CS218032B1 - Způsob přípravy monensinu nebo jeho solí, zejména faktoru A - Google Patents

Abstract

Vynález se týká způsobu přípravy monensinu nebo jeho solí, zejména faktoru A. Výchozí kmen Streptomyces cimamonensis 179 CCM 3504 se fermentuje při teplotě 28 °C až 40 °C v submersní kultuře ve třech stupních. 1. inokulační půda obsahuje glycerol, pepton, masový výtažek a NaCl, 2. inokulační půda glukosu, sušené pivovarské kvasinky Pangamin, sójovou mouku a uhličitan vápenatý a fermentační půda ve třetím stupni obsahuje ve hmotnostní koncentraci rostlinný olej 2 až 10 % glukosu 1 °/o sójovou mouku 0,5 až 2 % uhličitan vápenatý 0,5 % hydrofosfcrečnan draselný 0,01 °/o načež se výsledný produkt izoluje známým způsobem.

Description

Vynález se týká způsobu přípravy monensinu nebo jeho solí, zejména faktoru A. Výchozí kmen Streptomyces cimamonensis 179 CCM 3504 se fermentuje při teplotě 28 °C až 40 °C v submersní kultuře ve třech stupních. 1. inokulační půda obsahuje glycerol, pepton, masový výtažek a NaCl, 2. inokulační půda glukosu, sušené pivovarské kvasinky Pangamin, sójovou mouku a uhličitan vápenatý a fermentační půda ve třetím stupni obsahuje ve hmotnostní koncentraci rostlinný olej 2 až 10 % glukosu 1 °/o sójovou mouku 0,5 až 2 % uhličitan vápenatý 0,5 % hydrofosfcrečnan draselný 0,01 °/o načež se výsledný produkt izoluje známým způsobem.

Vynález se týká přípravy monensinu, zejména faktoru A, případně přípravy antibiotického a koksidiostatického komplexu látek monensinového typu.

Způsob přípravy monensinového komplexu (antibiotika A 3823) je známý dle US patentu č. 3 501568. Příprava je založena na fermentaci kmene Streptomyces cinnamonensis ATCC 15 413 za submersních aerobních podmínek v kultivačním prostředí, které obsahuje asimilovatelné zdroje uhlíku, dusíku a dále anorganické soli.

V popisu citovaného vynálezu není uvedena výtěžnost nárokovaného postupu, ale v získaném komplexu převládají faktory A a B (příklad 4). Po zdlouhavé chromatografii na sloupci silikagelu (450 frakcí) lze získat 40 % faktoru A v čistém stavu, kdežto 50 % téhož komplexu se eluuje jako směs faktorů A a B.

Antibiotická účinnost faktoru A vůči Bacillus subtilis je více než dvojnásobně vyšší v porovnání s aktivitou faktoru B. Kokcidiostatická účinnost jednotlivých faktorů není známá, ale podle předběžného testu je účinnost faktoru A vyšší i v tomto případě. Proto je výhodné fermentovat produkční kmen za podmínek, při nichž se tvoří převážně faktor A, aniž se sníží biosynthetická aktivita kmene.

Produkční kmen roste dobře na živných půdách, které obsahují asimilovatelné zdroje uhlíku a dusíku, jako jsou mono- a polysacharidy včetně jejich hydrolyzátů, melasa, amonné soli, dusičnany, aminokyseliny, močovina, různé typy bílkovinných mouček rostlinného i živočišného původu včetně jejich hydrolyzátů. Živné prostředí obsahuje také minerální soli fosforečnanů, chloridů, síranů a uhličitanů, obsahující draselné, hořečnaté, sodné a vápenaté ionty. Stopové prvky jako kobalt, měd, bór apod. jsou již většinou přítomny v živných složkách kultivačního prostředí jako nečistoty.

Dle citovaného US patentu se uvedený kmen kultivuje buď v submersní aerobní kultuře při 28 ^CC až 38 °C během 3 až 6 dnů nebo až 12 dnů při povrchové fermentaci.

