CS223007B1 - Způsob úpravy odpadních surovin pro izolaci ergosterolu - Google Patents

Abstract

Předmětem vynálezu je způsob úpravy odpadních surovin pro izolaci ergosterolu, který je důležitým překursorem vitamínu D2, používaném v lékařství. Způsob získávání ergosterolu podle vynálezu navazuje na technologický postup podle AO č. 161 299, který předpokládá rozdělení jednotlivých frakcí buněk, tj. proteinu, lipidické složky a zkrotitelných zbytků (směs buněčných stěn a supernatantu po srážení proteinu). Uvedená frakce zbytků se upraví na hodnotu 7 — 12 pH, odvodní se odpařením vody nebo s výhodou ethanolem, aby obsah vody byl nižší než 10 %, načež se buněčná frakce, tj. izolovaná kvasničná bílkovina, ne- , bo stěny kvasinek rozmíchají s ethanolem, při teplotě od 40 °C do 100 °C za tlaku od 0,1 do 0,3 MPa, na dobu 1 — 20 hodin, čímž se provede extrakce, načež se z lipidické frakznámým způsobem izoluje ergosterOl. Způsob podle vynálezu vytváří podmínky pro nakoncentrování ergosterolu pouze v malém objemu ethanolem extrahovatelných látek (asi 80 % veškerého ergosterolu se nakoncentruje v malém množství balastních lipidů). To umožňuje snadnější následující izolaci a čištění ergosterolu.

Description

Ergosterol je důležitým prekursorem vitamínu Dž a jeho cena neustále rosíte. Dosavadní způsoby izolace ergosterolu jsou založeny na hydrolýze buněk kvasinek S. cerevisiae a extrakci organickými rozpouštědly (US pat. č. 2 874171; aj). Podle US patentu č. 2 874 Ϊ71 se hydrolýza provádí alkáliemu v přítomnosti alkoholů omezeně mísitelných vodou. Vychází se z celých buněk (mikroorganismů), přičemž se využije pouze ergosterol. Podle jiného postupu (US patent 2 865 934) se provádí extrakce usušených alkalický opracovaných kvasinek rozpouštědly mísitelnými s vodou. Opět se nevyužívá bílkovinná, ani glycidická složka buňky. US patent 2 794035 je založen na zpracování methanolického exeťríaktu. Suspenze kvasinek v methanolu se z'a, varu extrahuje 1,5 hodiny. Po filtraci (oddělení buněk) se zmýdelňuje a izoluje se oerebrin a ergosterol...V. US patentu č. 2 865 934 se jako surovina uvažuje i možnost využití autolyzovaných buněk. Využití buněčných sltěn mikrlolorganismů pro výrobu ergosterolu je rovněž předmětem autorského osvědčení č. 189.440 (PV. 4611-77).

Nevýhoda všech známých způsobů spočívá v časové náročnosti procesu a. ve využívání. pouze je dné. nebo· „dvou., složek buněk. Nejrychlejší způsob využívající desintegrace mikroorganismů pro urychlení autolýzy kalkuluje s 8 —- 12 hod. —· autorské osvědčení č. 189 440 (PV 4611-77). U ostatních způsobů se buď získá samotný ergosterol a ostatní složky buňky, jako· jsou bílkoviny a glycidy tvoří odpad, netto se využívá ještě některá další složka. Postup je časově náročný a zbývající odpad se musí nákladně likvidovat.

Uvedené nevýhody odstraňuje způsob úpravy odpadních surovin pro izolaci ergosterolu, jehož podstatou je, že se pH buněčných frakcí upraví na hodnotu 7 — 12, odvodní se odpařením vody, nebo s výhodou eithanolem, aby obsah vody byl, nižší než 10 procent, načež se buněčné frakce, tj. izolovaná kvasničná bílkovina nebo· stěny kvasinek rozmíchají s ethanolem, při teplotě od 40 °C do 100 °C za tlaku od 0,1 do 0,3 MPa, na dobu 1 — 20 minut, čímž se provede extrakce, načež se z Upidické frakce známým způsobem Izoluje ergosterol. Místo ethanolu jako¹ rozpouštědlo lze použít 1 jiná rozpouštědla mísitelná s· vodou jakio například další alkoholy, jako methaniol, isopriopanol, dále ketony jako aceton apod. Jako odpadní surovina pro způsob úpravy dle vynálezu lze s výhodou použít frakce z kombinované výroby potravinářských a krmných bílkovin.

