CS223295B1 - Imunoreagens - Google Patents
Imunoreagens Download PDFInfo
- Publication number
- CS223295B1 CS223295B1 CS938481A CS938481A CS223295B1 CS 223295 B1 CS223295 B1 CS 223295B1 CS 938481 A CS938481 A CS 938481A CS 938481 A CS938481 A CS 938481A CS 223295 B1 CS223295 B1 CS 223295B1
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- particles
- phagocytic
- phagocytosis
- acrylamide
- glycol
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 25
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 12
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 claims description 6
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 claims description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 4
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 19
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 13
- 230000000242 pagocytic effect Effects 0.000 description 12
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 11
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 11
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- WOBHKFSMXKNTIM-UHFFFAOYSA-N Hydroxyethyl methacrylate Chemical compound CC(=C)C(=O)OCCO WOBHKFSMXKNTIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- -1 N-monosubstituted methacrylamide Chemical class 0.000 description 6
- STVZJERGLQHEKB-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol dimethacrylate Chemical compound CC(=C)C(=O)OCCOC(=O)C(C)=C STVZJERGLQHEKB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 4
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 4
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N Methacrylic acid Chemical compound CC(=C)C(O)=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 3
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N diethylene glycol Chemical compound OCCOCCO MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 239000013081 microcrystal Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- SJIXRGNQPBQWMK-UHFFFAOYSA-N 2-(diethylamino)ethyl 2-methylprop-2-enoate Chemical compound CCN(CC)CCOC(=O)C(C)=C SJIXRGNQPBQWMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFDVPJUYSDEJTH-UHFFFAOYSA-N 4-ethenylpyridine Chemical compound C=CC1=CC=NC=C1 KFDVPJUYSDEJTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 2
- 150000003926 acrylamides Chemical class 0.000 description 2
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 229910052793 cadmium Inorganic materials 0.000 description 2
- BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N cadmium atom Chemical compound [Cd] BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910000011 cadmium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- FQPSGWSUVKBHSU-UHFFFAOYSA-N methacrylamide Chemical compound CC(=C)C(N)=O FQPSGWSUVKBHSU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000014207 opsonization Effects 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229920002187 poly[N-2-(hydroxypropyl) methacrylamide] polymer Polymers 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 2
- PUPZLCDOIYMWBV-UHFFFAOYSA-N (+/-)-1,3-Butanediol Chemical compound CC(O)CCO PUPZLCDOIYMWBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002818 (Hydroxyethyl)methacrylate Polymers 0.000 description 1
- FYBFGAFWCBMEDG-UHFFFAOYSA-N 1-[3,5-di(prop-2-enoyl)-1,3,5-triazinan-1-yl]prop-2-en-1-one Chemical compound C=CC(=O)N1CN(C(=O)C=C)CN(C(=O)C=C)C1 FYBFGAFWCBMEDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 2-(2-methoxy-5-methylphenyl)ethanamine Chemical compound COC1=CC=C(C)C=C1CCN SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JAHNSTQSQJOJLO-UHFFFAOYSA-N 2-(3-fluorophenyl)-1h-imidazole Chemical compound FC1=CC=CC(C=2NC=CN=2)=C1 JAHNSTQSQJOJLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKNCOURZONDCGV-UHFFFAOYSA-N 2-(dimethylamino)ethyl 2-methylprop-2-enoate Chemical compound CN(C)CCOC(=O)C(C)=C JKNCOURZONDCGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 2-Propenoic acid Natural products OC(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RKOOOVKGLHCLTP-UHFFFAOYSA-N 2-methylprop-2-enoic acid;propane-1,2,3-triol Chemical compound CC(=C)C(O)=O.OCC(O)CO RKOOOVKGLHCLTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KGIGUEBEKRSTEW-UHFFFAOYSA-N 2-vinylpyridine Chemical compound C=CC1=CC=CC=N1 KGIGUEBEKRSTEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CBZMQWPBAUBAPO-UHFFFAOYSA-N 4-ethenyl-n,n-diethylaniline Chemical compound CCN(CC)C1=CC=C(C=C)C=C1 CBZMQWPBAUBAPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VJOWMORERYNYON-UHFFFAOYSA-N 5-ethenyl-2-methylpyridine Chemical compound CC1=CC=C(C=C)C=N1 VJOWMORERYNYON-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000006577 C1-C6 hydroxyalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002738 Giemsa staining Methods 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010020983 Hypogammaglobulinaemia Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108700022034 Opsonin Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000005141 Otitis Diseases 0.000 description 1
