CS219407B1 - Způsob izolace inzulínu - Google Patents

Description

Vynález se týká způsobu izolace inzulínu a dalších biologicky účinných peptidických látek z extraktů pankreatu adsorpcí na syntetických nerozpustných makromolekulárních pryskyřicích.

Při veškerých dosavadních způsobech izolace inzulínu se postupuje tak, že se rozemletý hovězí nebo- ve-přový parikreas extrahuje okyseleným 50—70 θ/oním ethanolem. V uvedeném extrakčním činidle je inzulín nejlépe rozpustný, přičemž je též účinně chráněn před proteolytickým štěpením enzymy, přítomnými v pankreatu. V dalších fázích se extrakt vyčistí filtrací nebo -odstředěním, zpravidla po úpravě do· slabě alkalické oblasti pH a po opětovném okyselení se vakuovou destilací odežene ethanol. Zahušťuje se na 1/10 až 1/15 původního objemu, přičemž se ze zbývajícího- vodného- roztoku vyloučí vrstva lipoidů. Odstranění této vrstvy činí obvykle značné potíže, nehledě k současným ztrátám inzulínu. Z čirého filtrátu se potom inzulín vysolí .a podrobuje dalšímu čištění, které je ukončeno krystalizací.

Snahy o zjednodušení dosud obvyklé technologie (náhrada zahušťování velkých objemů ethanolického extraktu ve vakuu, odstraňování lipidů], vedly k vypracování nových metod, používajících iontoměničů. Například Jorpes se sp. izoluje inzulín z ex2 traktu adsorpcí na přirozeném měniči iontů, algin-ové kyselině (západoněmecký pat. spis č. 1043 5(84). Při tomto způsobu se vychází z kyselého· extraktu, který se po alkalické úpravě opět upraví do kyselé oblasti na pH 3,0:—4,7 a uvede do styku s přirozeným měničem iontů, alginovou či pektinovou kyselinou, popřípadě oxycelulosou, na který se inzulín obsažený v extraktu adsorbuje. Po oddělení měniče se inzulín eluuje vodnou 0,3 N kyselinou chlorovodíkovou.

V pat. spise výtěžky uvedeny nejsou, v souběžné publikaci (Acta chem. sc.ahd. 14, 1777, 1960) uváděné výtěžky jsou značně nízké, přibližně 800—1000 m.j. inzulínu z 1 kg hovězího· pankreatu a 40010 m.j. z 1 kg telecího¹ pankreatu, což nedosahuje ani polovinu množství inzulínu obsaženého ve žláze. Z provozního hlediska je tato· metoda značně neekonomická.

Předmětem vynálezu je další zdokonalení a zjednodušení technologie izolace inzulínu, a to i metody používající měničů iontů.

Podstata tohoto způsobu, který je vhodný též k izolaci dalších biologicky aktivních peptidických látek z extraktů pankreatu, spočívá v tom, že se isolace provádí ze surového vyčepeného extraktu s hodnotou pH β—8, s výhodou 6,5-7,0, adsorpcí na iontoměničích, obsahujících skupiny —COOH, —CIfeCOOH nebo — C-HOH . COOH, na bázi esterů kyseliny akrylové nebo methakrylové s dioly, kopolymerovaných s 0,5 — 5 % síťhvadla, jako- je divlnylbenzen nebo dimethakrylát, a s neutrálním monomerem, jako jsou estery kyseliny akrylové, methakrylové nebo maleinové, popřípadě styren, načež se naadsorbo-vaný inzulín a další biologicky aktivní peptidické látky z iontomeniče eluují.

Eluce z iontomeniče se provádí nejlépe vodným alkanolem s 1 až 3 atomy uhlíku, s výhodou ethanolem, obsahujícím 0^f,3—3,0% s výhodou 1,Q %, kyseliny chlorovodíkové, sirové nebo- fosforečné.

Optimálního efektu adsorpce se dosáhne při použití iontoměničů s makroporézní houbovitou strukturou.

Při provedení způsobu podle vynálezu dochází k adsorpci inzulínu a dalších biologicky aktivních pep-tidických látek na iontoměničích uvedeného- složení a vlastností pouze z neutrálního prostředí, s optimem při pH

6,5 až 7,0i, které je nejšetrnější.

V prostředí kyselém, jako je tomu při použití kyseliny alginové, adsorpce nenastává. Eluce se provádí 30—70%ním ethanolem, okyselením kyselinou na příslušné pH, optimálně probíhá s 50—60%ním ethanolem, obsahujícím 1 % ί-ICL Na rozdíl od 'kyseliny alginové a jiných přirozených iontoměničů nedochází k eluci ze syntetického- iontomeniče pouhou vodnou zředěnou kyselinou, přítomnost alkoholu v elučním činidle je nutná.

