preparation and characterization | |
| EP0186347B1 (en) | Method for producing high-active biologically efficient compounds immobilized on a carrier | |
| Chen et al. | Improvement of cell lysis activity of immobilized lysozyme with reversibly soluble-insoluble polymer as carrier | |
| KR100509738B1 (ko) | 실리카겔 또는 복합실리카겔 담체를 이용한 효소의 고정화방법 | |
| Powell | Immobilized biocatalyst technology |