- 206010033078 Otitis media Diseases 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- DAKWPKUUDNSNPN-UHFFFAOYSA-N Trimethylolpropane triacrylate Chemical compound C=CC(=O)OCC(CC)(COC(=O)C=C)COC(=O)C=C DAKWPKUUDNSNPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000010420 art technique Methods 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- GKDXQAKPHKQZSC-UHFFFAOYSA-L cadmium(2+);carbonate Chemical compound [Cd+2].[O-]C([O-])=O GKDXQAKPHKQZSC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- KOHRTFCSIQIYAE-UHFFFAOYSA-N cadmium;carbonic acid Chemical compound [Cd].OC(O)=O KOHRTFCSIQIYAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 229940095731 candida albicans Drugs 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000005482 chemotactic factor Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 1
- 238000003235 crystal violet staining Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 208000019258 ear infection Diseases 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- IQIJRJNHZYUQSD-UHFFFAOYSA-N ethenyl(phenyl)diazene Chemical compound C=CN=NC1=CC=CC=C1 IQIJRJNHZYUQSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000005448 ethoxyethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])OC([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 229940116336 glycol dimethacrylate Drugs 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 125000002768 hydroxyalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- FPYJFEHAWHCUMM-UHFFFAOYSA-N maleic anhydride Chemical compound O=C1OC(=O)C=C1 FPYJFEHAWHCUMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- LVHBHZANLOWSRM-UHFFFAOYSA-N methylenebutanedioic acid Natural products OC(=O)CC(=C)C(O)=O LVHBHZANLOWSRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- OKPYIWASQZGASP-UHFFFAOYSA-N n-(2-hydroxypropyl)-2-methylprop-2-enamide Chemical compound CC(O)CNC(=O)C(C)=C OKPYIWASQZGASP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000015286 negative regulation of phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000000399 optical microscopy Methods 0.000 description 1
- 210000004976 peripheral blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003024 peritoneal macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000151 polyglycol Polymers 0.000 description 1
- 239000010695 polyglycol Substances 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 229920002994 synthetic fiber Polymers 0.000 description 1
- ZIBGPFATKBEMQZ-UHFFFAOYSA-N triethylene glycol Chemical compound OCCOCCOCCO ZIBGPFATKBEMQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RRHXZLALVWBDKH-UHFFFAOYSA-M trimethyl-[2-(2-methylprop-2-enoyloxy)ethyl]azanium;chloride Chemical compound [Cl-].CC(=C)C(=O)OCC[N+](C)(C)C RRHXZLALVWBDKH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000002747 voluntary effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
Vynález se týká použití mikročástic na bázi hydrofilních polymerů v imunologii, zejména pro stanovení fagocytární aktivity.
Fagocytóza je jako jeden z imunologických amplifikačních systémů významným prostředkem obrany organismu. Klinické testování úrovně fagocytózy se stává důležitým kritériem pro posouzení stavu imunity pacienta. Existuje dlouhá řada chorob, jež jsou doprovázeny nebo i přímo zapříčiněny defekty fagocytární schopnosti makrofágů a mikrofágů. Jde jednak o defekty primární, tj. přímo ve funkceschopnosti těchto buněk, zpravidla jejich cytoplazmatických membrán, a jednak defekty sekundární spočívající v dysfunkci opsonizačních či chemotaktických faktorů jako například při agammaglobulinémii, defektech komplementového systému, septických stavech, nádorových onemocněních atd.
V současné době se pro stanovení fagocytární aktivity používá řada metod založených na fagocytóze nejrůznějšího materiálu. U každé z dosavadních technik lze bohužel najít nedostatky, které ztěžují správnou interpretaci výsledků a znejasňují tento významný test klinické imunologie.
V klinické praxi se nejvíce používá metoda fagocytózy mikrokrystalů uhličitanu kademnatého (CdCCU), kvasinek Candida albicans nebo Saccharomyces cerevisiae. Při použití mikrokrystalů CdCOí jsou základním nedostatkem obtíže s přípravou standardní suspenze kadmiových mikrokrystalů, neboť při případném uvolňování volného kadmia dochází k prudké inhibici fagocytózy. Dalším nedostatkem tohoto postupu je závislost na autologním séru. V průběhu testu navíc dochází k určitému poškození buněk, takže interpretace výsledků je značně nespolehlivá. Nevýhody obou zbylých technik jsou společné: obtížná příprava fagocytovaných částic, nutnost jejich stálé kultivace, určitá nestandardnost metody v různém prostředí a též závislost na opsonizaci.
