CS217458B1 - Sposob přípravy merkaptohydroxypropylcelulózy - Google Patents

Abstract

Podstata vynálezu spočívá v tom, že celulóza o 5 až 15 % vlhkosti sa v prvom stupni katalyticky éterifikuje epichlórhydríinom pni tepláte 80 až 95 °C po dobu 2 až 4 hold pri molových pomeroch andydroglukózové jednotky celulózy: epichlórhydrín: kyselina ohlořistá alébo kyselina chlorovodíková 1 :3 až 5 : 0,03 až 0,04, načo v drulhom stupni sa reakciou s tiosíranom sodným alébo reakoiou s hydroxidom sodným a s tiosíranom sodným prevedie na tiosulfátohydroxypropylcelulózu, ktorá sa v trefám stupni redukuje tiolmi vo vodných tlmivých roztokách. Vynález má použitie pri izolovaní a čistění enzýmov a bielkovín obsahujiúcioh tiolové skupiny, purdfikácii peptidov, syntetizotvaní ladsorbentov pre afinitou éhromattografiu, redufccii dísulfídických vazieb v bielkovináéh, reverzibilnom imobilizovaní enzýnaov prostrédníétvom ich cysteínovýoh zvyškov a to v priemyselnej praxi alebo vo výskume.

Description

2

Vynález sa týká spósobu přípravy mer-kaptohydroxyípropylcelulózy, vlhiodnej previacúčelové použitie v enzýmovom inžinier-stve. O výroame vodonerozpustnýtíh nosioov ob-sahu jíúcich tiolové skupiny sa pojednalo užpři přípravě merkaptódeoxycelulózy. Estelepšie vlastnosti z hfadiska ich uplatneniav enzýmovom inžinierstve móžu mať polytio-ly, u ktorých sfú SH-sfcupiny naviazané namatriou prostredníctvom „mostika“ (spacera),napař, v případe merkaptoíhydroxypropylcélu-lózy by to bol hýdroxypiropylový móstik, Ta-kýto derivát agarózy dodává Pharmacia FineChemicals, Uppsala (Švédsko) pdd označenímThiopropýl-Sepiharose 6,B (v cene 357 švéd-ských korun za 10 g).

Postup přípravy toihto derivátu, vyohádza-jiúci z přípravy oxirámového derivátu a použí-vajiúci váčsimu chemikálií z devizového dovo-zu, nie je vhodné u celulózy použiť (čs. AOč. 201 363). Lepšie možnosti dává kyslo ka-talyzovaná éteirifikácia celulózy l-chlóro-2,3--epoxypropánom (epichlórlhydrínom) za použi-tia fiuorolboritnýdh fcatalyzátorov. Slú tu všakurčité obmédzenia z hradiska možností výbě-ru celulózy (P. Gemeiner, J. Zemek, Coileiot.Czečh. Cheim. Commun., V 46 (1981)). Tentonedostatok, pri zachovaní dobrých konverzií,odstraňuje použitie lanorganických kyselin(HCIO4, HC1) ako „kyslýdh“ katalyzátoróv.Velkým přínosům je tu hlavně možnost po-užitia mafcro- O H+ Z\ (íceLOH + CH2-CHCH2CI — -> cd^OCH2GH'(OH)CH2Cl (1))poiréznej perlovej celulózy, ktorá má nespor-né výhody oproti tradičným celulózovým ma-teriálom (ČS. AO '20il 363; čs. AO č. 206 346 a čs. AO č. 206 378). V ďalšom postupe je najvýhodhejšou cetetacez tiosulfátové deriváty, v tomto případereakciou ohlórhyldroxypropylcelulózy s tiosí-ranom sodným (čís. AO č. 203 818) za vznikutiosulfátohýdroxypropylceiulózy. O niečomenšie konverzie dává příprava tiosulfáto-vého derivátu cez oxirán. Postup je všakenergeticky menej náročný. Redukcia tiosul-fátovýdh derivátov tiolmi sa používá tak pripřípravě Thioprópyl-Seplharoise 6B ako ajmerkaptódeoxycelulózy.

Uvedené nevýhody odstraňuje předmětnývynález, ktorého podstata spočívá v tom, žev prvom stupni sa katalyticky éterifikuje ce-lulóza o 5 až 15 % vlhkosti epichlórlhydrínompni teplote 80° až 95 °C po dobu 2 až 4 hodpni molových pomerodh anhydroglukózovéjednotky celulózy: epichlórhydrím: kylselinachloristá alebo kyselina chlorovodíková 1:3 až5 : 0,03 až 0,04, načo v druhotní stupni isa reak-ciou s tiosíranom sodným alebo reakcious hýdroxidom sodným a s tiosíranom sodnýmprevedie na tiosulfátohydroxypropyleelulózu,ktorá sa v treťom iStupni redukuje tiolmi vovoldných tlmivých roztokoch.

