CS232604B1 - Sposob přípravy metabolitu s protinádorovými účinkami biotransformáciou withaferinu A - Google Patents

Description

232604

Vynález sa týká sposobu přípravy meta-biolitu inhibujúceho rast nádorov, ktorý sazíská biotransformácíou withaferinu A po-mocou mikroorganizmu Cunninghamella ele-gána (NRRL 1393).

Withaferin A je prírodná látka steroid-nej struktury, ktorá bola izolovaná z listovrasťlín Withania somnifera, popísaná Yardc-noun a Lavieun, J. Chem. Soc., 2925, 1962 az Acnistus arborescens, popísaná Kupchana spoluautormi v J. Amer. Chem. Soc. 07.5801, 1905. Withaferín A je účinný inhibitorrastu rastlinných a živočišných buniek, akoto popísal Shohat, Z. Krebsforsch, 80, 97,1973 a podlá Shohata a spoluautoroiv, Can-cer Lett. 2, 71, 1976, výrazné inhibuje rastnádorových buniek in vitro a in vivo. Nie-ktoré mikroorganizmy sú schopné biotrans-forniovať withaferin A přidaný do kultivač-néiho média na nové metabolity. J. P. Rosaz-za a spoluautoři, Steroids 31, 671, 1978, izo-lovali novým metabolit vznikajúci z withafe-rinu A pomocou Cuinninghamella elegans(NRRL 1393), ktorý identifikovali ako 14a--hydroxy withaferin A. Nový metabolit inhi-boval buňky sarkomu 180 a lymfoleukémieP 368 výrazné jši.e, ako povodný withaferinA. V predkladanom riešení je popísaný spó-sob přípravy metabolitu s protinádorovýmiúčLnkami. biotransformácíou withaferinu A,podl'a vynálezu, ktorého podstatou je, že sado tekutého média obsahujúceho zdroj uhlí- ka, organického dusíka a minerálně soli na-očkovaného kulturou vysšie uvedeného mik-roorganizmu přidá naraz alebo po častiach10 až 200 mg na 100 ml pody withaferinuA rozpuštěného' v polárnom rozpúšťadle, svýhodou v dimetylformaimide, pri teplote 26až 36 aC za stálého miešania a prevzdušňo-vania sa kultivuje 96 až 168 hodin. Ďalej safiltrát fermeníovanej pody extrahuje ester -mi kyseliny oetovej, s výhodou octanom e-tylnatým a získaný extrakt sa odpaří dosu-ctoa, přečistí na stípci silikagélu ,s použitímelučného činidla octanu etylnatého, eluátsa zahustí pri teplote do 40 °C a krystalizu-je sa pri teplote 4 °C. Postupovat sa móže ajtak, že sa extrahuje chlorovanými uhlovo-díkmi s počtom 1 až 5 uhlíkov, s výhodoudiehlĎrmetánom. Pevný metabolit sa výhod-né irekryštalizuje zo zmesi octanu etylna-tého a acetonu.

Metabolit s protinádorovými účinkumi při-pravený biotransformácíou withaferinu Apodlá vynálezu sa svojimi vlastnosíami od-lišuje od povodného withaferinu A, aj od14a-hydroxywithaferinu A, připraveného zněho biotransformácíou. Nový metabolit sazíská v množstve 15 až 28 °/o, vzhladoim kpoužitému withaferinu A. Spolu s uvedený-mi trorni látkami je vo filtráte po skonče-né] biotransformácli přítomná i ďalšia no-vá látka. Látky sa od seba inavzájom odli-šujú hodnotami Rf i farebnými reakciami,ako je vidief z tabulky 1.

Tabulka 1

Chromatografické stanovenie withaferinu A a jeho metabolitov Látka R{

Farebná reakcia

withaferin A 14-ia-hydroxy withaferin

nový metabolit I

nový metabolit II

Na delenie sa použila sústava octanu etyl-natého: aceton (4:2), detekčně činidlo p-anízal-dehyd, po postriekaní sa chiromatogramyzohriali na 120 °C. Všetky uvedené látkymožno detegovať tiež bioautodetekciou pripoužití Staphylococcus pyogenes aureus R50.

