CS228215B1 - Způsob přípravy reaktivních hydrofilních latexových částic s fluorescenční značkou - Google Patents

Description

Vynález se týká způsobu přípravy reaktivních hydrofilních latexovýxh ěástic s fluorescenční značkou jednoduchou a nenáročnou metodou, částice obsahující zabudovanou fluorescenční značku jsou velmi významné např. v imunologii, kdy se používají k důkazu antigenů nebo protilátek v lidských.nebo zvířecích tkáních: důkazová metoda tohoto typu je zejména vhodná ke studiu řezů tkání v histologii. Jiná aplikace spočívá v selektivním značení buněk nesoucích na svém povrchu definované receptory.

Latexové částice se tradičně syntetizují emulzní radikálovou polymerizací, jež předsta vuje v průmyslu velmi rozšířenou metodu. Monomer, který je ve vodě nerozpustný, se přitom rozmíchá ve vodním roztoku emulgátoru, čímž se získé emulze připomínající mléko. Přidá-li se nyní k této emulzi ve vodě rozpustný radikálový iniciátor, započne při vhodné teplotě polymerizace. Vznikající latex je v přítomnosti emulgátorů velmi stabilní. Každé jeho částice je obklopena ionizovanou vrstvou mýdlových molekul, jež zabraňují koagulaci. Tato vrstva však způsobuje, že povrch částeček má zcela jiné chemické vlastnosti než vlastní polymer.

Nevýhoda klasického systému se zčásti odstraní tak zvanou bezemulgátorovou emulzní polymerizací. Ta vede rovněž k latexům, které neobsahují nežádoucí eAulgátor, a tudíž podstatně čistším. Tak byly připraveny např. latexy z polytetrafluoretylenu, polystyrenu, polyvinylacetátu, polykarboxystyrenu.

Stabilní latexy vznikají zejména při polymerizací ionogenních monomerů, přičemž ionogenní skupiny bývají situovány na povrchu částic tak, že přebírají funkci emulgátorů. Pro imunologické účely se všek výše uvedené monomery příliš nehodí, nebol jejich aktivace umožňující v dalším sledu navázání biologicky a/nebo imunologicky ektivní látky je obtížná, nebo alespoň náročná. Proto byly vyvinuty hydrofilní latexové částice Schopné kovalentně vázat biologicky a/nebo imunologicky aktivní látky, aniž by došlo ke zmšnš struktury navázané látky ne jedné straně či k porušení stability emulze na straně druhé a jsou předmětem čs. AO č. 225 010. Podle této přihlášky se syntetizují hydrofilní latexové částice emulzní polymer!žací monomerů obsahujících v molekule epoxidové skupiny, popř. v kombinaci s jinými monomery způsobujícími žádoucí změny vlastností částic, v přítomnosti vodorozpustného iniciátoru tvořícího radikály, avšak bez přídavku jakéhokoliv emulgátoru nebo stabilizátoru emulze. Jako jeden z použitých dalších monomerů mohou být použity i monomerní, radikálově polymerizovatelné deriváty barevných nebo fluoreskujících sloučenin, v nichž jsou známým způsobem metakryloylovány či ekryloylovány zbytky.

Jiná známá cesta získání fluorescenčně značených latexových částic pro aplikaci v imunologii popsaná v US pat. spise č. 4 108 972 spočívá v reakci již hotových latexových částic s reaktivními deriváty fluoreskujících či barevných sloučenin. Oba poslední jmenované způsoby mají společnou nevýhodu v nutnosti syntetizovat mnohdy dlouhou a pracnou cestou odpovídající vhodný derivát.

Ve druhém případě pak ještě přistupuje ta okolnost, že reakce barevné či fluoreskující sloučeniny s latexovou částicí probíhá téměř výlučně ne povrchu částečky a tady se¹ skupinami původně určenými pro vazbu biologicky a/nebo imunologicky aktivní látky. Vzhledem k tomu, že ne všechny skupiny jsou z nejrůznšjšíeh důvodů stejně reaktivní, reagují nejprve skupiny, jež jsou nejpřístupnější a pro vazbu biologicky a/nebo imunologicky aktivních látek, která je náročnější, zbývají skupiny měně reaktivní či hůře dostupné.

Kromě toho, při vysoké substituci js povrch částic co do složení velmi odlišný od původního polymeru a výhoda bezemulgátorového postupu se smývá.