Způsob podle vynálezu navazuje rovněž na technologický postup podle autorského osvědčení č. 161 299. Předpokládá rozdělení jednotlivých frakcí buněk, tj. proteinů, 11pidické složky a zkrmitelných zbytků (směs buněčných stěn a supernatantu po srážení proteinu). Na rozdíl od autorského· osvědčení č. 161 299 však způsob podle vynálezu vytváří podmínky pro nakoncentrování ergosterolu pouze v malém objemu ethanolem extrahovatelných látek (EEL-lipidická frakce). Navíc předpokládá extrakci zkrmitelného podílu. Podle AO 161 299 se provádí extrakce isopropanlolem (poslední při zvýšené teplotě) a, teprve potom alkalickým ethanolem. Postup podle vynálezu předpokládá úpravu pH materiálu před extrakcí, která se může provádět kombinací rozpouštědel či pouze jedním rozpouštědlem a. hned první extrakce se provádí při zvýšené teplotě, případně tlaku. pH se musí pohybovat v neutrální až alkalické oblasti. Zmíněný postup má za následek, že asi 80 % extrahovatelného' ergosterolu se nakoncentruje v poměrně malém množství halastních lipidů (viz příkladyj. Následující izolace a čištění ergosterolu je potom snadnější, než při zpracování tukové frakce s malým obsahem ergosterolu. Dále jsou uvedeny příklady provedení způsobu podle vynálezu.

Příklad 1

Způsob získání odpadní frakce ze zkrotitelného podílu připraveného podle AO č. 161299, který obsahuje buněčné stěny a supernatant po srážení proteinu, a který je usušen na sprayové sušce. Zkrotitelný podíl z kvasinek Saccharomyces cerevlsiae dle uvedeného AO měl obsah vody nižší než 6 %. Směs před sušením obsahovala 1,16 % ergosterolu (stanoveno analyticky), tj. v 1000 g hmoty 11,6 g ergosterolu. Ze vzorku zkrotitelného· podílu bylo zjištěno·, že ethanolem lze z 1000 g hmoty vyextrahovat 76 g ethanolem extrahovatelných látek (EELj, z Čehož je 4,76 g ergosterolu (6,26 % v celkovém extraktu). Množství nevyextrahovatelného ergosterolu (6,84 g) je buď destruoyáno při sušení, nebo vázáno· na nellpidícké složky buňky.

1000 g suché hmoty se smíchá s 2500. g bezvodého ethanolu. Pokud nebylo pH zkrotitelného podílu upraveného před sušením na hodnotu pH 7 — 8, přidá se 25 ml ethan,olátu Sodného. Dobře rozmíchaná suspenze se zahřeje na teplotu 50 °C a po 10 minutách zf litru je (pod tlakem). Získá se 1400 gramů ethanolového extraktu, který obsahuje 39,8 g EEL, v nichž je obsaženo 2,9 g ergosterolu. K filtračnímu koláči se přidá 1000 g ethanolu a pokud nebylo pH směsi před sušením; upraveno přidá se 10 ml ethanoiátu sodného. Suspenze se za míchání vyhřeje na 50 °C a udržuje se na této teplotě cca 10 min. Poté se pod tlakem zfiltruje. Po· druhé extrakci bylo 1080 g ethanolového extraktu obsaženo· 15,3 g ethanolem extrahovatelných látek a z toho 1,2 g ergosterolu. Extrakce se stejným způsobem opakuje ještě jednou s 1000 g ethanolu. V ethaniolovém extraktu po třetí extrakci je obsaženo

7,8 g EEL a 0,4 g ergosterolu.

Přehled rozdělení EEL a ergosterolu v

2 3007·.

jednotlivých frakcích je uveden v tabulce 1. Extrakty z 1. a 2. stupně se spojí a po oddestiilování ethanolu se získá 55,1 g EEL o obsahu 4,1 g ergosterolu (7,44 % v EEL], Extrakce byla prováděna v šesti stupních, přičemž většina, ergosterolu byla soustředěna v extraktech z prvních dvou stupňů. Z těchto dvou prvních extraktů se potom známým způsobem (extrakce po zmýdelnění) izoluje ergosterol.

Příklad 2

Způsob získání odpadní frakce z vlodní suspenze potravinářského proteinu, izolovaného z kvasinek Saccharomyces cerevisiae. 5 kg suspenze· potravinářského proteinu získaného podle AO č. 161299 o sušině 17 %, tj. 850 g suchého podílu se po upravení pH na hodnotu 7,3 rozmíchá s 5 kg bezvodého ethanlolu a po< 5 minutách míchání se tuhý podíl z této suspenze odseparuje. 3850 g vlhké hmoty (39 % vody) se opět rozmíchá s 5 kg bezvodého ethanolu a po 5 minutách se odseparuje tuhá fáze. Ta obsahuje kromě ethanolu 10,8 % vody. Třetí extrakce probíhá při teplotě 60 °C. Extrahuje se 3 kg bezvodého ethanolu. Po 20 minutách míchání se za tlaku odfiltruje extrakt. Vzniklý filtrační koláč obsahuje 5,1 % vody a asi 52 % ethanolu. Získaný extrakt obsahuje

35,8 g EEL s 2,9 g ergosterolu. Extrakce se za zvýšené teploty opakuje ještě 2 — 3X. Extrakty se spojí a oddestiluje se ethanol.