Za těchto podmínek kmen Streptomyces cinnamonensis 179, uložený ve Sbírce mikroorganismů University J. E. Purkyně v Brně pod č. CCM 3504, produkuje monensinový komplex, v němž převládají faktory A a B. Jejich vzájemný poměr se pohybuje v rozmezí 30 až 63 % faktoru A ke 43 až 70 % faktoru B, a to jak při fermentacích v baňkách, tak i v tanku.

Předmětem vynálezu je způsob přípravy monensinu nebo jeho soli, zejména faktoru A, jehož podstatou je, že se kmen Streptomyces cinnamonensis 179 CCM 3504 fermentuje při teplotě 28 °C až 40 °C v submersní kultuře ve třech stupních, a to v prvním stupni na 1. inokulační půdě, která obsahuje ve hmotnostní koncentraci glycerol pepton masový výtažek chlorid sodný až 3 % 0,25 %

0,2 až 0,7 % 0,1 % ve druhém stupni na 2. inokulační půdě, která obsahuje ve hmot. koncentraci glukosu 2 až 6 % sušené pivovarské kvasinky Pangamin 1 % sójovou mouku 0,5 až 2 % uhličitan vápenatý 0,2 % a ve třetím fermentačním stupni na půdě, která obsahuje ve hmot. koncentraci rostlinný olej 2 až 10 % glukosu 1 % sójovou mouku 0,52 % uhličitan vápenatý 0,5 % hydrofosforečnan draselný 0,01 % načež se výsledný produkt izoluje známým způsobem.

Přednost tohoto způsobu spočívá v tom, že složením fermentačních půd a podmínkami fermentace lze připravit monensinový komplex, v němž převládá faktor A a který obsahuje jen velmi nízký podíl faktoru B. Při fermentaci v baňkách byl zjištěn obsah faktoru B nižší než 10 % z celkového obsahu monensinového komplexu. Při fermentaci v poloprovozním tanku za stejných podmínek byl obsah faktoru B ještě nižší.

Jednotlivé faktory A a B byly identifikovány jadernou magnetickou resonancí a hmotovou spektroskopii. Získaná spektra' souhlasí s publikovanými spektry.

Obsah monensinového komplexu ve fermentační půdě, v extraktech apod. se stanoví známou biologickou titrací na agarových plotnách, jako testovací mikroorganismus se používá Bacillus subtilis. Při vyšším obsahu faktoru B v komplexu jsou výsledky stanovení v důsledku nižší citlivosti testovacího mikroorganismu vůči faktoru B nižší než skutečný obsah.

Jednotlivé faktory lze stanovit chromatografií na tenké vrstvě silikagelu. Pro stanovení se používají hotové silikagelové desky pro chromatografii na tenké vrstvě (Silufol — k. p. Kavalier). Chromatogramy se vyvíjejí v soustavě n-heptanoctan ethylnatý-methanol v objemových poměrech 5:4:1. Červené skvrny monensinu se objeví po postříkání chromatogramu vanilinovým činidlem (3 hmot. % vanilinu v ethanolu, který obsahuje 1,5 hmot. % kys. sírové) a následujícím zahříváním na 110 °C. Při vhodně voleném dávkování jak vzorků tak i standordů se docílí přesnosti stanovení odpovídající běžné biologické titraci antibiotik. Na rozdíl cd biologického stanovení monen218032

I sinu nejsou nepříznivě ovlivněny výsledky obsahem faktoru B v komplexu.