Metabolit podlá vynálezu v pokusech invitro inhibuje biochemické reakcie a :rastbuniek P 388 a v pokusoch iin vivo vykazu-je výraznejšiu imhibíciu rastu nádorov, akopovodný withaferin A. V koncentráciáchnižších ako 100 ,ug . mi-1 metabolit podlávynálezu inhiboval ra,st Staphylococcus pyo-genes aureus R 50, Bacillus aubtilis SDPC1 : 220, Bacillus megatherium, Sarcina fla-va, v koncentráciách do 100 ^g. ml-1 všakneinhiboval rast Escherichia coli, Caindidaalbicana Pu 10 a Pseudomonas aeruginosa.

Spdsob pirípravy metabolitu biotransformá- 0,410 0,170 0,280 0,750 starouužováhnědáfialová šedomodrá ciou withaferinu A a jeho izolácia sú uve-dené v 'príkladoch. Příklad 1

Do 20 varných baniek o objeme 500 mlpřipravilo sa po 100 ml média nasledujúce-ho zloženia: glukóza 2 g, kvasničný extrakt0,5 g, sójová muka 0,5 g, NaCl 0,5 g, ΚΗ2ΡΌ40,5 g a doliala sa destilovaná voda do 100 ml,pH upravilo na 7,0. Po sterilizácii počas 20minut pri 120 °C a ochladeiní sa médium na-očkovalo 15 ml vegetatívneho inokula Cun-ninghamella elegans (NRRL 1393) a kulti-vuje sa 72 hodin. Kultivovalo sa na rotač-nej trepačke pri 2'20 ot. . imln_i a pri teplo-te 28 °C. Po 24 hodin toultivácie sa přidalodo každej banky 50 mg withaferinu A roz-puštěného v 0,5 ml idimetylformamidu. Kul-tivácia pokračovala do 120 hodiiny. Filtrátpo kultivácii obsahuje stopy withaferinu A, 232G04 14a-hydroxywithaferinu A a metabilia podlávynálezu v množstve 20 mg. 100 ml"1 do-teraz inestanovenej štruktúry. Příklad 2

Do 500 ml varných baniek sa naplní po100 ml médiu zloženia ako je uvedené vpříklade 1. Toto sa po sterilizácii počas 20minút pri 120 °C ochladí a naočkuje 15 mlvegetatívneho inokula Cuinninghamella ele-gans (NRRL 1393). Po 24 hodinách kultivá-ci© na rotačnej trepačke při 220 ot. . min'1a teplete 28 °'C sa do každej banky přidá25 mg withaferinu A rozpustného v 0,25 mldimetylformamidu a po 72 hodinách kulti-vácie sa přidá opat 25 mg withaferinu Arozpuštěného v dimetylfoirmamide. Kultivá-cia sa ukončila po 144 hodině. Filtrát mé-dia obsahoval okrem nebiotransfarmovamé-ho withaferinu A, tiež 14a-hydroxywithafe-rin a metabolit I (viz v tabuíke 1) v kon-centrácii 23 mg . ml"1. Příklad 3

