CS217647B1

CS217647B1 - Method and apparatus for anaerobic cultivation of bacteria

Info

Publication number: CS217647B1
Application number: CS543281A
Authority: CS
Inventors: Petr Pospisil; Bretislav Koprivnik
Original assignee: Petr Pospisil; Bretislav Koprivnik
Priority date: 1981-07-15
Filing date: 1981-07-15
Publication date: 1983-01-28

Abstract

Vynález se týká způsobu anaerobní kultivace bakterií v atmosféře kysličníku uhličitého a kysličníku dusného při přetlaku maximálně 70 kPa. Vzduch z kultivačního prostředí se vytěsní kysličníkem uhličitým a ten se následovně smísí s kysličníkem dusným. Zařízení pro tento způsob kultivace se skládá z tlakové nádoby s těsnicím víkem, v němž je umístěn kohout pro vypouštění plynu, ventil pro napouštění plynu, manometr, bakteriologický filtr, uvnitř tlakové nádoby je umístěn vyjímatelný stojan na kultivační misky a těsnicí víko nádoby je uchyceno pružinovými držáky. Vynálezu je možno použít ve zdravotnických zařízeních, školách, mikrobiologických ústavech.The present invention relates to a method for anaerobic cultivation of bacteria in an atmosphere of carbon dioxide and nitrous oxide at an overpressure of at most 70 kPa. The air from the culture medium is displaced by carbon dioxide and then mixed with nitrous oxide. The device for this type of cultivation consists of a pressure vessel with a sealing lid, in which a gas tap is located, a gas inlet valve, a manometer, a bacteriological filter, a removable culture dish rack is placed inside the pressure vessel, and the container lid is fixed by spring holders. The invention can be used in healthcare facilities, schools, microbiological institutes.

Description

Vynález ss týká anaerobní kultivace bakterií, která se v současné době věnuje zvýšená pomíínoiSt, protože podíl anaerobů v klinickém materiálu, v potravinách i ve vodách .stále stoupá. Dosaivadní možnioisti anaerobní kultivace jsou u převážné většiny bakteriologických pracovišť neuspokojivé.The present invention relates to anaerobic cultivation of bacteria, which is currently increasingly involved since the proportion of anaerobes in clinical material, food and water is increasing. So far, anaerobic cultivation potential is unsatisfactory in most bacteriological sites.

Anaerobní kultivace je dosud prováděna v anaerostatech zahraniční výroby nebo tuzemské výroby. Tyto přístroje umožňují kultivaci v podmínkách anaerobního prostředí, které lze dosáhnout dvojím způsobem.Anaerobic cultivation is still carried out in anaerostates of foreign production or domestic production. These devices allow cultivation under anaerobic conditions that can be achieved in two ways.

Princip prvého způsobu spočívá ve vytvoření silného podtlaku, čímž je z přístroje odstraněna větší část vzduchu, a anaerobní podmínky jsou upraveny dodatečným vpravením inertního plynu, nejčastšji kysličníku uhličitého nebo dusíku, buď napuštěním z tlakové plynové bomby, nebo vyvíjením kysličníku uhličitého chemickou cestou, například hořením svíčky, reakcí uhličitanů s kyselinami a podobně.The principle of the first method is to create a strong vacuum, which removes much of the air from the apparatus, and the anaerobic conditions are adjusted by additionally introducing an inert gas, most commonly carbon dioxide or nitrogen, either by impregnation from a pressurized gas bomb or developing carbon dioxide by chemical means, candles, reaction of carbonates with acids and the like.

Princip druhého způsobu spočívá v chemickém vyvíjení kysličníku uhličitého a vodíku, přičemž je přítomný kyslík z prostředí odstraněn katalytickou cestou, například pomocí totalyzátoru s paládiem (systém OXOID).The principle of the second method consists in the chemical evolution of carbon dioxide and hydrogen, whereby the oxygen present is removed from the environment by a catalytic route, for example by means of a palladium catalyst (OXOID system).