Komponenty monensinového komplexu mají lipofilní charakter. Rozpouštějí se snadno v organických rozpouštědlech, ale ve vodě jen nepatrně jak ve formě volné kyseliny, tak i sodné nebo draselné soli. Antibictický komplex monensinu lze získat extrakcí známými postupy, a to jak z filtrátu fermentační kapaliny, tak i z filtračního koláče, který je směsí mycelia a zbytku pevných podílů fermentační půdy. Před filtrací je třeba upravit pH fermentační kapaliny na hodnotu 8 až 9 roztokem sody nebo jiného vhodného neutralizačního činidla. Extrakci z filtrátu lze provést méně polárními rozpouštědly nemísitelnými s vodou (např. chloroformem, octanem ethylnatým, octanem butylnatým apod.) nebo jejich směsí s nepolárními rozpouštědly (alifatickými nebo aromatickými uhlovodíky). Aktivní komplex z filtračního koláče lze také extrahovat organickými rozpouštědly. Vhodnými rozpouštědly jsou např. ethanol, methanol aceton, octan ethylnatý nebo butylnatý. Extrakci lze provést i chlcroformem nebo jeho směsí s některými nepolárními rozpouštědly.

Při fermentaci S. cinnamonensis na půdě s rostlinným olejem obsahuje filtrát fermentační kapaliny zhruba polovinu vzniklého monensinového komplexu. Při extrakci přejde do organické fáze i zbytek oleje, který nebyl metabolizován. Tento olej se z extraktu odstraní po oddestilování rozpouštědla roztřepáním odparku mezi nepolární rozpouštědlo (n-hexan, petrolether apod.J a směs methanolu s roztokem chloridu sodného (10% hmot.) v objemovém poměru 4 : 1. Převážná část aktivního komplexu je po roztřepání obsažena v polárnější tíži (minimálně 80 % celkového obsahu). Z roztoku se získá vytrepáním do chloroformu nebo jeho směsi s tetrachlormethanem a odpařením výtřepku za sníženého tlaku. Získaný odparek obsahuje v závislosti na výši produkce při fermentaci 20 až 50 % aktivního komplexu.

Tento odparek lze bud přímo zpracovat na monensinový premix pro přípravu medikovaných krmiv k výkrmu ve velkochovech, nebo dále čistit. V tomto případě se rozpuštěný odparek nejprve odbarví aktivním uhlím a filtrát se pak dále čistí sloupcovou chromatografií na vhodné stacionární fázi. Výhodná je chromatografie na silikagelu. Jako eluční činidlo se může použít např. benzen, chloroform, octan ethylnatý a jejich směsi s acetonem nebo methanolem.

Průběh sloupcové chromatografie se sleduje výše popsanou chromatografií na tenké vrstvě. Frakce eluátu, které obsahují stejný faktor, se spojí a za sníženého tlaku odpaří. Odparky se podrobí krystalizaci.

Dále jsou uvedeny příklady způsobu přípravy monensinu dle vynálezu.

β

Přikladl

Příprava monensinu kultivací v baňkách Spory produkčního kmene Streptomyces cinnamonnesis 179 se naočkují na šikmý živný agar následujícího složení:

kvasničný	extrakt	4,0 g
sladinoný	extrakt	10,0 g
glukosa		4,0 g
Oxid agar		30,0 g
voda dest.	do	1,0 1

Zacčkovaná půda se inkubuje při 28 °C 10 dnů. Kultura se přenese do 1. inokulační půdy následujícího složení ve hmotnostní koncentraci glycerol 2,0 % pepton 0,25 % masový výtažek. 0,5 % chlorid sodný 0,1 % a třepe se 48 hodin při teplotě 37 °C na rotační třepačce při frekvenci 2,8 Hz. Takto získaným inokulem se očkuje 2. inokulační půda následujícího složení ve hmotnostní koncentraci glukosa 4,0% sójová mouka 1,0 % sušené pivovarské kvasinky Pangamin 1,0 % uhličitan vápenatý 0,2 % ml této půdy v 590 ml varné baňce se očkuje 20 ml 1. inokula. Zaočkovaná půda se třepe 30 hodin při teplotě 37 °C na rotační třepačce při frekvenci 2,8 Hz.