Uvédený spólsob kyslo katalyzovanej éteri-fikáciie umožňuje použiť tak tradičné formy celulózy (prášková, vláknitá 'či miknokryěta-lická), ich sieťované modifikácie či makrcpo-réznu perloviú celulózu. Najreaktívnejšou for-mou je epichlórhydrínom sieťovaná práško-vá celulóza i(P. Gemeiner et al., Collect. Czech.Ghem. Commun. 45, 2847 (1980)). U nej sadosahuje pri najnižšej teplote (80 °C) najvyšší(stupeň sulbsti/túcie (DSCi = 0,67). Perlová ce-lulóza vyžaduje před použitím odstránenievody, najlepsiie equilibráciou v acetone a po-tom éteri (J. Peška et al., Cell. Chem. Technol.21, 419 (1978)). Výměna chlóru za tiosulfátové skupiny vy-žaduje teplotu 95° až 105 °C po dobu 15 až60 hodin a to podfa obsahu chlóru. Pri postu-pe „cez oxirány“ stačí ižbová teplota a krat-šie doby reakci!; v 1. stupni 1 hod., v 2. stup-ni 6 až 16 hod. Ak je matrioou napr. sie-ťovaná celulóza, pri priamej výměně sazabuduje 8,74 % síry, pri postupe „cez oxi-ráin“ 8,15 % síry. Z hradiska celkovej konver-zie na merkapitohydroxyprOpylcelulózu súvýhodnějšími matricami perlová i(2*9,3 %) aprášková (19,4 %) celulóza, u ktorých sa do-sahuje aj vyšší obsah SH-skupín (0,43 relsp.0,33 mmólov SH/g). Rédufcciia tiósulfátových derivátov tiolmi vovodných tlmivých roztokoch je účinnejšiav alkalickéjšom prostředí (pH 9), tu je všakpotřebné použiť aj účinnu ochrannú reagen-oi-u na tioly, napr. tri-n-ibutylfolsfín. Pokial’ niesú vysoké nároky na obsah SHiskupín v ko-nečnom produkte, stačí pracovat v pH 8 apoužiť lacnéjší Chelaton 3 a kys. tioglyfco-lóvú. Výhodou navrhovaného spósobu přípravymerkaptohýdroxypropylceiulózy je, že umož-ňuje vyrábať preparáty z domácích lacnýchisurovín pomeme jednoduchým technologic-kým postupom. Příklad 1 K 9 g vysušenéj celulózy sa přidalo 1,6 mlvódy a 17,6 ml epiohlórhydrínu, 30 min samiešalo pri izbovej teplote a přidalo sa počastiačh 0,2 ml 60 % kýseliny cihloristej.SuSpenzia sa udržiavala 3 hod. pri teplote95 °C za občasného premiešania. Produkt(8,6 g) sa premyl vodou a acetánom; obsa-hoval 4,6 % Chlóru. 5 g tejto chilórhydroxy-propylcelulózy sa résuspendovalo v 15 ml 4,4M ůósíranu soidnéhó a udržiavalo 15 hod pritéplote 100 QC za Občasného premiešania. Poipremýtí védou a acetónom produkt (4,95 g)Obsahoval 4,05 % síry. Tento sa resuspendo-val v 27 ml 50 mM tetraboritanu sodného ob-sahuj úceho 1,15% v/v tributylfosfín, přidalosa 3,7 ml 2-merkaptoetanolu a po upravenípH na 9 sa 30 min suspenzia miešala pri iz-bovej teplote a pH 9. Produkt (4,3 g) sa rých-lo premyl 1 mM Chelatonom 3, vodou a ace-tónom; obsahoval 2,3 % síry a 0,33 mmólovSH-skupín/g. Příklad 2

Chlórhydroxypropylceliulóza (11,9 g; 10,6 % chlóru) sa připravila postupom podfa príkla-

Claims (1)