Jmenované nevýhody dosud běžně používaných postupů odstraňuje metoda podle vynálezu.
Předmět vyná’ezu spočívá v použití mikrosférických částic na bázi hydrofilních polymerů o velikosti 0,05 až 3,0 ,um jako imunoreagens pro stanovení vlastností a funkcí plasmatické membrány buněk zúčastňujících se imunitních procesů a pro separaci buněk.
Mikrosférlcké částice z hydrofilních polymerů o velikosti 0,05 až 3,0 μπι vhodné pro
22329S použití v imunologii se připravují radiační polymerizací, účinkem χ záření z kobaltového zdroje, směsi složené z 90 až 99 % hmot. vody nebo její směsi s 0,01 až 20 % obj. alkoholu o počtu C atomů 1 až 4, 1 až 10 % hmot. monomerní směsi, složené z 25 až 99,5 % hmot. hydrofilních monomerů, 0,01 až 40 % hmot. ionogenních komonomerů a 0,1 až 35 % hmot. síťovadla a 0,01 až 2 % hmot. polymerního aditiva o molekulové hmotnosti 10 000 až 200 000 g/mol.
Jako hydrofilních monomerů lze použít glykolmonomethakrylát, glykolmonoakrylát, kde glykol znamená nejen prostý ethylenglykol, nýbrž i propylenglykol, butylenglykol, jakož i diethylenglykol, triethylenglykol a další homologické polyglykoly; glycerinmonomethakrylát, N-monosubstltuovaný methakrylamid, N-monosubstituovaný akrylamid, Ν,Ν-disubstituovaný akrylamid, kde substituent může být alkyl s 1 až 5 atomy uhlíku, nebo hydroxyalkyl s 1 až 6 atomy uhlíku, obsahující 1 až 2 OH skupiny; 4-vinylpyridin, 2-vinylpyridln, 5-vinyl-2-methylpyridin; akrylamid, methakrylamid.
Ionogenní komonomery jsou kyselina methakrylová, kyselina akrylová, kyselina itakonová, maleinanhydrid, diethylaminoethylmethakrylát, dimethylaminoethylmethakrylát, p-diethylaminostyren; methakryloyloxyethyltrimethylamoniumchlorid.
Jako síťovadla je výhodné použít glykoldimethakrylát, kde glykol má výše uvedený význam; glykoldiakrylát, methylen-bis-akrylamid, ethylen-bis-akrylamid, trimethylolpropantriakrylát, triakryloylhexahydrotriazin.
Aditivum je s výhodou poly[N-(2-hydroxypropyl) methakrylamid], dále je možno použít N-monosubstituovaný methakrylamid, póly N-monosubstltuovaný akrylamid, póly Ν,Ν-disubstituovaný akrylamid, kde substituent může být alkyl s 1 až 3 atomy uhlíku, nebo hydroxyalkyl s 1 až 5 atomy uhlíku obsahující 1 až 2 OH skupiny, polyvinylalkohol, polyakrylamid, polyethylenglykoly, polypropylénglykoly. Molekulová hmotnost aditiv je výhodně v rozmezí 10 000 až 200 000 g/mol.
Při polymeraci se postupuje tak, že směs monomerů (polymerizační směs) se naplní do polymerizační nádoby, například skleněné ampule, probublá dusíkem asi 15 až 20 minut, a zataví (nebo jinak utěsní). Za teploty 0 až 40 °C se ampule umístí do centra kobaltového zdroje a ozáří tak, aby dávka byla 2 až 30 k Gy. Po ozáření se ampule otevře, obsah 10X dekantuje nadbytkem destilované vody (dekantaci lze provést i ve dvou stupních, nejprve směsí ethanolu a destilované vody, poté destilovanou vodou) a uschová při 4 °C.
Výhodou tohoto způsobu polymerace je možnost přípravy čistých mikrosférických částic. To je důsledkem toho, že proces probíhá v nepřítomnosti iniciátorů či emulgátorů.
