CS211803B1 - Způsob izolace heparinu - Google Patents

Abstract

Vynález se týká spůsobu izolace heparinu z upraveného proteolyzátu hovězích plic tak, že se v proteolyzátu rozpustí chlorid sodný v množství 1 až 2 % hmot., načež se po přídavku organického rozpouštědla těžšího než voda, například chloroformu nebo tetrachlorethylenu, směs zředí 2- až 3-násobným objemem vody, vyčiří, těžší fáze se oddělí a čirý roztok se zpracuje na heparin.

Description

Vynález se týká způsobu izolace heparinu z tekutých proteolyzátů, připravených enzymatickou degradací plic, zejména hovězích.

Heparin patří mezi kyselé mukopolysacharidy, které se ve velmi malých množstvích vyskytují v tkáních různých živočišných orgánů, např. plic, žaludeční nebo střevní sliznice atd., a které mají v organismu různé biologické funkce. Pro svoji vysokou antikoagulační a antilipemickou účinnost zaujímá heparin, nejznámější z uvedených mukopolysacharidů, významné místo v klinické praxi jako cenné léčivo-. Je známo, že pojem heparin neoznačuje látku jednotného složení, kterou lze charakterizovat přesnými fyzikálně-chemickými konstantami, ale nehomogenní směs vyšších esterů kyseliny sírové, nejvýše však tetrasírového esteru (vztaženo na základní strukturní tetrasacharidovou jednotku]. Vedle těchto vyšších esterů jsou v heparinu přítomny částečně i estery nižší. Směs těchto esterů je potom pod názvem heparin používána v klinické praxi jako konečná léková forma, podávaná nejčastěji parenterálně.

Izolace heparinu v průmyslovém měřítku spočívá ve zpracování výchozí suroviny, převážně hovězích plic, buď enzymatickou degradací (proteolýzou] tkáně nebo extrakcí tkáně roztoky anorganických solí, zejména chloridu sodného-. V průběhu zpracování výchozí suroviny dochází v různém stupni k rozpuštění a suspendování průvodních látek (bílkovin a jejich degradačních produktů, tuků, zbytků apod.). Tyto balasty svým množstvím řádově několikanásobně převyšují množství heparinu obsaženého v roztoku. Vzhledem k tomu, že se v průmyslovém. měřítku při výrobě heparinu zpracovávají veliké objemy, představuje dokonalé vyčiření jedné násady značný technologický problém. Ve většině případů se dosud postupuje tak, že se výchozí roztok okyselí pod pH 3, za přítomnosti 10 % i více anorganických solí, obvykle chloridu sodného, čímž dochází k vysrážení bílkovin a jejich degradačních produktů. Vzhledem k přítomnosti většího množství elektrolytu zůstává heparin v roztoku. Po odstranění sraženiny balastů se potom heparin z čirého roztoku izoluje známými postupy, ať již srážením organickými, s vodou mísitelnými rozpouštědly nebo organickými aminky, nebo nověji srážením vyššími kvartérními amoniovými solemi, s nimiž tvoří ve vodě nerozpustné komplexy (francouzský pat. spis č. 1 261 870, americký pat. spis č. 3 058 884, čs. pat. spis č. 118 820).

Nevýhodou popsaných způsobů čiření surových heparinových roztoků vylučováním a odstraňováním sraženiny balastů v kyselé oblasti pH je skutečnost, že dochází k ztrá2 tám heparinu, zejména jeho vysokoúčinné složky, částečnou adsorpcí na sraženinu balastů, a to i tehdy, je-li v roztoku přítomna sůl v koncentraci 10 % i více.

Bylo zjištěno, že k vyčiření roztoků surového heparinu, získaných prioteolytickým štěpením nebo extrakcí p lícní tkáně, není nutná úprava pH do kyselé oblasti, ale že je naopak výhodné čiřit tyto roztoky v neutrálním nebo sl-abě alkalickém prostředí, kdy je heparin, přítomný v roztoku jako sodná sůl, dokonale rozpuštěn a nedochází k jeho adsorpci nebo jiné vázbě na odstraňované bílkovinné balasty. Přídavek chloridu sodného pro udržení účinného heparinu v roztoku je potom možno podstatně snížit, čímž se rovněž usnadňuje další zpracování vyčiřených roztoků. Takto lze vyčiřit extrakty nebo proteolyzáty bez nebezpečí ztrát na heparinu a z vyčiřených roztoků lze poté izolovat surový heparin některou ze známých metod nebo novým způsobem, pouhou adsorpcí na bílkovinný nosič, dodatečně vysrážený z vyčiřeného roztoku úpravou pH do kyselé oblasti.