Uvedené nevýhody překonává způsob přípravy reaktivních hydrofilnlch latexových částic s fluorescenční značkou podle tohoto vynálezu. Předmětem vynálezu je způsob přípravy hydrofilnlch latexovýxh částic s fluorescenční značkou vyznačený tím, že se polymerizuje monomer obsahující v molekule polymerizovatelnou dvojnou vazbu a současně i epoxidovou skupinu vybraný ze skupiny zahrnující 3,4-epoxy-t-buten, glycidylvinyleter, glycidylvinylftalát, glycidylmetakrylát, glycidylakrylát samotný či v přítomnosti dalšího monoči divinylického monomeru v množství menším než 99 % hm. vybraného ze skupiny zahrnující styren, vinylacetát, isopren, divinylbenzen, etylendimetakrylát,a v přítomnosti 0,15% hm. v monomerech rozpuetné fluoreskující a/nebo barevné látky vybrané ze skupiny zahrnující fluorescein, rosamin, rhodamin, kumarin, akridin a jejich deriváty po dispergaci v 8- až I6násobném množství vody, v níž je rozpuštěno 0,5 až 1,5 g/1 iniciátoru radikálová j polymer!zace při teplotě 0 až 80 °C po dobu 5 až 40 hodin.

Způsob podle vynálezu je dále vyznačený tím, že se prostřednictvím katalyzátoru fázového přenosu změní rozdělovači koeficient fluoreskující a/nebo barevné látky mezi vodní a polymerizující fází.

Způsob přípravy částic s fluorescenční značkou podle vynálezu je citlivý na přítomnost vzdušného kyslíku a je proto nutné tento ze všech komponent s nádob odstranit vyvařením nebo destilací a manipulací pod inertní atmosférou dusíku, argonu či jiného inertního plynu.

Samotná polymerizace probíhá s výhodou při objemovém poměru vodní a monomerní fáze v násadě od 8:1 do 16:1, teplotě 0 až 80 °C podle použitého iniciátoru, po dobu 5 až 40 hodin.

( Monomer obsahující v molekule polymerizovatelnou dvojnou vezbu a současně 1 epoxidovou skupinu může být použit jenom jeden nebo jejich směs. Obsah epoxidu v částicích, j^kož i jejich další chemické a fyzikální vlastnosti se výhodou upravuje přídavkem dalšího monomeru jako styrenu, isoprenu, vinylacetátu.

Pro zamezení rozpustnosti vznikajících latexových částic ve vodě nebo organických rozpouštědlech, jež může být u některých, zejména kopolymerních násad se silně hydrofilními hoaonomery, velmi akutní, se do polymerizační násady přidávají obvyklá sílovadla divinyliekého typu jako divíisylbenzen, etylendimetakrylát e další.

Zásadní vklad vnáěí do způsobu přípravy reaktivních nydrofilních latexových částic přítomnost barevných a/nebo fluoreskujících sloučenin, rozpuštěných v monomeru nebo směsi monomerů již před zahájením emulzní polymerizace.

Jako iniciátoru lze použít každého vodorozpustného Iniciátoru běžně užívaného v emulzní polymerizací. S výhodou jsou to peiOxodisulfáty, peroxoboráty, peroxid vodíku a ionogenní deriváty 2,2^,-azodiisobutyronitrilu.

Způsobem podle vynálezu připravené reaktivní, hydrofilni latexové částice s fluorescenční značkou, jsou perfektně kulovité, všechny prakticky stejně veliké (monodisperzní) a průměrem od aei 0,2 do 1 ,>/«.

Syntetizovaný latex po skončení polymerizace může obsahovat zbytky nezreagovaných monomerů a barevnou či fluoreskující látku, která je výhodné odstranit destilací s vodní parou, dialýzou nebo dekantací s použitím odstředivky. Vhodným způsobem kontroly vyčištění latexu je sledování fluorescence supernetantu nebo dialyzátu.

Princip zabudování barevné či fluoreskující látky spočívá v přenosu radikálu z pólymerizujícího řetězu na molekulu barevné či fluoreskující látky, jež pak sama nebo její část v dalším stadiu slouží jako startér pro další řetězec nebo se rekombinací desaktivuje. Přitom přenosová reakce může probíhat jak ve vodní fázi za vzniku povrchově aktivních oligomerů zakončených fluorescenční značkou, tak i v aicelární organické fázi.

Podíl obou typů reakcí je závislý na rozdělovacím koeficientu barevné či fluoreskující látky mezi vodnou a organickou fází a rychlosti difúze mezi fázemi. Zvýšení rozpustnosti fluoreskující látky v organické micelárni fázi lze dosáhnout jednoduchou chemickou modifikací.

Vysokou účinnost přenosových reakcí probíhajících v polymerizující směsi obsahující fluorescenční látku lze přičíst jejich chemické struktuře. Většinou se jedné o aromatické sloučeniny fenolového typu, jež se obecně vyznačují vysokými přenosovými konstantami.

Zvýěení mezifázového transportu pak lze docílit i pomocí fázových přenašečů.