Odparek . se použije k izolaci ergosteriolu. Celkem se z původních 10,2 g efgesterolu vyextrahuje v 'použitelné koncentraci 5,3 g. Zbytek zůstává · vázán; v buněčné frakci, případně je obsažen v dalších extrakčních podílech. Přehled látkové bilance k příkladu 2 udává tabulka 2. Ethanol z 1., případně

2. extrakce se může použít jako složka živného média nebo zrektifikovat a odvodnit. Ethanol z 3. až 5.· (případně 6.) extrakce podle příkladu 2; a othanol z 1. až 6? extrakce podle příkladu 1 se oddestiluje, žrektifikuje a použije znovu k extrakci.

Způsob odvodnění podle príkladur2 (1. a 2., případně 3. extrakce) je energeticky výhodnější než přímé odpaření vody dle příkladu 1. Na získání 1 kg proteinu: z 10,% suspenze dle příkladu 1. (koncentrovanější suspenze proteinu nejde vzhledem,' to tvorbě gelu na spreyové sušce sušit) musíme (ohřát a odpařit 9 kg vody. K tomu je zapotřebí 9 X 80 X 4,19 + 9 X 2252 = 23 283 RJ.

Na oddesťilování s > rektifiikací cca- 13 kg ethanolu (1., 2. a 3. extrakce podle příkladu 2) je zapotřebí 13l X 80 X 2;8 + 13 X 904 = = 14 664 kj. \

Také výtěžnost ergosterolu je dle· příkladu 2 vyšší (52 % proti 41 % při extrakci frakce sušené teplem) a také kvalita bílkovinné frakce je zde lepší (stupeň děnatura,ce bílkoviny je nižší a z toho vyplývá lepší rozpustnost ve vodě, lepší emulgační kapacita apod.J.

T a b u 1 k a 1

Látková bilance extrakce zkrmitelného podílu usušeného teplem.

(viz příklad 1) materiál g EEL EEL ergiosťerol · % vyextra% sušiny % celk. g % sušiny ' % EEL.'·· Lhoveného ergosterolu z cetkovéha množství (extrahovatelného)

výchozí materiál	76	7,6	100	11,6	100
po usušení	76	7,6	100	4,76	41		100 0'
1. extrakt	39,8		52,4	2,9		7,3	60,7·
2. extrakt	15,3		20,1	1,2		7,8	25,2,.
1. + 2. extrakt	55,1		72,5	4,1		7,4	86, ín
3. extrakt	7,8		10,3	0,4		5,0	8,4
4. extrakt	5,3		6,9	0,18 -		3,4 -	3,8
5. extrakt	4,6		6,0	0,15		3,3	3,1
6. extrakt	3,0		3,9	0,11		3,6	2,3.*

Látková bilance extrakce vodní suspenze potravinářského proteinu. (viz příklad 2) materiál hmotnost etha- hmotnost sus- % Vody po čás- hmotnost suši- hmotnost EEL % vyextrahovaného ergasterolu hmot. ergostenolu na extrak- penze po část. tečném odděl. ny g g původní v extraktu rolu g ci g odděl, ethano- etbanolu lu g

CM

Q,

00 o

m

0^07 co O O CO CO CQ r-T

CM o

uo

O g

§ oo o:t> £ in oo* co* £ CO CM

0) £

co

ΙΌ

CO~ rH CO co cn o* uo ιη* ιη ’Φ 00 CO rH

0	0	0	O	O	O	O
a	uo	CM	UO	CO	05	CO
0	00	05	O	CO	uo	uo
uo	co	T-i	rH	rH	yH	rH

O	0	0	0	0	0
O	0	0	0	0	0
O	0	0	0	0	0
m	in	co	co	co	co

o a o o í o o CM CM

O o o o

0000

OOOO CO CO CO CO o ω Φ o o o o o 3 44 44 2 2 2 x Slil φ ω φ a?

CO Xďl uo co

Claims (1)

1. Způslob úpravy odpadních surovin pro izolaci ergosterolu, vyznačený tím, že se pH buněčných frakcí upraví na hiodnloitu 7 až 12, odvodní se odpařením vody, niebio s výhodou ethanotem, aby obsah vody byl nižší, než 10 %, načež se buněčné frakce, tj.

   vynalezu izolovaná kvasničná bílkovina nebo stěny kvasinek rozmíchají s ethaniolem, pří teplotě od 40 °C do 100 °C zia tlaku od 0,1 do 0,3 MPa, na dobu 1 až 20 minut, čímž se provede extrakce, načež se z lipldické frakce známým způsobem izoluje ergosterol.