1. 3 du 1, s tým roíždielom, že sa použila sletovanáprášková celulóza stupeň sieťovania = 10 na-pučlavací objem 3,6 ml vody/g a teplota 80 °C. 5 g tohto medziproduktu sa suspendovalov 15 ml 20 M tioisíranu sodného a udržiavalo40 hod pri teplote 100 °C za Občasného pre-mniešania. Po premytí vodou a acetonem pro-dukt (5,25 g) obsahoval 8,74 % síry. Po jehoresuspend ování v 51 ml 50 mM tetralboritanusodného obisahujiúcého 1,2 v/v tributylfoisfínusa přidalo 9 ml Ž-merkaptoetanolu a po upra-vení pH na 9 sa sulslpenzia miešala 30 mim piriizlbovej teplote a pH 9. Produkt (4,45 g) sapremyl rýchlo 1 mM Ghelatonom, vodou alacetónom: obsahoval 5,8% síry a 0,19 mmó-lov SH-iskupm/g. Příklad 3 Chlorohydroxypropyl-sieťovaná celulóza (5g) připravená postup om podlá příkladu 2 samiešala s 5 m!l 0,485 M hydroxidom sodným1 hod pri izlbovej teplote, premyla vodou, 50ml 2,3 M tioisíranu sodného v 0,5 M fosfáto-vém pufri pH 6,3 a odsala. Po resuispendo-vaní v 2,3 M tiosírane sodnom v 0,5 M fos-íátovotm pufri pH 6,3 (25 m'l) sa miešialo ceznoc (16 hod) pri izbovej teplote, premylo vo-dou, aceton om a odsálo. Produkt (5,7 g) olb-sáhujúci 8,15 % síry sa resuspendoval v 53ml 50 m'M tetralboritanu sodného obsahujú-ceho 1,2 % trilbutylfosfínu, přidalo sa 9,25 ml2-merkapltoetanolu a po upravení pH na 9sa suspenzia miešala 30 min pri izbovej teplo-te a pH 9. Produkt (4,45 g) sa rýchlo premyl1 mM Ghelatonom 3, voidou a acetonem: ob-sahoval 5,07 % síry a 0,16 mmólov SH-isku-pín/g. Příklad 4 Chlórhydroxypropyl-perlová celulóza (32,6g, 6,0 % chlóru) sa připravila postupem po-dlá příkladu 1, s tým rozdielom, že sa použilo 9,55 g vzdudboísuchej perlovej celulózy, pred-tým vysušenej aoetónom a éterem, přidalosa 1,05 ml vody a teplota bola 90 °C. 14,5 godsátého medziproduktu sa pomaly premylo PREDMET Spósob přípravy merkaptohýdroxyprqpyl-celulózy vyznačený t ý m, že celulózao 5 až 15 % vlhkosti sa v prvom stupni ka-talyticky éterifikuje epiohlórhydrínom priteplote 80 až 95 °C po dobu 2 až 4 hod primolových poměrech anhydreglukózové jed-notky celulózy: epichlórhydrín: kyselina ohlo- 5,7 M tiosíranom sodným (250 ml), odsáloa resulspemdovalo v 30 ml tohto istélho roz-toku tioisíranu. Suspenzia sa udržiavala 20ihoid pri 100 °C za občasného premiešiamia,produkt (13,7 g) sa premyl vodou a odsál;obsahoval 7,8 % síry. Po rýchlom premytí50 mM tetraboritaniom sodným (200 ml) saznovu odsál a resuspendoval v 50 mM tetra-boritane obsahu,jiúicom 1,2 % v/v tributylfos-fín (38 ml), přidalo sa 7,5 ml 2-merkaptoeta-nolu a po upravení pH na 9 sa suspenzia 30min miešala pni izbovej teplote a pH 9. Pro-dukt (11 g) sa premyl 1 mM Ghelatonom 3 a0,1 M kyselinou octovou obsahujiúcou 1 mMGhelaton 3, v ktorej sa aj skladoval pri 4 °C.Produkt obsahoval 5,1 % síry a 0,43 mmólovSH-lskupín/g sudhej váhy. Příklad 5 Postup práce podlá příkladu 2, s tým roz-dielom, že sa ako katalyzátor přidala konc.kyselina chlorovodíková (0,4 ml) a éterifiká-cia epichlórhydríinom sa. viedla 4 hod. Mer-kaptohydroxypropyl-sieťovaná celulóza obsa-hovala 2,32 % síry a 0,075 mmólov SH-sfcu-pín/g. Příklad 6 Postup podlá příkladu 1, s tým rozdielom,že pri redukcii tiosulfátohydroxypropyl-práš-kovej celulózy sa použilo 4,2 ml 80 % kyse-liny tioglyfcolovej, 50 mM tetráboritan sodnýobsahoval 1 mM Chelaton 3 a pH sa udržia-valo na 8. Produkt obsahoval 2,4 % síry a0,25 mmólov SH-skupín/g. Vynález má uplatnemie všade, kde je po-třebné izolovat alebo čistit enzýmy a iné biel-koviiny obsahujúce tiolové skupiny, izolovatnízkomolekulové tiolové zlúčeniny, puntíko-vat (syntetické) peptidy, syntetizovat adsor-benty pre afínitnú chromatografřu, redukovatdisulfidické vazby v bielkovináoh, reverzábil-ne imobilizovať enzýmy prostredníctvom iclhcysteínových zvyškov a to či už v priemysel-nej praxi alebo vo výskume. tristá alebo kyselina chlorovodíková 1 : 3 až5 : 0,3 až 0,04, načo v druhom stupni sa reak-ciou s tiosíranom sodným alebo reakciious hydroxidom sodným a s tiosíranom sodnýmprevedie na tiosulfátohydroxypropylcelulózu,fetorá sa v treťom stupni redukuje ti ohni vovadných tlmivých roztokooh.