Kromě uvedených principů byly v minulosti používány i jiné způsoby, například společná kultivace obligátně aerobních a anaerobních bakterií, kdy byl kyslík nejprve spotřebován růstem aerobních bakterií a teprve potom mohlo dojít k růstu anaerobů, nebo se používaly chemické látky, schopné prudké oxidace, během níž byl přítomný kyslík spotřebován, například pyrogalol a podobně. Tyto metody se však neosvědčily a v současné době se jich většinou neužívá.In addition to these principles, other methods have been used in the past, such as co-cultivation of obligatory aerobic and anaerobic bacteria, where oxygen was first consumed by the growth of aerobic bacteria and only then anaerobes could grow or chemicals capable of violent oxidation were used. the oxygen present is consumed, for example pyrogalol and the like. However, these methods have not worked well and are currently not widely used.

U principů, pracujících s podtlakem, je nutno kultivovat Petriho misky dnem dolů, protože při správné poloze, tj. dnem vzhůru, při níž nedochází k sekundární kontaminaci, se v podtlaku odchlypuje živné agarové médium. Bakteriální buňky jsou silným podtlakem částečně poškozovány, protože se při laboratorní teplotě prudce odpařuje voda. Zařízení, pracující s podtlakem, vyžaduje vybavení pracoviště výkonnou vývěvou a tlakovou plynovou bombou s CO2 a Nz, které musí být z bezpečnostních důvodů umístěny zvlášť. Při vakuaci dochází k silnému tvoření vodních par, které pak během kultivace kondenzují na stěnách přístroje a Petriho miskách, čímž zvyšují riziko kontaminace média a zvyšují i riziko bezpečnosti práce u patogenních kultur. Nevýhodou systému pracujícího s chemickým vyvíjením kysličníku uhličitého a vodíku je riziko vzniku třaskavého plynu, takže je nutno pracovat v prostředí bez otevřeného plamene. Na riziko požáru upozorňuje sám výrobce tohoto zařízení.For vacuum-operating principles, Petri dishes must be cultivated bottom-down, because at the correct position, i.e. upside-down without secondary contamination, nutrient agar medium is degassed under vacuum. Bacterial cells are partially damaged by strong negative pressure because water evaporates vigorously at room temperature. Vacuum-operated equipment requires the workstation to be equipped with a powerful vacuum pump and a CO2 and Nz pressure gas bomb, which must be placed separately for safety reasons. Vacuum generates strong water vapor, which then condenses on the walls of the instrument and Petri dishes during cultivation, increasing the risk of contamination of the medium and increasing the risk of occupational safety in pathogenic cultures. The disadvantage of a system working with the chemical evolution of carbon dioxide and hydrogen is the risk of gas formation, so it is necessary to work in an open flame environment. The manufacturer of this equipment is aware of the risk of fire.

Uvedené nedostatky odstraňuje způsob kultivace anaerobních bakterií podle vynálezu, který spočívá v tom, že se anaerobní bakterie kultivují v atmosféře kysličníku uhličitého a kysličníku dusného při přetlaku max 70 kPa. Vzduch z kultivačního prostředí se vytěsní plynem o specifické váze vyšší než vzduch, například kysličníkem uhličitým, ten se následně promyje kysličníkem dusným. Zařízení k výše uvedenému způsobu kultivace se skládá z tlakové nádoby s těsnicím víkem, v němž je umístěn kohout, manometr a ventil pro napouštění inertního plynu, jemuž je předřazen bakteriologický filtr, a uvnitř tlakové nádoby je umístěn vyjímatelný stojan na Petriho misky. Těsnicí víko nádoby je zajištěno pružinovými uzávěry, které dovolí regulovat přetlak plynu v tlakové nádobě a umožňují odpouštění vzduchu a ostatních plynů.The aforementioned drawbacks are overcome by the method of cultivation of anaerobic bacteria according to the invention, which comprises culturing anaerobic bacteria in an atmosphere of carbon dioxide and nitrous oxide at an overpressure of max. 70 kPa. Air from the culture medium is displaced by a gas of a specific weight higher than air, for example carbon dioxide, which is subsequently washed with nitrous oxide. The apparatus for the above-mentioned cultivation method consists of a pressure vessel with a sealing lid, in which a cock, a pressure gauge and an inert gas impregnation valve are placed, which are preceded by a bacteriological filter, and inside the pressure vessel is a removable petri dish rack. The sealing lid of the vessel is secured by spring-type closures which allow to regulate the overpressure of the gas in the pressure vessel and allow the release of air and other gases.

