CS230315B1 - Analogy vasopresinu a způsob jejich výroby - Google Patents

Abstract

Vynález se týká analogů vasopresinu chemického vzorce 2 Cys—Tyr—Phe—Gin—Asn—Cys—Pro— (I) kde X značí D-arginin nebo ornithin a způsobu jejich výroby. Tyto analogy vasopresinu, mající v poloze 8 nebílkovinnou bazickou aminokyselinu a ve srovnání s přírodním hormonem odstraněný glycinamidový zbytek z poloh]/ 9, zachovávají si účinek na centrální nervový systém při velmi nízké endokrinní aktivitě. Podstata způsobu výroby těchto analogů spočívá v tom, že lineární peptidy chemického vzorce II Η H Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro- (II) kde X má stejný význam jako uvedeno výše, se oxidují za vzniku disulfidové vazby.

Description

(54) Analogy vasopresinu a způsob jejich výroby

Vynález se týká analogů vasopresinu chemického vzorce

Cys—Tyr—Phe—Gin—Asn—Cys—Pro— (I) kde

X značí D-arginin nebo ornithin a způsobu jejich výroby.

Tyto analogy vasopresinu, mající v poloze 8 nebílkovinnou bazickou aminokyselinu a ve srovnání s přírodním hormonem odstraněný glycinamidový zbytek z poloh]/ 9, zachovávají si účinek na centrální nervový systém při velmi nízké endokrinní aktivitě.

Podstata způsobu výroby těchto analogů spočívá v tom, že lineární peptidy chemického vzorce II

Η H

Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro- (II) kde

X má stejný význam jako uvedeno výše, se oxidují za vzniku disulfidové vazby.

230313

Předmětem vynálezu jsou analogy vasopresinu s nebílkovinnou bazickou aminokyselinou v poloze 8 a s odstraněným glycinamidovým zbytkem v poloze 9 a způsob jejich výroby. Jedná se o látky, které mají významné účinky na centrální nervový systém.

Je známo, že neurohypofysární hormony a některé jejich analogy ovlivňují paměť, spánek a učení u pokusných zvířat. Je ovšem nutné, aby používané látky neměly endokrinní aktivity přírodních hormonů, které zejména u látek typu vasopresinu (antidiuretická a presorické aktivita) jsou vysoce nežádoucí (srovnej čs. autorské osvědčení číslo 217 633).

Nyní bylo zjištěno·, že vhodné disociace aktivit je možno dosáhnout zavedením nebílkovinné, bazické aminokyseliny do polohy 8 molekuly vasopresinu, při současném odstranění glycinamidového zbytku z polohy 9.

Podstatou vynálezu jsou analogy vasopresinu, mající obecný vzorec I kde všechny aminokyseliny jsou L-řady a

X značí D-arginin nebo· ornithim (nebílkovinnou, bazickou aminokyselinu L nebo D řady).

Podstatou způsobu výroby nových analogů vasopresinu vzorce I podle vynálezu je, že lineární peptid vzorce II

Η H

Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro- (II) kde

X má stejný význam jako uvedeno výše, se oxiduje za vzniku disulfldové vazby známým způsobem.

Některé endokrinní biologické účinky jsou uvedeny v tabulce 1.

Cys—Tyr—Phe—Gin—Asn—Cys—Pro— (I)

TABULKA 1

Látka Biologická aktivita ^a

	Uterotonická Galaktogogická	Presorické	Antidiuretická
			anesthetizo-	neanestheti-
			váná	zovaná
			krysa	krysa
I, X = D-Arg	0,07 0,12	< 0,2	4,5	0,004 b
I, X = Orn	0,09 0,02	< 0,2	0,29	0,001b

^a Stanovená na krysách a vyjádřená v mezinárodních jednotkách na 1 mg; ^b vyjádřeno jako % účinku [8-D-arginin]deamino-vasopresinu (DDAVP) na hladině prahové účinnosti.

Připravené analogy byly zkoušeny v· testu pasivní obranné reakce, tzv. pasivním vyhýbání, v němž byly prokázány příznivé účinky přírodního; vasopresinu na paměťové procesy. Podstata testu spočívá v tom, že se krysy vyhýbají prostoru, v němž obdržely mírný elektrický šok do tlapek. Hodnotí se časová délka tohoto; vyhýbání. Jestliže podaná látka prodlouží tuto reakci, je možno interpretovat účinek jako posílení paměťové stopy související s toto experimentální situací. Látky byly podávány v dávce 5 ug. . kg”¹ podkožně bud okamžitě potom, co zvířata obdržela šok do tlapek, nebo 20 hodin před testem retence vyhýbavé reakce. Okolnost, že se účinek projevil ještě za 20 hodin po aplikaci, svědčí pro· dlouhodobý účinek analogů, který je v tomto ohledu velmi žádoucí.

