CS230757B1 - Sposob pestovania buniek in vitro na celulózových mikronosičocb - Google Patents

Description

1 230 757

Vynález sa týká spósobu pestovania buniek in vitro na mikro-nosičoch aminoderivátov celulózy.

Metoda pestovania buňkových kultúr sa používá jednak pri stá-diu základných otázok v biologicko-lekárskych a veterinárnych obo-roch ako sú napr. diagnostika virusových ochorení 1’udí a zvierat,ako aj pri priemyselnej výrobě roznych biologicky aktívnych látok,ako sú napr. ludské a zvieracie virusové vakcíny, interferóny,hor-mony, enzýmy, nukleové kyseliny a iné.

Pri priemyselnej príprave biologicko aktívnych látok je potřebnénapestovať obyčajne velké množstvo buňkového substrátu. K týmto"účelom boli vypracované rožne laboratorně techniky pestovania bu-niek (kultivácia buniek v suspenzii ; pestovanie buniek rolerovoutechnikou; pestovanie buniek stacionárně na povrchu kultivačnýchnádob) ako aj zariadenia pre velkokapacitné pestovanie buniek.Wajefektívnejšia technika velkokapacitného pestovania buniek invitro je rast buniek v suspenzii. Týmto sposobom vo vhodných za-riadenia ch je možné získat viac ako tisíc litrov buňkovéj suspen-zie. Všetky buňkové kultury však nie je možné adaptovat na pesto-vanie v suspenzii. Na tento sposob pestovania je možné adaptovatnapr. buňky 1 (stabilná buňková línia myších fibroblastov), buň-ky Hela (1’udské buňky karcinomu krčka maternice), buňky BHK (sta-bilná buňková línia z obličiek sýrskeho škrečka) a Salšie. Vačši-nou sa jedná o buňkové kultury so změněnou sadou chromozómov, kto-ré často pri injekčnej aplikácii sppsobujú u experimentálnych zvie-rat nádory. 2 230 7S7

Kiektoré buňkové kultúry nie je možné adaptovat na rastv suspenzii, lebo potrebujú k svojmu deleniu vhodný kultivačnýpovrchy na ktorý sa prichytia a vytvárajd tu bunkovú jednovrstvu.Vačšinou sa jedná o primárné buňky získané z orgánov, tkaniv,alebo celých embryí róznych živočíchov (napr. primárné kuracieembryonálně buňky; primárné embryonálně myšie buňky) a diploidnébuňky, ktoré majú diploidný počet chromozómov, napr. buňky LEP(diploidné buňky získané z plúc ludského embrya) a Salšie. Tietobuňkové kultury sa velkokapacitně pestujú stacionámou technikouvo velkých skleněných kultivacných nádobách (napr. Roux flaše1 200 ml a 2, 0Q0 ml) a niektoré je možné pěstovat vo válcovitýchnádobách na ktorých sa buňková jednovrstvá vytvára po celej cylindrickej ploché horizontálně sa otáčajdcej válcovitéj nádoby (ro-lerova technika)^ van Wetzel£ Nátuře 216, str. 64-65»(1967 )Jako prvý použil pre rast primárných a diploidných buniek mikrono-sioe DSAE Sephadexu A 50. Princípom pestova- nia buniek na mikronosičoch je rast a vytváranie buňkovéj jedno-vrstvý na mikroguličkách, ktoré sa obvykle miešajú v kultivaenommédiu v špeciálnych suspenzných flašiach alebo fermentoróch. Priemer mikroguličiek sa vačšinou pohybuje od 100 až . Výhodou

tohto sposobu pestovania je to, že mikroguličky na ktorých sa

ké množstvo buniek v malom objeme kultivačného média. (3 mg mi- 1 ml média má plochu kronosičov Cytodex 1 30 cm^ ; 1 ; 1 g mikronosičov Cytodex 1 v 1 000 ml kultivačného média má plochu ako 327 Petři misiek o priemere 10 cm, alebo ako 21 ro-lerových kultivacných nádob 1 000 ml).