Terminální epoxidové skupiny bočních řetězů v latexech jsou vysoce reaktivní a mohou být snadno chemickou reakcí modifikovány za vzniku skupin jiných, pro zamýšlené použití vhodnějších. Přitom zpravidla nedochází ke ztrátě fluorescenční schopnosti latexu a jeho užitné vlastnosti zůstávají zachovány.

Přikladl

V 20 g glycidylmetakrylátu bylo rozpuštěno 10 mg fluoresoeinu .a proudem dusíku odstraněn rozpuštěný kyslík. V 200 ml převařené redestilované vody vychlazené v proudu dusíku bylo rozpuštěno 0,4 g 3,3'-azobis-O kyanobutansulfonenu sodného); obě komponenty převedeny do skleněného reaktoru a 10 min probubláván dusík. Poté reaktor uzavřen a směs ponechána za stálého míchání (500 ot/min) reagovat při 75 °C po dobu 24 hodin. Po uplynutí této doby bylo dosaženo 95 % konverze, produkt je latex vytvořený monodisperzními kulovitými částicemi žlutého zabarvení o průměru 500 nm a fluoreskujícími v UV světle (žlutozelená fluorescence). Polymer obsahuje 0,05 mg fluoresceinu (1 g polyglycidylmetakrylátu).

Příklad 2

Způsobem popsaný® v příkladu 1 byly odděleně zbaveny kyslíku roztok 0,4 g 3,3^z-azobis(3-kyanobutansulfonanu sodného) a 200 ml redestilované vody a 20 g směsi obsahující 85 % hmot. styrenu a 15 % hnot. glycidylmetakrylátu, ve které bylo rozpuštěno 10 mg fluoresceinu a 20 mg cetyltrimetylamonium chloridu. Po smísení byla reakční aměs zahřívána za stálého míchání 500 ot/min při teplotě 75 °C po dobu 24 hodin. Nezreagovaný monomer byl odstraněn destilací vodní parou. Vznikající monodisperzní kopolymerní částice mají průměr 250 nm, vykazují v UV světle žlutozelenou fluorescenci. Polymer obsahuje 0,03 mg fluoresceinu/ /1 kg kopoiymerů.

Příklad 3

Způsobem popsaným v příkladu 1 byla zpolymerizována směs, připravená smísením 0,3 g 3,3'-azobis-(3-kyanobutansulfonové kyseliny) v 200 ml redestilované vody a 20 g směsi, obsahující 85 % hmot. vinylecetátu a 15 % hmot. glycidylmetakrylátu. Za podmínek polymerizace příkladu 1 dosáhla konverze 80 %, vzniklý latex sestával z monodisperzních kulovitých částic o průměru 200 nm. Polymer obsahuje 0,02 mg fluoresceinu/1 g polymeru.

Příkladě

Způsobem popsaným v př. 1 byla zpolymerizováne násada složená z roztoku 0,4 g 3,3'-azobis-(3-kyanobutansulfonanu sodného) v 200 ml redestilované vody a 20 g směsi složené z 15 % hmot. glycidylmetakrylátu a 85 % hmot. isoprenu a obsahující 10 mg fluoresceinu a 10 mg cetyltrimetylamoniuůi chloridu za 24 hodiny při teplotě 75 °C. Dosažená konverze byla 75 %, nezreagované monomery odstraněny destilací s vodní parou. Vzniklý stabilní latex obsahoval monodisperzní kulovité částice a průměrem 250 nm, vykazující žlutozelenou fluorescenci.

Příklad 5

Způsobem popsaným v příkladu 1 byly odděleně zbaveny kyslíku roztok 0,4 g 3,3'-azobis(3-kyanobutansulfonové kyseliny) v 200 ml redestilované vody a 20 g glycidylmetakrylátu, ve kterém bylo rozpuštěno 10 mg kumarinu a pak smíseny a polymer!zovány po dobu 24 hodin při 75 °C za stálého míchání. Nezreagovaný monomer a nízkomolekulární látky byly odstraněny dialýzou. Konverze činila 96 %,

Vzniklý latex obsahoval monodisperzní kulovité částice o průměru 520 nm, vykazující modrou fluorescenci v UV světle. Polymer obsahoval 0,04 mg kumarinu/1 g polymeru.

K reakci bylo přivedeno 100 ml latexu se 100 ml vodného roztoku amoniaku (25 %} a při pokojové teplotě ponecháno reagovat 24 hodin, přičemž aminolýzou oxiranových skupin vznikají aminoskupiny. Velikost latexových částic a jejich distribuce zůstává nezměněna. Modifikovaný latex obsahuje 0,04 mg kuraminu/1 g polymeru.