Práce s anaerostatem je velmi jednoduchá a bezpečná. Po vložení naočkovaných Petriho misek (dnem vzhůru) se anaerostat ventilu pro napouštění plynu se vpustí z bombičky kysličník uhličitý. (Bombičky jsou běžně v prodeji.] Vpouštěný plyn prochází přes rozptylovací komoru s vatovým bakteriologickým filtrem. Rozptylovací komora zabraňuje bodovému náporu vpouštěného plynu a současně zachycuje větší část bakteriální kontaminace plynů. Víko je upevněno k vlastní nádobě s pružinovými držáky, které zastávají současně funkci redukčního ventilu, konstruovaného k udržení požadovaného přetlaku 60 až 70 kPa. Nadbytečný přetlak se při napouštění inertního plynu z bombičky automaticky odpustí. Přetlakem je z anaerostatu vytlačen vzduch, který unikne pod těsněním víka. Vytěsnění vzduchu je umožněno jednak větší specifickou hmotností kysličníku uhličitého, jednak větší hustotou, způsobenou rozdílem teplot vzduchu a napouštěného kysličníku uhličitého. (Rozdíl činí až 30 °C.) Zbylý přetlak, cca 60 kPa se odpustí pomocí pružinového držáku a anaerostat se z bombičky s kysličníkem dusným naplní stejným způsobem. Pro vlastní kultivaci se konečný přetlak pružinovým držákem upraví na 20 až 30 kPa. Tím je přístroj připraven ke kultivaci. Poměr plynů CO2 : N2O je 1: 2.Working with anaerostat is very simple and safe. After inserting the inoculated Petri dishes (upside-down), the anaerostat of the gas inlet valve is injected from the cartridge with carbon dioxide. (The cartridges are commercially available.) The inlet gas passes through a dispersion chamber with a cotton wool bacteriological filter. The dispersion chamber prevents point inlet of the inlet gas and at the same time detects most of the bacterial gas contamination. Valve designed to maintain the required overpressure of 60 to 70 kPa The excess overpressure is automatically vented when the inert gas is infused from the cylinder. (the difference is up to 30 ° C.) The residual overpressure, about 60 kPa, is released by means of a spring holder and the anaerostat is discharged from the duoxide cylinder. For the actual cultivation, the final overpressure of the spring holder is adjusted to 20 to 30 kPa. This makes the machine ready for cultivation. The CO2: N2O ratio is 1: 2.

Během manipulace není třeba přístroj přenášet z místnosti, odpadá potřeba výkonné olejové vývěvy, lze pracovat přímo v terénu, odpadá potřeba elektrické energie, velkých plynových lahví. V kultivačním přetlaku se netvoří nadbytečná vodní pára, kultivaci lze provádět v poloze dnem vzhůru. Kolonie rostou izolovaně, netvoří povlaky. Přístroj nahrazuje dovážené anaerostaty, včetně dovážených chemikálií a paládiového katalyzátoru. Zvyšuje bezpečnost práce, zlepšuje dosavadní podmínky anaerobní kultivace, šetří náklady na pořizování vývěvy, instalačních prací při provozování velkých plynových lahví. Mnohonásobně práci urychluje (uzavření anaerostatu a příprava ke kultivaci trvá cca 2 min.). Přístroj lze použít i k přepravě materiálu určeného k anaerobní kultivaci do laboratoří.It is not necessary to move the device from the room during manipulation, there is no need for a powerful oil pump, it is possible to work directly in the field, there is no need for electricity, large gas cylinders. Excess water vapor does not form in the overpressure, the cultivation can be performed in the upside position. Colonies grow isolated, do not form coatings. The device replaces imported anaerostats, including imported chemicals and palladium catalyst. It increases the safety of work, improves the existing conditions of anaerobic cultivation, saves the cost of the pump, installation work in the operation of large gas cylinders. It speeds up the work many times (closing of the anaerostat and preparation for cultivation takes about 2 minutes). The device can also be used to transport material for anaerobic cultivation to laboratories.