Do fermentačného tanku o objeme 20 lit-rov z nerezovej ocele, opatřeného miešad-lom a vzdušniacim zariadením sa připraví10 litrov média nasledujúceho zloženia: glu-kóza 200 g, kivasničný extrakt 50 g, sójovámúka 50 g, NaCl 50 g, ΚΉ2ΡΟ4 50 g, sójovýolej 10 iml, vodovodiná voda 10 1, hodnota pH7,0. Po sterilizácii počas 30 min piri 120 °Csa ochladeiné médium naočkovalo 15 % ve-getatívneho inokula mikroorganizmu Cun-niinghamella elegans (PRRL 1393). Po 24 ho-dinovej kultivácii pri 28 °C za neustáléhomiešania pri 200 otáčkách miešadla . min-1a vzdušnenia, tak, aby na objem média bolprivádzaný objem vzduchu sa do kultivač-ného média přidalo 2,5 g withaferinu A roz-puštěného v 25 ml dimetylformamidu. Kul-tivácia bola ukončená po 96 hodinách. Filt-rát obsahoval stopy withaferinu A a novýmetabolit I v koncentrácii 15 mg. 100 ml"1. Příklad 4

Obsah 20 baniek po skončenej kultivácii,ako je uvedené v příkladu 1, sa spojí a my-célium sa oddělí filťrácíou. Filtračný koláčsa na filtri premyje 50 ml destilovamej vo-dy. Získaný filtrát 1450 ml včítane 50 mlpremývacej vody 50 ml sa premieša a pH 3 sa upraví na hodnotu_7,0 prídavkom kyseli-ny chlórovodíkovej. Daleij sa přidá 700 mloctanu etylnatého a filtrát sa za neustále-j ho miešania extrahuje 20 až 40 min. Oddě-lená vrstva rozpúšťadla sa odpustí a ostá-vajúci filtrát sa rovnakým postupom extra-huje ešte trikrát po sede octanom etylna-tým v objemovom pomere 1: 2. Získané ex-trakty sa spoja, prídavkom bezvodého síra-nu sodného vysušia a za zníženého tlaku priteplote do 45 °C sa rozpúšťadlo odpaří. Zís-ká sa 985 mg surového produktu, ktorý sa přečistí na štipci silikageiu 125 až 180 ok,kolona 4 X 36 cm. Ako elučné činidlo sapoužije zmes rozpúšíadiel octan etylnatý:: aceton (4:1). Na základe analýzy na ten-kej vrstvě sa zachytené frakcie po 25 mlspoja a znova odparia do sucha. Spojenímfrakcií 1 až 11 sa získá ostávajúci 159 mgwithaferinu A a z frakcií 20 až 40 sa získá198 mg nového metabolitu. Konverzia, vzhle-dem na použité množstvo withaferinu A, je 23,5 %. Příklad 5 189 mg surového, přečištěného metabofi-tu získaného postupom uvedeným v příkla-de 4 sa rekryštalizuje z .horúcich iroztokovoctanu etylnatého, připadne zo zmesi octanetylnatý: aceton (1:1). Získá sa 160 mgčistej kiryštalickej látky, bielej farby s t. t.118 až 120 °C (bez korekcie). Výsledky'ele-mentárnej analýzy látky sú následovně: C 66,09 %, H 7,95 %, O 16,03 %.

Infračervené spektrum merané v roztokuCDCb vykazovalo max. pri: .920, 962, 1005, 1018, 1032, 1058, 1129, 1139, 1185, 1317, 1264, 1392, 1449, 1455, 1682, 1688, 2875, 2932, 2958, 3460, 3570 cm"1. iH-NMR spektrá bolí merané pri 99,54 MHzs použitím Fourierovej transformácie pri21QC v CDCb za použitia tetrametylsilámu,ako vnútorného standardu. Chemické posu-ny sú uvedené v ppm, vzhíadoim k MeaSi.Priemerná šířka spektra 200 Hz, čas jedno-tlivých impulzov 2 s, počet akumulácií 16,počet bodov 8192, šířka trubice 10 mm. ViH-NMR spektre vykazuje izolovaný meta-bolit nasledujúce chemické posuny: 0,715 s (I8-CH3); 1,12 d (I = 6,35 Hz); 1,255 s; 1,411 s (19-CH3); 2,009 s; 2,034 s (28-CH3); 3,77 d (J = 5,86 Hz); 4,363 s (H-27); 6,198 d (J = 10,25 Hz, H-2); 6,963 dd (Ji = 9,77 Hz, J2 = 5,37 Hz, H-3). 13C-NMR spektra boli merané pri 25,00 MHzza použitia Fourierovej trainsformácie pri21 °C v CDCb pri použití tetrametylsilánuako vnútorného· standardu. Chemické posu-ny sú uvedené v ppm, vzhíadom k MeáSi.Priemerná šířka spektra 6000 Hz, počet aku-mulácií 40 000, počet bodov 8192, šířka tru-bice 10 mm. V 13C-NMR spektra (Cze): 7,488; 14,620; 17,375; 20,088; 23,460; 26,912;28,667; 29,661; 30,714; 31,885; 32,821; 37,852;43,000; 47,330; 47,662; 52,595; 54,292; 57,334;