Principem nově navrhované metody je fagocytóza synteticky vyráběných částic. Tato metoda odstraňuje výše jmenované nevýhody dosud běžně používaných postupů. Příprava částic je standardní, vzniklá suspenze je naprosto homogenní a stálá (několik let). Protože jde o syntetický materiál, metoda není závislá na opsoninech.
Částice jsou sférické, homogenní velikosti, lze je připravovat v různých velikostech na základě pouhé změny koncentrace výchozích reagens. V základním provedení mají mírný negativní náboj, což vzhledem k negativnímu náboji buněk zajišťuje jejich nízkou nespecifickou adherenci k povrchu buněk. Částice jsou snadno barvitelné běžnými barvicími technikami optické i elektronové mikroskopie. Částice je možno značit fluorescentně a po tomto označení použít k detekci buněk pomocí fluorescenčních technik. Fluorescentní značení je možno provést běžně používanými postupy, například použitím fluoresceinisothiokyanátu nebo dansylallylaminu (v množství 0,01 až 5 % hmot.).
Částice obsahují volné funkční skupiny a je možno je dodatečně modifikovat pro specifickou vazbu ke zvoleným determinantám buněčných povrchů.
Zásobní suspenzi částic lze skladovat při teplotě 4 °C a lze ji uchovávat v neporušeném, tj. neaglutinovaném a nekontaminovaném stavu i bez sterilního zacházení či použití antibiotik či konzervačních látek minimálně 2 roky.
Trvanlivost suspenze byla ověřována na Imunologickém oddělení MBÚ ČSAV od prosince 1978 do listopadu 1981.
Při testu fagocytózy podle vynálezu se postupuje tak, že se 0,1 ml čerstvé periferní krve odebrané do heparinu (5 j/mlj smíchá s 0,05 ml částic dle příkladu 1 (neředěných na poměr 4 až 5 X 108/ml v pufrovaném fyziologickém roztoku). Směs se ponechá inkubovat 60 minut při 37 °C za stálého třepání. Po inkubaci se provedou nátěry na odmaštěná podložní skla a po obarvení metodou May-Grůnwald-Giemsy se hodnotí. Jako pozitivní se hodnotí buňka s 3 a více fagocytovanými částicemi. Počítá se procento fagocytujících buněk celkově, °/o fagocytujících buněk určitého typu (FA) a fagocytární index fagocytů (FIF).
Výhody nového testu fagocytózy podle vynálezu jsou v tom, že metoda je rychlá, přičemž lze současně rutinně hodnotit krevní obraz. Metoda není přístrojově náročná a lze ji provést v rámci běžného vybavení laboratoře. K jednomu testu je potřeba pouze 0,1 ml periferní krve, což zabraňuje zbytečně vysokým odběrům krve, vedoucím často k dalšímu stresu dárce, což je důležité zvláště u dětí. Částice se barví při použití barvicí metody dle May-Grůnwald-Giemsy do výrazně modra až modročervena, což umožňuje snadné odlišení od jádra a cytoplazmy buněk. Metodu lze dále celostátně standardizovat, tento krok dosud používané techniky neumožňovaly. Metoda byla testována jednak na imunologickém oddělení MBÚ na zdravých dobrovolných dárcích a jednak na Klinice infekčních chorob nemocnice Na Bulovce na zdravých dárcích ve stáří 5 až 6 let a na dárcích (3 až 6 let) s otitis média chronica. Výsledky ukazují na rozdíl schopnosti fagocytózy buněk bílé řady krve nejen u mladých a dospělých dárců, ale i mezi zdravými a nemocnými jedinci. Podle dosavadních výsledků se tato metoda zdá být standardní, spolehlivá, levná a rychlá, je tedy možno ji doporučit pro rutinní klinickou praxi.
V dalším je pomocí příkladů znázorněna příprava mikročástic a v tabulkách jsou uvedeny výsledky klinických testů.
Příklad 1 g směsi sestávající ze 77,8 % hmot. 2-hydroxyethylmethakryiátu, 0,1 % hmot. ethylendimethakrylátu, 2 % hmot. methylen-bis-akrylamidu, 0,1 % hmot. poly[N-(2-hydroxypropyljmethakrylamidu] o střední molekulové hmotnosti 70 000 g/mol a 20 % hmot. kyseliny methakrylové bylo rozpuštěno v 95 ml vody. Po přefiltrování byl roztok předložen do skleněné ampule, 15 minut probubláván čištěným dusíkem. Poté byla ampule zatavena. Směs byla za laboratorní teploty ozářena z kobaltového zdroje celkovou dávkou 10 k Gy. Po ozáření byla ampule otevřena, obsah vylit do Erlenmeyerovy baňky a opakovaně dekantován. Byly získány mikrosférické částice o průměru cca 0,9 ,um.