Na výkresu je schematicky znázorněno zařízení pro anaerobní kultivaci bakterií. Je tvořeno tlakovou nádobou 1 z umělé hmoty s obsahem asi 2 litry s umělohmotným těsnicím víkem 2, v němž je umístěn výpustný kohout 3, manometr 4, napouštěcí ventil 5 pro napouštění inertního plynu (kysličník uhličitý a kysličník dusný), z malých tlakových bombiček na domácí výrobu sifonu a šlehačky. Při napouštění plyn prochází bakteriologickým filtrem 8. Uvnitř tělesa anaerostatu je umístěn vyjímatelný stojan 6 na 10 Petriho misek s průřezem 10 cm. Přístroj má jištění proti přetlaku většímu než 100 kPa. Jištění je zajištěno pružinovými uzávěry 7, které dovolí odpustit větší přetlak a dále zajišťují dokonalý přetlak těsnicího víka 2. Provozní tlak v nádobě 1 je 30 kPa.The drawing schematically shows an apparatus for anaerobic cultivation of bacteria. It consists of a plastic container 1 containing about 2 liters with a plastic sealing lid 2, in which a drain cock 3, a pressure gauge 4, an inlet valve 5 for filling inert gas (carbon dioxide and nitrous oxide), from small pressure cylinders home made siphon and whipped cream. The gas is passed through the bacteriological filter 8 during the filling process. Inside the anaerostat body there is a removable rack 6 for 10 petri dishes with a cross-section of 10 cm. The device is protected against overpressure greater than 100 kPa. The locking is provided by spring-type closures 7, which allow a higher overpressure to be released and further ensure a perfect overpressure of the sealing cover 2. The operating pressure in the vessel 1 is 30 kPa.

Se zařízením se pracuje následovně. Do anaerostatu se vloží naočkované Petriho misky dnem vzhůru. Nádoba se uzavře a pomocí otočné rukojeti se vpustí obsah bombičky s kysličníkem uhličitým. Kysličník uhličitý je dodáván v přečištěném stavu (pro potravinářské účely j, nemá proto vedlejší baktericidní nebo bakteriostatické účinky. Protože je cca l,5krát těžší než vzduch, vytvoří přetlak s tím, že vzduch vytlačí do horní části anaerostatu. Po 5 minutách se přetlak s anaeirOstatu plynovým kohoutem vypustí a kohout se opět uzavře. Tím se z anaerostatu vypudí převážná část původního vzduchu. Z bombičky s N2O se anaerostat naplní přetlakem N2O, který se částečným odpuštěním tenze plynu upraví na 30 kPa. Tím je anaerostat připraven k inkubaci. Anaerostat je konstruován s dostatečnou bezpečnostní rezervou na přetlak, navíc je víko uchyceno pružinovými držáky, které fungují jako pojistný ventil.The device is operated as follows. Place inoculated petri dishes upside down in the anaerostat. The container is closed and the contents of the carbon dioxide cartridge are injected using the rotary handle. Carbon dioxide is supplied in a purified state (for food purposes it does not have any bactericidal or bacteriostatic side effects. Because it is about 1.5 times heavier than air, it generates a positive pressure by expelling air to the top of the anaerostat. The anaerostat is evacuated from the anaerostat, leaving most of the original air out of the anaerostat, and the anaerostat is filled with N2O overpressure which is adjusted to 30 kPa by partially relieving the gas pressure, making the anaerostat ready for incubation. designed with sufficient safety margin for overpressure, in addition, the lid is fixed by spring holders, which act as a safety valve.

Claims

A method for culturing anaerobic bacteria, characterized in that the anaerobic bacteria are cultured in an atmosphere of carbon dioxide and nitrous oxide at an overpressure of at most 60 kPa.

2. A method according to claim 1, characterized in that the air from the culture medium is displaced by a gas having a specific weight higher than air, for example carbon dioxide, which is subsequently mixed with nitrous oxide.

3. Apparatus according to items 1 and 2, characterized by:

OF THE INVENTION consists of a pressure vessel (1), with a sealing cap (2), in which a drain cock (3j), a pressure gauge (4J) and an inlet valve (5j, preceded by a bacteriological filter (8), are located inside the pressure vessel a removable rack (6) for the Petri culture dishes is placed in the container (1) and the sealing lid (2) of the container (1) is fixed by spring holders (7).

Device according to claim 3, characterized in that the inlet valve (5) and the drain cock (3) are coupled.