Příklade

Způsobem popsaným v příkladu 1 odděleně zbaveny kyslíku roztoky 0,4 g 3,3'-azobis(3-kyanobutansulfonenu sodného) v 200 ml vody a 20 g glycidylmetakrylátu s 1 g etylendimetakrylétu; ve směsi monomerů bylo rozpuštěno 10 mg rodaminu B a 20 mg dodecyltrimetylamonium chloridu. Po smísení byla reakční směs polymerizována při 75 °C po dobu 12 hodin za stálého míchání. Nezreagovaný monomer a nízkomolekulární látky byly odstraněny tlakovou filtraci.

Konverze činila 96 %, vzniklý latex obsahoval monodisperzní kulovité částice průměru 500 nm, vykazující fluorescenci v UV světle odpovídající množství 0,03 mg rhodaminu B/1 g . polymeru. K reakci bylo přivedeno 100 ml latexu se 100 ml 0,05 M HgSO^ při zahřívání na °C po dobu 3 hodin. Dochází k hydrolýze oxiranových skupin za vzniku viciélních diolů. Velikost latexových částic zůstává zachována a po úprevě latexu dialýzou proti 1% roztoku sody vykazují částice fluorescenci odpovídající 0,03 mg rhodaminu B/1 g polymeru. Hydrolyzovaný latex (100 ml) byl oxidován roztokem 0,1 N HJ0₄(200 ml) při laboratorní teplotě po dobu 24 hodin za stálého míchání. Dialýzou latexu proti 1% roztoku sody byla odstraněna nezreagovaná kyselina jodlstá a tlakovou filtrací upraven celkový objem latexu na 100 ml; latexové částice obsahují 4 % hmot. aldehydových skupin a jejich fluorescence odpovídá 0,01 mg rhodaminu B/1 g polymeru.

Příklad 7

Způsobem popsaným v příkladu 1 byl odstraněn kyslík z roztoků 0,4 g 3,3’-azobis(3-kyanobutansulfonové kyseliny) v 300 ml vody a 20 g glycidylmetakrylátu s 0,5 g divinylbenzenu, ve kterém bylo rozpuštěno 15 mg kondenzačního produktu kumarinu s formaldehydem a dodecylaminem. Po smísení byla reakční směs polymer!zována 24 hodin při 75 °C. Nezreagované monomery a ní zkomolekulární látky byly odstraněny tlakovou filtrací? vzniklý latex obsahoval monodisperzní kulovité částice velikosti 500 nm vykazující modrou fluo-rescenci.

Příklad 8

KluoresCj-latex-OCHg-CH-pHg 0

NH.OH —fluoresc.-latex-OCH_-CH-CH ^{1 2} 1 I

OH NH fluoresc₂+CH_0 -ífluoresc,-latex-OGH„-GH-GH' ² i I ²

OH NH-CH₂-fluoresc₂

Latex připravený postupem příklad 1 a obsahující 0,05 mg fluoresceinu/1 g polymeru byl zředěn stejným objemem 15% roztoku hydroxidu amonného a ponecháno reagovat 24 hodin při laboratorní teplotě. Amonolýzou vznikají z oxiranových skupin viciální amino-a hydroxylové skupiny. Po dialýze a úpravě pH latexu na 8 bylo přidáno 10 mg fluoresceinu a 0,5 ml 37% roztoku formaldehydu a reakční směs míchána dalších 24 hodin při laboratorní teplotě a pak dialyzována do ztráty fluorescence dialyzátu 1% roztokem sody. Takto modifikovaný latex obsahoval monodisperzní kulovité částice průměru 500 nm a obsahoval 0,10 mg fluoresceinu/1 g polymeru.

Claims (2)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   1. Způsob přípravy reaktivních hydrofilních latexových částic s fluorescenční značkou vyznačený tím, že se polymerizuje monomer obsahující v molekule polymerizovatelnou dvojnou vazbu a současně i epoxidovou skupinu vybraný ze skupiny zahrnující 3,4-epoxy-1-buten, glycidylvinyleter, glycidylvinylftalát, glycidylmetakrylát, glycidylakrylát samotný či v přítomnosti dalšího mono- či divinylického monomeru v množství menším než 99 % hm. vybraného ze skupiny zahrnující styren, vinylacetát, isopren, dlvinylbenzen, etylendimetakrylát a v přítomností 0,15 až 1 % hm. v monomerech rozpustné fluoreskující a/nebo barevné látky vybrané ze skupiny zahrnující fluorescein, rosamin, rhodamin, kumarin, akridin a jejich deriváty po dispergaci v 8-až IĎnésobném množství vody, v níž je rozpuštěno 0,5 až 1,5 g/1 iniciátoru radikálové polymerizace při teplotě 0 až 80 °C po dobu 5 až 40 hodin.
2. 2. Způsob přípravy podle bodu 1, vyznačený tím, že se prostřednictvím katalyzátoru fázového přenosu změní rozdělovací koeficient fluoreskující a/nebo barevné látky mezi vodní a polymerizující fází.