CS216767B1 - Způsob přípravy kyseliny 2-deoxy-D-glukonové - Google Patents

Abstract

Vynález se týká způsobu přípravy kyseliny 2-deoxy-D-glukonové biochemickou oxidací 2-deoxy-D-glukoey v systému obsahujícím glukosodenhydrogenázu nebo glukosooxidázu, za průběžného odstraňování kyseliny ze systému neutralizací ve formě soli, a výhodou soli barnaté.

Description

Vynález se týká způsobu pr.. v^avy kyseliny 2-deoxy-D-glukonové /2-deoxy-D-arabino-hexonové/, cukerného derivátu, kterého au používá v biochemii a medicíně při studiu metabolických pochodů, zejména jako kompetitivně působícího strukturního analoga kyseliny D-glukonové.

Kyselina 2-deoxy-D-glukonová se dosud připravovala chemickou oxidací 2-deoxy-D-glukosy bromem nebo jodem. Hlavní nevýhodou tohoto postupu je nízká specifičnost reakce, následkem toho nízké výtěžky a déle obtížné Odstraňování většího množství bromidu nebo jodidu z reakční směsi.

Možnost biochemické dehydrogenace 2-deoxy-D-glukosy byla dosud studována jen a klidovými buňkami, izolovanými po růstu na některém dobře asimilovatelném cukru, dále bezbuněčnými extrakty a enzymovými preparáty, převážně v manometr ických pokusech na Warburgově přístroji, při kterých spotřeba kyslíku nasvědčovala oxidaci v kyselinu 2-deoxy-D-glukonovou u Pseudomonaa aeruginosa /A.K. Williama, R.G.Eagon: J.Bacteriol. 77, 167, 1959/, Aerobacter aerogenes /E.R. Blakley, O.Cifferit: Can.J.Microbiol. 7, 61, 1961/ 'a u plísňové glukosooxidázy /R.B.Mc.Comb se sp.: J.Frenklin Inst. 263, 161, 1957; M.S. FeSther: Biochem. Biophys.Acta 220,127,1970/.

U Acetobacter suboxydana /J.A.Fewster: Biochem.J. 69, 582,1950/ probíhala oxidace až v kyselině

2-deoxy-keto-D-glukonovou/pravděpodobně 5-ketoderivát/, která však dosud nebyla izolována. Tvorba kyseliny 2-deoxy-D-glukonové při těchto pokusech byla dokázána pouze chrometografickou analýzou / viz. Williams a Eagon/, popřípadě izolací miligramových množství z nádobek Warburgova přístroje /viz Blakley a Cifferi/. 2-Déoxy-D-glukoaa však nebyla vhodným zdrojem uhlíku pro růst ?aeudomonae aeruginosa, pokusy o její adaptaci Ua*tento cukr byly bezvýsledné /viz Williams a Eagon; Eagon/, Z uvedeného vyplývá, že.ani jedna ze zmíněných metod není ekonomicky použitelná pro získávání kyseliny 2-deoxy-D-glukonové ve větším měřítku.

Způsob přípravy kyseliny 2-deoxy-D-glukonové biochemickou oxidací 2-deoxy-D-glukosy. ve vodné prostředí, za aerobních podmínek, působením enzymového systému obsahujícího glukosodehydrogenázu nebo glukosooxidázu, řeší vynález, jehož podetata epočívá v tom, že se při konverzi vznikající kyselina 2-deoxy-D-glukonová průběžně odstraňuje ze systému neutralizací ve formě soli, která se izoluje. ₍ '

Neutralizace vznikající kyseliny 2-deoxy-D-glukonové se účelně provádí ve vodě omezeně rozpustným uhličitanem kovu alkalických zemin, a výhodou uhličitanem barnatým nebo vápenatým, přítomným v systému od počátku konverze.

Uvedené opatření, tj. neutralizace, umožňuje použití vysokých, ekonomicky výhodných koncentrací 2-deoxy-D-glukoey, aniž by se enzymatická oxidační reakce zastavila působením snižující se hodnoty pH.

Jako zdroj glukosodehydrogenázy mohou sloužit bakterie Pseudomonaa aeruginosa, kultivované za aerobních podmínek ve vodném prostředí, obsahujícím zdroje asimilovatelného uhlíku a dusíku a minerální živné sole; jako zdroje glukosooxidázy lze použít plísně Aspergillus niger, kultivované za aerobních podmínek ve vodném proatředí, obsahujícím zdroje asimilovatelného dusíku ja dalších živin, popřípadě enzymového preparátu obohaceného glukosooxidázou, dodávaného výrobci S>od různými obchodními názvy.