Pri pěstovaní buniek na mikronosičoch v suspenzii sa získá 2 až4 krát váčšie množstvo buniek ako pri pěstovaní buniek stacionár-nou technikou. Pestovanie buniek »a mikronosičoch znižuje prac-nost pri velkokapacitnom pěstovaní buniek, nároky na přípravusterilného kultivačného skla, nároky na médium, a tiež znižujemožnosti kontaminácie buniek. N.A. de Bruyne, B.J. Morgan^Amer.Lab. 35, 251 (1981 )J7 uvádzajú súčasných výrobcov mikronosičov. 3 230 7S7 Výrobce Krajina Piremné označenie Zloženie Priemer mikronosičov yUm Bio-Rad USA Bio-Carriers polyaÁrylamid 120 - 180 Plow Labs USA Superbead DEAE-Sephadex(diety lamino- etyl-dextran) 135 - 205 Lux USA Cytospere modifikovaný polystyrén 160 - 230 NUNC Dánsko Biosilon modifikovaný polystyrén 160 - 300 Pharmácia Švédsko Cytodex modifikovaný Sephadex (dietylamino- etyl-dextran) 160 - 230

Ceny uvádzaných komerčných mikronosičov sú velmi vysoké^ čo je ich hlavná nevýhoda, ktorá obmedzuje ich širšie priemyselné aplikácie. Tieto nedostat-ky odstraňuje pestovanie buniek podlá vynálezů.

Podstata vynálezu spočívá v tom, že ako mikronosiče pre pes-tovanie buniek sa používá, guličková forma aminoderivátov celuló-zy typu dietylaminoetylcelulózy, alebo dietylamino-2-hydroxypro-pylcelulózy alebo trimetylamónium-2-hydroxypropyl_j3elulózy s vý-měnnou kapacitou 0,3 až 1,5 mekv/g s velkostou častíc 70 až 300

Mikroguličky aminoderivátov celulóz připravené podlá A.O. č. 212 131 sa premývajú cez nerezové šito z polyamidovéj tkaniny ovelkosti pórov 70 až 350 nm. Takto sa získá frakcia mikroguličieko velkosti 70 až 350y«m. / sklenenej posilikónovanej nádobě safrakcia premyje fosfátmi pufrovaným roztokom podlá R. Dulbecca(Proč· Nat. Acad. Sci· 3θ> 747, 1952) - roztok PBS-A v množstve100 až 300 ml/g mikroguličiek. Po sedimentácii mikroguličiek nadno nádoby sa roztok odsaje a opatovne sa přidá roztok PBS-Av množstve 30 až 50 ml/g mikroguličiek. Potom sa mikroguličky ste-rilizujú autoklávovaním pri 120 °C po dobu 20 minút. Před použi-tím mikroguličiek na pestovanie buniek sa roztok PBS-A odsajea přidá sa kultivačně médium zohriate na teplotu 37 °C v množstve 4 230 757 30 až 50 ml/g raikroguličiek.x Mikroguličky sa v kultivačnom médiupremiešajú a nechajd sa usadiť na dno nádoby. Kultivačně médiumsa odsaje a opátovne sa přidá rovnaké kultivačně médium v množstve10 až 20 ml/g mikroguličiek. Takto připravené sterilně mikrogulič-ky sa použijá na pestovanie buniek suspenznou technikou, rolero-vou technikou, alebo na pestovanie buniek na mikronosičoch v ko-loně, kde mikroguličky sú vo vznose perfúziou kultivačného médiaalebo plynu, obvykle 95 % vzduchu a 5 % oxidu uhličitého.

Buňkové kultury sa pěstujú na mikronosičoch aminoderivátov celu-lpzy v kultivačných médiách pozostávajácich z anorganických solí,aminokyselin, vitamínov, koenzýmov ako napr. bazálne Eaglovo mé-dium, minimálně esenciálně Eaglovo médium, médium RPMI 1640, mé-dium CMRL 1969, médium 1999, médium Leibovitz 15, médium NTC 109a Salšie. Médium sa doplňuje živočišnými sérami ako napr. telacíminaktivovaným sérom, fetálnym bovinným sérom, kuřecím sérom a pod.v koncentrácii 1 až 20 %. V niektorých prípadoch sa dopíňajú médiábielkovinnými hydrolyzátmi ako napr. laktálbumínhydrolyzát, sojo-vý peptón, kvasničný autolyzát a Salšie. Kultivačně médiá majúoptimálně pH v rozmedzí 7,0 až 7,6,osmomolalitu 260 až 350 mOsm/kg.Teplota pri kultivácii kultur na mikronosičoch aminoderivátov ce-lulóz sa pohybuje v rozmedzí 35 až 40 °C, podl’a druhu buňkovýchkultur. V niektorých prípadoch sa používá atmosféra 95 % vzduchua 5 % oxidu uhličitého. Příklad 1