Způsob výroby analogů vasopresinu se dále objasňuje v příkladech provedení. Metody použité v příkladech provedení:

Analýzy· aminokyselin byly prováděny na automatickém dvoukolonovém přístroji (Vývojové dílny, Československá akademie věd, typ 6020). Vzorky peptidů byly hydrolyzovány 20 hodin v 6M-HCL při 105 ^qC ve vakuu 160 Pa. Chromatograf ie v tenké vrstvě byla prováděna na silikagelových deskách (Silufol, Kavalier) v systémech:

Sl: 2-butanol — 98 % HCOOH — HaO (75 : 13,5 : 11,5),

S2: 2-butanol — 25 % NHOH — HzO (85 : 7,5 : 7,5),

S3: 1-butanol — CHsCOOH — H2O (40 : 10 : 10),

S4: 1-butanol — CH3COOH — pyridin — — H2O (15 : 3 : 10:6),

S13: 1-butanol — CH3COOH — H2O (50 :15 : 40),

S23: ethylacetát — pyridin — CHsCOOH — — H2O (5:5:1: 3).

Elektronická analýza byla prováděna na papíru Whatman 3MM ve vlhké komůrce při potenciálovém spádu 20 V/cm. Látky byly detekovány ninhydrinem nebo chlorační metodou.

Příklad 1

Benzylester N-benzyloxykarbonyl-S- (2,4,6-trimethylbenzyl) cysteinyl-tyrosýl-f enylalanyl-glutaminyl-asparaginyl-S- (2,4,6-trimethylbenzyl) cysteiny 1-proly l-N⁵-benzyloxykarbonylornithinu

K roztoku hydrazidu N-benzyloxykarbonyl-S-(2,4,6-trimethylbenzyl )cysteinyl-tyrosyl-fenylalanyl-glutamlnyl-asparaginyl-S-(2,4,6-trimethylbenzyl)cysteinu (238 mg) v dimethylformamidu (2 ml) byl za míchání přidán 3M-HC1 v dioxanu (130 μΐ), roztok byl ochlazen na — 20 °C a byl k němu přidán butylnitrit (21 mg) v dimethylformamidu (0,5 ml). Reakčni směs byla míchána 20 minut, ochlazena na —40 °C, neutralizována N-ethylpiperidinem (pH 7, vlhký pH-papírek) a byl k ní přidán roztok připravený následujícím způsobem:

Benzylester o-nitrobenzensulfenylprolyl-N5-benzyloxykarbonylornithinu (182ml) byl rozpuštěn v dimethylformamidu (lml)ak roztoku byla přidána 3M-HC1 v etheru (0,5 ml). Po 5 min. byla reakčni směs zředěna etherem, vyloučená sraženina byla izolována dekantací a promyta etherem. Získaný hydrochlorid byl rozpuštěn v dimethylformamidu (2 ml), pH roztoku bylo upraveno N-ethylpiperidinem na hodnotu 10 a takto získaný roztok byl přidán k roztoku azidu, jehož příprava je popsána výše. Reakčni směs byla po 60 hodinách při 0°C odpařena, odparek byl rozetřen postupně s 0,5M-HC1, vodou, nasyceným roztokem NaHCCb a opět vodou. Produkt byl čištěn krystalizací ze směsi dimethylformamid — voda a gelovou filtrací v dimethylformamidu. Bylo získáno 300 mg (93 %) produktu o t. t. 238 až 240°C, [ia]_D —27,6° (c 0,15, dimethylformamid). R_f 0,86, (Sl), 0,67 (S2), 0,82 (S3), 0,91 (S4).

Pro C86H103N11O16S2.2H2O (1617) vypočteno:

63,88 % C, 6,67 %- H, 9,53 % N, 3,97 % S; nalezeno:

64,00 % C, 6,38 % H, 9,57 % N, 3,95 % S.

Výše popsaný chráněný oktapeptid (100 miligramů) byl rozpuštěn v kyselině trifluoroctové (1,25 ml), k roztoku byl přidán thioanisol (100 μΐ) a roztok byl ochlazen na 0 °C. K reakčni směsi byla přidána kyselina trifluormethansulfoinová (1 ml) ochlazená na stejnou teplotu. Po 30 minutách při 0 ^CC byla směs zředěna etherem, vyloučená sraženina byla odfiltrována a odfiltrovaný podíl byl rozpuštěn ve vodě (300 mlj.pH roztoku bylo upraveno 0,lH-NaOH na hodnotu 6,8 a reakčni směs byla oxidována vzdušným kyslíkem jednu hodinu. pH bylo upraveno kyselinou octovou na hodnotu 3,9 a roztok byl filtrován přes sloupec slabě bazického iontoměniče v acetátovém cyklu. Efluenty byly lyofilizovány (89 mg) a lyofilizát rozpuštěn v 50% vodné kyselině octové a produkt byl čištěn gelovou filtrací. Bylo získáno 15,3 mg (24 % j látky o [a]D — —15,1° (c 0,2, 1M kyselina octová); E24^GIy 0,89, E57^His 0,34; R_F 0,37 (S4), 0,43 (SÍ3), 0,89 (S23).