V průběhu pokusů, kterými ae^řhledaly optimální podmínky pro přípravu kyseliny 2-deoxy-D-glukonové, byly ověřovány různé mikroorganismy. Octové bakterie /Acetobacter gluconicua,

Acetomonaa oxadana/ vytvářely směs kyseliny 2-deoxy-D-glukonovéa jejího ketoderivátu, při použití plísně Aspergillus niger byly výtěžky nižěí.

Byl proto zkoušen kmen Pseudomonaa aeruginosa, o němž bylo již z dřívějška známo, že při růstu na půdách, obsahujících D-glukosu i ve vysokých koncentracích a činidlo neutralizující primárně vznikající kyselinu D-glukonovou, vytvářel a hromadil 2-keto-D-glukonan. Při jeho působení na 2-deoxy-D-glukosu nedochází ke změně na uhlíku v poloze 2 a vzniká kyselina 2-deoxy-D-glukonová ve vysokém výtěžku. Při použití vhodného kmene a podmínek fermentace, tj. koncentrace, přísady dobře asimilovatelného cukru, například D-glukosy, jako induktoru růstu /2-deoxy-D-glukosa není vhodný zdroj uhlíku pro růst Pseudomonaa aeruginosa/ a vzdušnění, je možno dosáhnout úplné konverze v krátké době. Vznikající kyselina 2-deoxy-D-glukonovou je ovšem nutno neutralizovat, j8k již bylo zmíněno, nejjednodušeji přísadou málo rozpustného uhliěitanu, například vápenatého, horečhatého, barnatého, manganatého nebo železnatého, a to přímo do férmentační půdy, aniž by uvolněné kaťionty působily v používaných koncentracích na kulturu toxicky, a připravovat tak přímo příslušnou sůl. Neutralizaci je možno provádět také automatickým přidáváním roztoku hydroxidu alkalického kovu nebo rozpustného uhličitanu apod., v závoslosti na průběžáě meřené hodnotě pH. Vzhledem k dobré krystalizační schopnosti byl nejčastěji připravován a izolován 2-deoxy-D-glůbnaart barnStýjdza kterého je kromě toho možno pohodlně připravit volnou kyselinu. Výtěžky této izolované soli dosahují 75 a.ž 80 % teorie při fermentaci 5 %ní půdy a době fermentace 2 až 3 dny. “ejvyšší udávaný výtěžek při oxidací bromem je 58 % teorie.

Působením glukosooxidázy, obsažené v obchodním enzymovém preparátu s účinností 750 j/ml, byla 2-deoxy-D-glukosa v 5 $ním roztoku zcela konvertována během 1 dne v sůl kyseliny 2-deoxy-D-glukonové. Izolace produktu však byla ztížena bslastními látkami cukerné povahy, přítomnými v enzymovém preparátu.

Některé možnosti realizace způsobu podle vynálezu jsou uvedeny v následujících příkladech provedení, které vynález pouze ilustrují, ale nijak neomezují.

Příklad 1

Kultura kmene Pseudomonaa aeruginosa IHE Ps 5/40 byla udržována přeočkováním na šikmé agarové půdě, obsahující 5 g D-glukonanu vápenatého, zfiltroyaný autolyzét z 2,5 g pekařského droždí a 2,5 g agaru ve 100 ml. Dva dny starou kulturou byla zaočkována půda /2,5 ml/, která obsahovala 2 g D-glukonanu vápenatého, 0,2 g D-glukosy ve 100 ml a stejné množštví kvasničného autolyzátu jako výše. Po zaočkování byla půda kultivována 1 den na reciproké třepačce, pak byla použita k zaočkování 100 ml sterilní půdy, která obsahovala 5 g 2-deoxy-D-glukosy, 0,2 g D-glukosy, zfiltrovený autolyzát z 0,5 g droždí, 0,2 g hydrogenfosforečnanu amonného, 0,1 g dihydrogenfosfořečnanu draselného, 0,025 g sířenu hořečnatého a 6 g uhličitanu barnatého sterilizovaného zvláší. Kultivace probíhala v 500 ml varných baňkách, uzavřených vatovými zátkami, na třepacím stroji při teplotě 30 °C. Po 3 dnech kultivace byl chromatografickou analýzou dekationizovaného filtrátu zjištěn obsah pouze kyseliny 2-deoxy-D-glukonové, redukující cukry nebyly přítomny. Po ukončení kultivace byla půda zahřáta na 80 °C a udržována při této teplotě 30 min., pak byla zfiltrována. Hodnota pH filtrátu byla upravena roztokem hydroxidu barnatého na 9,2, aby se případně přítomné laktony převedly v barnatou sůl a aby se současně odstranil zbytek fosfátů přidaných do půdy.