Příklad 2 g směsi sestávající z 50 % hmot. 2-hydroxyethylmethakrylátu, 8,5 % hmot. ethylendimethakrylátu, 40 % hmot. akrylamidu a 1,5 % hmot. poly[N-[2-hydroxypropyljmethakrylamidu] o střední molekulové hmotnosti 30 000 g/mol bylo rozpuštěno v 97 ml vody. Dále bylo postupováno jako v příkladu 1.
Příklad 3 g směsi sestávající z 77,9 % hmot. 2-hydroxyethylmethakrylátu, 0,1 % hmot. ethylendimethakrylátu, 2 % hmot. methylen-bis-akrylamidu a 20 % hmot. kyseliny methakrylové bylo rozpuštěno v 95 ml vody. Dále bylo postupováno jako v příkladu 1. Byly získány částice o průměru cca 1 («m.
Příklad 4 g směsi sestávající z 76,7 % hmot. 2-hydroxyethylmethakrylátu, 10 % hmot. 2-(hydroxyethoxy)ethylmethakrylátu, 10 % hmot. diethylaminoethylmethakrylátu, 0,3% hmot. ethylendimethakrylátu, 3 % hmot.
(ethoxyethyl)dimethakrylátu bylo rozpuštěno v 96 ml vody. Dále bylo postupováno obdobně jako v příkladu 1.
Příklad 5 g směsi sestávající z 60 % hmot. 2-hydroxyethylmethakrylátu, 15 % hmot, N-(2-hydropropyljmethakrylamidu, 0,5 % hmot, ethylendimethakrylátu, 3,5 % hmot. methylen-bis-akrylamidu, 20 % hmot. 4-vinylpyridinu a 1 °/o hmot. polyethylenglykolu bylo rozpuštěno v 97 ml rozpouštědla sestávajícího z 90 % vody a 10 % methanolu. Dále bylo postupováno obdobně jako v příkladu 1 s tím rozdílem, že celková dávka ozáření byla 7 k Gy.
Tabulka I
Vliv velikosti částic na stupeň fagocytózy:
velikost částic μιη % fagocytujících monocytů % fagocytujících granulocytů
| A | 0,35 | 63,7 | 58,4 | |
| B | 0,45 | 57,9 | 66,7 | |
| C | 0,8 | 55,2 | 68,7 | |
| D | 0,9 | 66,7 | 65,8 | |
| E | 1 | 60,2 | 69,2 | |
| F | 1 | 60,0 | 64,7 |
Poznámka: částice A a B jsou příliš malé pro tento test, horší rozlišení počtu pohlcených částic/1 buňku, tedy méně vhodné pro fagocytózní test. A a B jsou určené speciálně pro elektronovou mikroskopii.
Tabulka II
Porovnání některých metod rutinně používaných ke stanovení fagocytární aktivity.
% fagocytujících leukocytů
Poznámka:
Hodnoty pro Saccharomyces a CdCCbjsou pro dospělé dárce.
*částice podle příkladu 3;
**otitis média chronica
| Saccharomyces cerevisiae | 44 | až | 62 |
| CdCO3 | 13 | až | 15 |
| T“7* | 33 | až | 41 |
| T-7 děti | 17 | až | 20 |
| Γ-7 pacienti** (děti) | 7 | až | 8 |
Tabulka III
Průměrné hodnoty fagocytární aktivity buněk periferní krve u různých dárců.
Počet pokusů Dárce* % fagocytujících % fagocytujímonocytů cích granulocytů
| 13 | R. P. J.H. X dospělí | 57,6 44,2 46,0 | 62,1 59,9 60,0 | zdraví dospělí |
| 12 | A. L. | 38,3 | 28,0 | zdravé |
| P. H. | 35,8 | 39,2 | děti | |
| X děti (5 až 6 let) | 38,8 | 32,6 | ||
| 12 | J. L. | 25,4 | 11,1 | nemocné |
| P. P. | 17,3 | 17,7 | děti | |
| X pacienti (3 až 6 | ) 20,1 | 13,5 | ||
| * bylo sledováno | 13 (12) dárců ve | skupině; | dva z nich jsou uvedeni | jako příklad |
Na přiloženém obr. 1 je znázorněn pozitivní makrofág (buňka vlevo) a dva negativní lymfocyty z peritoneálního výplachu myši. Barvení krystalovou violetí. Inkubace 60 minut, 37 °C, částice připravené dle příkladu 3.