Analýza aminokyselin:

Phe 1,01, Tyr 0,92, Glu 1,00, Asp 1,00, Pro 1,03, Orm 0,99. Množství cystinu bylo stanoveno v separátním vzorku po oxidaci kyselinou permravenčí a byl stanoven jako kyselina cysteová: 1,92.

Pro C45H59NÍ1O12S2.2 CH3CO2H . 2 H2O (1142) vypočteno:

49,42 % C, 6,26 % H, 13,48 % N;

nalezeno:

49,18 % C, 5,95 % H, 13,30 % N.

Příklad 2

Benzylester N-benzyloxykarbonyl-S- (2,4,6-trimethýlbenzyl) cystein yl-tyrosyl-f enylalanyl-glutaminyl-aspar aginyl-S- (2,4,6-trimethylbenzyl ) cysteiny 1-pr opyl-N^G-p-toluensulfonyl-D-argininu

Roztok azidu chráněného hexapeptidu byl připraven stejným způsobem jako je popsáno v příkladu 1.

Benzylester o-nitrobenzensulfenylprolyl-N^G-p-toluensulfonyl-D-argininu byl připraven podle čs. autorského osvědčení číslo 217 633. K roztoku této látky (200 mg) v dimethylformamidu (1 ml) byl přidán 2 M-HC1 v etheru (0,5 ml). Po 5 minutách při teplotě místnosti byla reakčni směs zředěna etherem, vyloučený hydrochlorid byl odsát, promyt etherem, rozpuštěn v dimethylformamidu (2 ml) a pH roztoku bylo upraveno N-ethýlpiperidinem na hodnotu 10. Tento roztok byl přidán k roztoku azidu a reakčni směs ponechána 60 hodin při 0 °C. Dimethylformamid byl odpařen, odparek byl zpraco[ 8-Ornithin, 9-desglycinamid ] vasopresin ván a čištěn stejným způsobem jako je uvedeno v příkladu 1. Bílo získáno 310 mg (93 procent) produktu a t. t. 230 až 232 °C, [.a]_D —28,6° (c Ó,5, dimethylformamid). R, 0,94 (Sl), 0,75 (S2), 0,90 (S3), 0,96 (S4). Pro C8SH105N13O16S3 . H2O (1961) vypočteno:

61,08 % C, 6,26 °/o H, 10,77 % N, 5,69 % S; nalezeno *

60,89 % C, 6,23 % H, 10,57 % N, 5,42 % S.

[8-D-Arginin, 9-desglycinamid] vasopresin

Z výše popsaného chráněného oktapeptidu (100 mg) byly chránící skupiny odštěpeny a oxidace provedena stejným způsobem jako popsáno v příkladu 1. Obdobně bylo též provedeno odsolení a gelová filtrace. Bylo získáno 14 mg (23 %) produktu o [ia]_D — —17,7° (c 0,27, 1M kyselina octová); E₂ ?^Iis 0,56, E57^His 0,32; RF 0,34 (S4), 0,42 (S13), 0.91 (S23).

Aminokyselinová analýza:

Phe 1,02, Tyr 0,91, Asp 1,02, Glu 1,04, Pro

1,02, Arg 1,00; Cys (O3H) 1,92 (hodnota pro cysteovou kyselinu byla získána v separátním vzorku po oxidací kyselinou permravenčí).

Pro C41H6iN13O12S2.2CH3CO2H.2H2O (1124) vypočteno:

49,14 % C, 6,19 % H, 16,20 % N; nalezeno:

49,02 θ/o C, 5,98 % H, 15,94 % N.

Claims (2)

1. předmEt

   1. Analogy vasopresinu obecného vzorce I

   Cys—Tyr—Phe—Gin—Asn—Cys—Pro— (I) kde všechny aminokyseliny jsou L-řady a X značí D-arginin nebo ornithin.

   vynalezu
2. 2. Způsob výroby nových analogů vasopresinu obecného vzorce I, vyznačený tím, že lineární peptid vzorce II

   Η H

   I I

   Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro- (II) kde X má stejný význam jak uvedeno výše, se oxiduje za vzniku disulfidové vazby.