Malé množství vzniklé sraženiny bylo odfiltrováno a filtrát byl zneutralizován na pH 6,9 opatrným přidáváním katexu v H⁺-formě za míchání. Po odfiltrování katexu byl roztok odpařeh za sníženého tlaku na^objem kolem 20 ml a ponechán při teplotě místnosti do druhého dne. Vykrystalovaná barnatá sůl kyseliny 2-deoxy-D-glukonové byle odsáta, promyta 50 % methanolem a vysušena ve vakuu při 50 °C. Bylo získáno 4,28 g prvního podílu s z matečného louhu po odpaření na malý objem ještě 1,53 β druhého podílu. Celkový výtěžek barnaté soli kyseliny 2-deoxy-D-glukonové byl 5,81 g, tj. 77 % teorie, izolovaná sůl měla odpovídající obsah Ba a krystalická volná kyselina, připrafená z ní působením teoreticky potřebného množství kyseliny sírové, filtrací, zahuštěním s krystalizaci, byla podle t.t., optické otáčivosti a Ič spekter totožná s autentickou, chemicky připravenou kyselinou 2-deoxy-D-glukonovou.

Přiklad 2 nultura kmene Aspergillus niger NRRL 3 byla udržována na sladinovém šikmém agaru. Sporovou suspenzí ze 4 dny staré kultury bálo zaočkováno 100 ml sterilní půdy obsahující 5 8 2-deoxy-D-glukoay, eutolyzát z 2,5 g droždí a 1,75 8 uhličitanu vápenatého sterilizovaného zvlášť.

Po 3 dnech na třepacím stroji při 30 °C pod vatovou zátkou roztok již neobsahoval 2-deoxy-D-glukosu. ^Ao filtraci byl veden sloupcemTcatexu v H⁺-formě o objemu 25 ml s sloupcem anexu v 0H~-formě o objemu 30 ml. Po promytí ionexů vodou byly kyseliny zachycené na anexu eluovány % kyselinou sírovou. Eluát obsahující cukry byl odpařen za sníženého tlaku ne objem asi 30 ml a za tepla zneutralizován pevným uhličitanem barnatým do pH 6,55. Po odfiltrování sraženiny a zahuštění na malý objem vykrystelovel 2-deoxy-D-glukonan barnatý. celkem bylo získáno ve frakcích 1,97 g této soli.

Příklad 3

Směs 0,25 g 2-deoxy-D-glukosy, 0,62 ml obchodního enzymového přípravku glukosooxidázy β aktivitou 750 j/ml a 0,15 g uhličitanu bamatého byla doplněna vodou na objem 5 ml a umístěna v bance uzavřené vatovou zátkou na třepacím stroji /v tomto případě nebylo pracováno za aseptiokých podmínek/. Po 5 h obsahoval roztok ještě výchozí 2-deoxy-D-glukosu, po 24 h byla konverze v kyselinu 2-deoxy-D-glukonovou úplná.

Claims (2)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   1. Způsob přípravy kyseliny 2-deoxy-D-glukonové biochemickou oxidací 2-deoxy-D-glukosy ve vodném prostředí, za eerobních podmínek, působením enzymového systému obsahujícího glukosodehydrogenázu nebo glukoaooxidázu, vyznačující se tím, že ae při konverzi vznikající kyselina 2-deoxy-D-glukonová průběžně odstraňuje ze systému neutralizací ve formě soli, která se izoluje.
2. 2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se neutralizace vznikající kyseliny 2-deoxy-D-glukonové provádí ve vodě omezeně rozpustným uhličitanem kovu alkalických zemin, s výhodou uhličitanem barnatým nebo vápenatým, přítomným v systému od počátku konverze.