Na obr. 2 jsou znázorněny jednotlivé fáze fagocytózy mikrosférické částice myším peritoneálním makrofágem.
P — částice připravené dle příkladu 3 V — vakuola Inkubace 60 minut, 37 °C Elektromikroskopický snímek
Claims (1)
- PŘEDMĚTPoužití mikrosférických částic na bázi hydrofilních polymerů o velikosti 0,05 až 3,0 ,um jako imunoreagens pro stanoveniVYNÁLEZU vlastností a funkcí plasmatické membrány buněk zúčastňujících se imunitních procesů a pro separaci buněk.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS938481A CS223295B1 (cs) | 1981-12-16 | 1981-12-16 | Imunoreagens |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS938481A CS223295B1 (cs) | 1981-12-16 | 1981-12-16 | Imunoreagens |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS223295B1 true CS223295B1 (cs) | 1983-09-15 |
Family
ID=5444337
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS938481A CS223295B1 (cs) | 1981-12-16 | 1981-12-16 | Imunoreagens |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CS (1) | CS223295B1 (cs) |
-
1981
- 1981-12-16 CS CS938481A patent/CS223295B1/cs unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US3963685A (en) | Alcohol soluble hydrophilic polymer via aqueous polymerization | |
| MICKELSON et al. | Correlation of the relative response index with marrow graft rejection in patients with aplastic anemia | |
| JPWO2021112119A1 (ja) | 血液採取容器及び血漿の分離方法 | |
| Butterworth et al. | Schistosoma mansoni in baboons. Antibody-dependent cell-mediated damage to 51Cr-labelled schistosomula | |
| JP2018050548A (ja) | がん細胞捕捉方法 | |
| McCoy et al. | Human cell-mediated immunity to tuberculin as assayed by the agarose micro-droplet leukocyte migration inhibition technique: comparison with the capillary tube assay | |
| Ibbotson et al. | Mucosal cell‐mediated immunity to mycobacterial, enterobacterial and other microbial antigens in inflammatory bowel disease | |
| Crawford et al. | Antigens Aua, i and P1 of cells of the dominant type of Lu (a–b–) | |
| JP2023110819A (ja) | 血液採取容器、血漿の分離方法、細胞外遊離核酸の分離方法及び細胞外小胞の分離方法 | |
| EP0095932B1 (en) | The use of a particulate polymer as a carrier for biological substances and the like and such substances supported on the carrier | |
| Fulford et al. | Leucocyte migration and cell-mediated immunity in syphilis | |
| EP0060472A2 (en) | A method for separating T cells from leukocytes | |
| CN103667174B (zh) | 一种用于处理生物样本的组合物 | |
| WO2023145137A1 (ja) | 血液採取容器、血漿の分離方法、細胞外遊離核酸の分離方法及び細胞外小胞の分離方法 | |
| Rolland et al. | Flow cytometric quantitative evaluation of phagocytosis by human mononuclear and polymorphonuclear cells using fluorescent nanoparticles | |
| CS223295B1 (cs) | Imunoreagens | |
| Holdstock et al. | Studies on lymphocyte hyporesponsiveness in cirrhosis: the role of increased monocyte suppressor cell activity | |
| KLIPPEL et al. | Lymphocyte tubuloreticular structures in lupus erythematosus: correlation with disease activity | |
| CA1059902A (en) | Diagnostic process | |
| JP6809747B1 (ja) | 単核球含有血漿分離用組成物及び血液採取容器 | |
| Wilkinson et al. | The lupus erythematosus cell and its significance | |
| JP7355473B1 (ja) | 循環腫瘍細胞分離キット、循環腫瘍細胞分離容器及び循環腫瘍細胞の分離方法 | |
| Chitravel et al. | Cell mediated immune response in human cases of rhinosporidiosis | |
| Hartman et al. | Changes in blood leucocytes resulting from an antigen-antibody reaction | |
| US11175282B2 (en) | Method for predicting and monitoring clinical response to immunomodulatory therapy |