Fermentační půda obsahuje ve hmotnost-

ní koncentraci
sójový olej	2,0	%
glukosu	1,0	%
sójovou mouku	1,0	%
uhličitan vápenatý	0,5	%
hydrofosforečnan
draselný	0,01 %

ml fermentační půdy se očkuje 2 ml 2. inokula. Zaočkovaná fermentační půda v 5C0 ml varných baňkách se kultivuje při 37 °C na rotační třepačce 196 hodin.

Po skončené fermentaci se slije fermentační tekutina a 13 % roztokem sody se upraví reakce pH na hodnotu 8 až 9. Tato směs se filtruje na Buchnerově nálevce. 400 ml filtrátu se extrahuje 200 ml chloroformu a ještě dvakrát 150 ml chloroformu. Spojené extrakty se odpaří za sníženého tlaku a dosuší. Filtrační koláč se suspenduje ve 100 ml methanolu a susnese se’ míchá 1 hodinu. Pak se směs filtruje na Buchnerově nálevce a koláč se promyje malým množstvím methanolu. Koláč se znovu suspenduje v 80 ml methanolu a dále se postupuje jako při první extrakci. Extrakce koláče se ještě dvakrát opakuje. Filtráty se spojí, za sníženého tlaku se oddestiluje rozpouštědlo a odparek se dosuší.

Odparky získané z filtrátu i koláče se rozpustí ve 230 ml methanolu, roztok se smísí se 200 ml 10% vodného roztoku chloridu sodného a směs se extrahuje 200 ml petroletheru. Extrakce se ještě třikrát opakuje. Petroletherové výtřepky se spojí a protřepou čtyřikrát se 200 ml směsi methanolu s 10 % roztokem chloridu sodného v objemovém poměru 4: 1. Vodně — methanolické výtřepky se spojí a smísí s 10% roztokem NaCl, takže výsledná směs obsahuje 40 objemových % roztoku NaCl. Tato směs se extrahuje 430 ml chloroformu a pak ještě 2krát 300 ml chloroformu. Chloroformová vrstva se odpaří a dosuší za sníženého tlaku. Hnědý odparek — 1150 mg — obsahoval podle TLC 24 % monensinu; z toho připadá na faktor B méně než 2,4 %.

Příklad 2

Příprava monensinu ve fermentačním tanku.

1 sterilní 1. inokulační půdy popsané v příkladu 1 se zaočkuje sporovou suspenzí ze Šikmého agaru, která se získá smytím kultury 15 ml sterilní destilované vody. Zaočkovaná půda se míchá v laboratorním fermentoru 48 hodin při frekvenci otáček 10 Hz, teplotě 37 °C a rychlosti vzdušnění 1 1/min. Tato kultura se použije k zaočkování 15 1 2. inokulační půdy, popsané v př. 1, v 35 1 fermentačního tanku. Suspenze se kultivuje 30 hodin při 37 °C, frekvenci míchání 4,66 Hz a rychlosti vzdušnění 8 1/min. Touto kulturou se zaočkuje 135 1 fermentační půdy. Půda obsahuje 5 % sójového oleje, v ostatních složkách je shodná s půdou popsanou v příkladu 1. Vlastní fermentace probíhá 190 hodin při teplotě 37 °C, frekvenci otáček 4,66 Hz a rychlost vzdušnění 50 1/min.