Claims (3)

1. 232604 62,658; 63,71,1; 69,620; 79,390; 125,809;132,0-45; 142,458; 153,106; 167,089; 202,192. Hmotové spektrum bolo namerané pri e-nergii elektronu 70 ©V a teplote 130 °C. Vhmotovom spektre vykazuje metabolit na-sledujúcu fragmentáciu (mje; relativná in-tenzita, (!%): 279 (9), 24(4 (16), 170 (12), 167 (17), 156 (14), 155 (12), 154 (92), 153 (15), 149 (40), 126 (9), 125 (38), 124 (11), 120 (9), 113 (12), 112 (10), 101 (18l), 98 (14), 97 (13), 96 (9), 95 (12), 91 (18), 86 (29), 85 (13), 84 (9), 83 (18), 81 (10), 78 (10), 77 (18), 73 (11), 72 (16), 71 (27), 70 (7), 69 (31), 68 (13), 67 (11), 61 (8), 60 (15), 59 (42), 58 (19), 57 (39), 56 (23), 55 (32), 45 (12), 44 ( 77), 43 (100), 42 ( 21), 41 (54), 40 (9), 39 (23), 31 (13), 30 (13), 29 (27). V hmotovom spektre pre vyššie m/e ako280 mebola už fragmentácia korektná. Me-raná látka nedávala molekulový ión. P r í k 1 -a d 6 Postup izolácie bol rovnaký ako je uve-dené v příklade 4, avšak ako extrafcčné či-nidlo sa použil dichlórmetán. PREDMET

   1. Spůsob přípravy metabolitu s protiiná-dorovými účinkami biotransformáciou wi-thaferinu A pomocou mikroorganizmu Cun-ninghamella elegans NRRL 1393, vyznačenýtým, že do tekutého média obsahujúcehozdroj uhlíka, organického dusíka a .mine-rálně soli sa naočkuje kultúra vyššie uve-deného mikroorganizmu, přidá naraz alebopo častiach 10 až 200 mg na 100 ml půdywithaferinu A rozpuštěného v polárnom roz-púšíadle, s výhodou v dimetylformamide,pri teplote 26 až 36 °C za stálého miešaniaa prevzdušovania sa kultivuje 96 až 168 ho-din, dalej sa filtrát fermeintovanej půdy ex- VYNALEZU trahuje estermi kyseliny octovej, s výhodouoctanom etylnatým, a extrakt sa odpaří do-sucha, přečistí na stípci silikagélu s použi-tím elučného činidla octanu etylnatého, eluátsa zahustí pri teplote 40- qC a krystalizuje sapri teplote 4 °C.
2. 2. Sposo-b podlá bodu 1, vyznačený tým,že sa filtrát fenmentovanej půdy extrahujechlorovanými uhlovo-díkmi s 1 až 5 atóma-mi uhlíka, s výhodou -dichlórmetánom.
3. 3. Spůs-o-b podlá bodov 1 a 2, vyznačenýtýim, že pevný metabolit sa rekryštalizuje,-s výhodou zo zmesi octanu etylnatého a ace-tonu. Savtrografia, n. p„ závod 7, Most Cena 2,40 Kčs