Ze získaného- eluátu se ve vakuu odpaří ethanol a z odparku se potom již běžným způsobem vysolí přídavkem NaCl inzulín, který se dále čistí a nakonec krystaluje.

Je samozřejmé, že všechny typy karboxylových katexu nejsou stejně vhodné pro izolaci inzulínu ze surových extraktů. Záleží především na tom, jak rychle se ustavuje rovnováha. Předpokladem úspěšné adsorpce a -eluce vysokomolekulárních látek, je možnost jejich proniknutí do- částic pryskyřic nebo vhodným způsobem zvětšený povrch částic a přítomnost pouze takových funkčních skupin, které nepoutají. adsorbovanou látku příliš pevně.

Jmenovaným požadavkům vyhovují nejlépe slabě zesíťované karboxylové katexy, obsahující 0,5 — 5,0» % síťovadla, jejichž vlastnosti, například bobtnavost, lze podle potřeby modifikovat volbou vhodných složek. Kapacitu ionfioměničů lze dále zvýšit jejich úpravou do- formy makroporézní houbovité struktury. U takových pryskyřic se- při zachování makroskopicky pravidelného tvaru částic silně zvětší aktivní povrch a není pak zapotřebí, aby pepfcidická makromo-lekulární látka musela pronikat dovnitř pryskyřice. Další výhodou uvedeného typu syntetických pryskyřic je to, že spojují v sobě vlastnosti p*ro isolaci polypetidů, tj. vlastnosti iontoměnné s vlastnostmi gelo-vého filtru.

Adso-rpce inzulínu není v podstatě závislá ina titrační kapacitě iontomeniče, rozhodující je množství síťovadla, velikosti částic, houbovitost struktury, doba adsorpce, množství měniče a koncentrace vodíkových iontů.

Příklad provedení kg zmraženého hovězího nebo vepřového pankreatu se rozemele přímo do 21,5 litru 96%ního ethanolu, okyseleného 225 mililitry kyseliny fosforečné. Míchá se 2 hodiny při teplotě místnosti, potom se drť oddělí a opět extrahuje 2 hodiny 20 litry 60 až 65%ního ethanolu, okyseleného 90 ml kyseliny fosforečné. Filtráty se spojí a vyčiří na odstředivce. Potom se pH upraví na

6,5—7,0 (roztokem hydroxidu sodného, amoniakem apod.) a vzniklá sraženina se oddělí. K čirému filtrátu se přidá 400 g karboxylového katexu v H-cyklu a mírně se míchá 2—16 hodin. Po ukončeném míchání klesne katex ke dnu. Katex se oddělí od kapalného podílu a eluuje za míchání 500 mililitrů 60i%ního ethano-lu, okyseleného 15 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové. Po 15—30 minutách míchání se katex odfiltruje a eluuje obdobně ještě jednou. Eluáty se spojí, ethanol se oddestiluje ve vakuu a z vodného média se inzulín vysolí přídavkem NaCl do koncentrace 25 až 28 % a dále zpracovává některou z obvyklých metod.

Claims (3)

1. Způsob izolace inzulínu a dalších biologicky aktivních peptidických látek z extraktů pankreatu adsorpcí na syntetických nerozpustných makromolekulárních pryskyřicích, obsahujících karboxylové skupiny, vyznačující se tím, že se izolace provádí ze surového vyčiřeného extraktu s hodnotou pH 6—8, s výhodou 6,5—7,0, adsorpcí na iontoměničích, obsahujících skupiny —COOH, —CH2COOH nebo —CHOH . COOH, na bázi esterů kyseliny akrylové nebo methakrylové s dioly, kopolymerovaných s 0,5 až 5,0 % sífovadla, jako je divinylbenzen nebo dimethakrylát, a s neutrálním monomeVYNALEZU rem, jako jsou estery kyseliny akrylové, methakrylové nebo· maleino’vé, popřípadě styren, načež se naadsorbováný inzulín a další biologicky aktivní peptidické látky z iontoměniče eluují.

2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se eluce z iontoměniče provádí vodným alkanolem s 1—3 atomy uhlíku, s výhodou ethanolem, obsahujícím 0,3—3,0 %, s výhodou 1,0 % kyseliny chlorovodíkové, sírové nebo fosforečné.

3. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se používá iontoměničů s makroporézní houbovitou strukturou.