Po skončení fermentace se upraví pH fermentační tekutiny 10% roztokem sody na hodnotu 8 až 9 a pak se půda odstředí na odstředivce (Sharples). Získá se supernatant (95 1) a vlhký pevný podíl (9,9 kg). Supernatant se smísí s 31 1 chloroformu a 9 I tetrachlcrmethanu a směs se míchá frekvencí 5 Hz při 30 °C po dobu 1 hod. Směs se vypustí do separátoru a ponechá stát až se fáze oddělí. Těžší fáze se vypustí do zásobníku a vodná fáze do odpadu. (Ve vzorku vodné fáze nebyl při tenkovrstevné chromatografii (TLC) monensin prokázán). Z oddělení těžší fáze se oddestilují rozpouštědla za sníženého tlaku. Destilační zbytek (asi 2,5 1) se smíchá s 11 1 petrcfetheru a tato směs se extrahuje 5krát 4,5 1 směsi methanolu s 10% roztokem chloridu sodného v objemmovém poměru 4 :1. Vodně-methanollcké extrakty se spojí a promíchají s 5 1 petroletheru. Vrstvy se oddělí a vodně-methanolická se smíchá s 11 1 10% NaCl. Tato směs se dále dvakrát extrahuje 11 1 směsi chloroformu s tetrachlormethanem v objemovém poměru 3:1a potřetí 6 1 stejné směsi. Z těžší fáze se oddestilují rozpouštědla při sníženém tlaku a odparek se dosouší. 111,3 g hnědého odparku obsahovaly 31 % monomensínu. Podle TLC je zastoupen minimálně 95 % faktor A, kdežto faktor B méně než 5 %.

Další část monensinu se získá extrakcí z pevného podílu po odstředění fermentační tekutiny. Ten se suspenduje ve 25 1 methanolu a suspense se míchá 1 hod. Extrakt se odfiltruje a filtrační koláč se ještě dvakrát suspenduje ve stejných objemech methanolu. Filtráty se spojř a za sníženého tlaku se methanol oddestiluje. Destlilační zbytek se extrahuje petroletherem (5X 1,2 1). Petroletherové vrstvy se spojí a e4trahují 5X 2 1 směsi methanolu a 10% roztokem NaCl v objemovém poměru 4 :1. Spojené vodně-methanolické výtřepky se promíchají se 2,5 1 petroletheru. Po ddělení fází se vodně-methanolická vrstva smíchá se 3,5 1 10% roztoku NaCl. Tato směs se pak extrahuje 2X 4 1 a potřetí 2 1 směsi chloroformu s tetrachlormethanem v objemovém poměru 3 :1. Z extraktu se oddestilují rozpouštědla za sníženého tlaku a odparek se dosuší. Uvedeným postupem bylo získáno 119,5 g hnědého odparku, který dle TCL obsahoval 25 % monensinu, z něhož více než 95 % připadalo na faktor A.

Získané odparky lze použít přímo pro přípravu mcnensinového premixu k výrobě medikovaných krmiv pro výkrm ve velkochovech. V případě potřeby lze získat čistý faktor A. Nejprve se rozpuštěný odparek odbarví aktivním uhlím a filtrát se pak dále čistí chromatografií na sloupci silikagelu známým postupem. K eluci se použije postupně chloroform a jeho směs s methanolem. Na základě výsledků chromatografie na tenké vrstvě se spojí frakce, které obsahují žádaný faktor A a z odparku se krystalizací ze směsi n-hexan — chloroform získá čistý produkt.

Claims (2)

1. PŘEDMĚT

   VYNÁLEZU

   Způsob přípravy monensinu nebo jeho solí, zejména faktoru A, vyznačený tím, že se kmen Streptomyces cinnamonensis 179 CCM 3504 fermentuje při teplotě 28 °C až 43 °C v submersní kultuře ve třech stupních, a to v prvním stupni na 1. inokulační půdě, která obsahuje ve hmotnostní koncentraci glycerol pepton masový výtažek chlorid sodný

   1 až 3 % 0,25 %

   0,2 až 0,7 % 0,1 % ve druhém stupni na 2. inokulační půdě, která obsahuje ve hmotnostní koncentraci glukosu 2 až 6 % sušené pivovarské kvasinky Pangamin 1 % sójovou mouku 0,5 až 2 % uhličitan vápenatý 0,2 % a ve třetím fermentačním stupni na půdě, která obsahuje ve hmotnostní koncentraci rostlinný olej glukosu sójovou mouku uhličitan vápenatý hydroíosforečnan draselný
2. 2 až 10 % 1 %

   0,5 až 2 % 0,5 %

   0,01 % načež se výsledný produkt izoluje známým způsobem.