Do suspenznej flaše s magnetickým miešadlom o objeme 500 mlsa přidá 150 ml Bazálneho Eaglovho média s 10 %hmotnostnými trap-tózu fosfátového bujónu a s 10 % hmotnostnými inaktivováného te-lacieho séra a 5 g mikronosiča guličkovej dietylaminoetylceluló-zy o velkosti častíc 70 až 300 zwi a s výměnnou kapacitou 0,3 mekv/g.

A f Q

Potom sa inokuluje 1x10^ až 4x10 buniek. Suspenzia buniek a mikro-nosičov v kultivačnom médiu sa mieša magnetickým miešadlom (rých-losť otáčok 20/minútu) po dobu 2 minuty. Po tomto čase sa miešadlozastaví. V nasledujúcich 4 hodinách sa každá hodinu nechá miešaťsuspenziou buniek a mikronosičov po dobu 2 minut rovnakými otáč-kami. Po štyroch hodinách sa přidá do kultivačnej nádoby 350 ml 230 757 kultivačného média a Sálej sa uvedie miešadlo do pohybu rýchlosťouotáčok 50/minútu. Třetí deň kultivácie sa vymění 1/3 objemu kul-tivačného média. Po vytvoření bunkovej jednovrstvý (t.j. 5. až 7.den) sa buňky z mikronosičov uvolnia 0,25 %-ným roztokom trypsinua spočítájú sa v Burkerovej komorke. Příklad 2

Pri použití rolerovej techniky pestovania buniek na mikrono-sičoch sa do valcovitej nádoby o objeme 2 000 ml přidá kultivačnémédium v množstve 200 až 500 ml a mikronosiča dietylamino-2-hydro-xypropylcelulózy o výmennej kapacitě 1,5 mekv/g v množstve 0,5 až20 g/ml média. Potom sa inokuluje buňková kultura v množstve 1x10^až 8x10^ buniek/ml média. Po dobu piatich hodin sa nechá válcovi-tá nádoba otáčat v horizontálněj polohe v roleri rýchlosťou 0,5až 8 otáčok za hodinu. Po tomto.čase dojde k prichyteniu buniekna mikronosič. Potom sa nechá válcovitá nádoba Sálej otáčat v ro-leri až do vytvorenia bunkovej jodnovrstvy na kultivačnom povrchunádoby a mikronosičoch. Buňky z kultivačnej nádoby a z mikronosi-čov je možné priamo infikovat vírusom, připadne ich použit na pří-pravu iných biologicko aktívnych látok. V případe potřeby je mož-né počas dlhodobej kultivácie vymieňat kultivačné médium. Příklad 3

Postup podlá příkladu 1 s tým rozdielom, že ako mikronosičsa použije guličková dietylamino-2-hydroxypropylcelulóza s výměn-nou kapacitou 1,0 mekv/g a velkosťou častíc 70 až 250 m. Příklad 4

Postup podlá příkladu 2 s tým rozdielom, že ako aminoderivátcelulózy sa použije guličková trietylamónium-2-hydroxypropylcelu-lóza o výmennej kapacitě 0,9 mekv/g a s velkostou častíc 70 až250 Um. 6 230 7S7

Vynález má využitie všade kde sa pestujú laboratorně alebopriemyslovo živočišné buňky či už pre diagnostické účely alebopre účely priemyslovej výroby roznych biologicky aktívnych látokako sú ludské a zvieracie virusové vakcíny, interferóny, hormony,enzymy, nukleové kyseliny a iné.

Claims (1)

1. 7 PREDMET VYNALEZU 230 737 Sposob pestovania buniék in vitro na celulózovýcb mikronosičochvo formě mikroguličiek, vyzná čený tým, že ako mikrono-sič sa používá aminoderivátov celulózy typu dietylaminoetylcelulózy alebo dietyamíno-2-hydroxypropylcelulózy alebo trimetylamónium-2-hydroxypropylcelulózy s výměnnou kapacitou 0,3 až 1 ,5mekv/g a velkosfou častíc 70 až 300 t·