Na základě nově zjištěných poznatků byl vypracován podle vynálezu způsob izolace heparinu z tekutých proteolyzátů, připravených enzymatickou degradací živočišných plic, zejména hovězích, upravených na hodnotu pH 7,0 až 8,5 a teplotu 40 až 60 °C, jehož podstata spočívá v to-m, že se ve výchozím upraveném proteolyzátů nejprve rozpustí chlorid sodný v množství 1 až 2 %, načež se po přídavku organického, s -vodou nemísitelného rozpouštědla, těžšího než voda, s výhodou halogenovaného alifatického uhlovodíku, jako chloroformu nebo tetrachlorethylenu, v množství 1 až 2 % obj., vztaženo na objem výchozího proteolyzátů, směs zředí 2- až 3-násobným objemem vody, vyčiří za současného oddělení těžší fáze a čirý roztok se dále zprac-ováva některým ze známých způsobů, např. okyselením, na surový heparin. Zpravidla se čirý roztok okyseluje na pH 2 až 3, s výhodou na 2,3 až 2,6, popřípadě se přidává 0,1 až 0,2 % vyšší kvartérní amoniové soli, potom se vyloučená sraženina oddělí, r-ozpustí v 10 % roztoku chloridu sodného s hodnotou pH 8,0 až 9,0 při teplotě 70 až 80 °C a přídavkem ethanolu do koncentrace 60 % se vyloučí ve formě sraženiny surový heparin, který se po izolaci čistí obecně známým způsobem.

Za uvedených podmínek, tj. při úpravě pH na hodnotu 7,0 až 8,5 a při nízké koncentraci chloridu sodného zůstává heparin dokonale v roztoku a Čiření, tj. odstraňování balastů -a dispergovaných lipoidů probíhá v přítomnosti organického rozpouštědla, nemísitelného s vodou a těžšího než voda hladce a dokonale, bez ztrát účinné látky. Při dalším zpracování vyčiřeného roztoku

211 803 je adsorpce heparinu na přirozený bílkovinný nosič, vyloučený okyselením na pH 2 až 3, poměrně rychlá a asi během 1 hodiny dojde k naadsorbování prakticky veškerého heparinu z roztoku. V této fázi je možno k novému postupu připojit známý způsob izolace, který spočívá v přídavku vyšší kvartérní amoniové soli k suspenzí heparinu vázaného na bílkovinném nosiči, čímž lze z roztoku izolovat také nízkoúčinnou složku heparinu v jedné pracovní operaci. Po izolaci pevné fáze odstředěním nebo filtrací se izoluje naadsorbovaný heparin jejím rozpuštěním v alkalickém 10 % roztoku chloridu sodného a vysrážením ethanolem. Získaná sraženina se po Izolaci čistí známým způsobem, např: oxidací manganistanem draselným a frakcionací ethanolem, čímž se získá ve vysokém výtěžku heparin o účinnosti přes 100 m. j./mg.

Způsob podle vynálezu je objasněn dále v příkladu provedení:

K 1300 litrům proteolyzátu, získaného enzymatickým štěpením 800 kg hovězích plic, se přidá 40 kg chloridu sodného a po jeho rozpuštění se pH roztoku upraví na hodnotu 7,0 až 8,5. Do roztoku se potom za intenzivního míchání a při teplotě kolem 60 °C přidá 15 litrů tetrachlorethylenu, rozpuštěného v 15 litrech ethanolu. Po důkladném promíchání se roztok zředí vodou na objem 4000 litrů a vyčiří se odstředěním. Vyčiřený roztok se okyselí kyselinou chlorovodíkovou na pH 2,0 až 3,0 s výhodou 2,3 až 2,6 a s vyloučenou sraženinou se míchá 1 hodinu. Poté se přidá 1 kg kvartérní amoniové soli (např. N-(karbethoxy-pentadecyl] trimethylamoniumbromidu) ve fo’rmě 10% vodného roztoku, čímž se vysráží zbytek neadsorbovaných nízkoúčinných heparidů. Následujícím odstředěním se získá asi 20 kg sraženiny, která se rozpustí ve 200 litrech 10 % roztoku chloridu sodného při pH 8 až 9 a při teplotě 80 °C. Po dokonalém rozpuštění sraženiny se z roztoku vysráží surový heparin přídavkem ethanolu do koncentrace 60 %. Surový produkt se izoluje odstředěním a některým ze známých postupů zpracuje na čistý preparát. Získá se 150 až 180 g surového heparinu s účinností 80 až 100 m. j./mg á dále asi 2 kg nízkoúčinných podílů, které se zpracovávají dodatečnou sulfonací.

Claims (1)

1. Způsob izolace heparinu z tekutých proteolyzátů, připravených enzymatickou degradací živočišných plic, zejména hovězích, upravených na hodnotu pH 7,0 až 8,5 a teplotu 40 až 60 °C, vyznačující se tím, že se ve výchozím upraveném proteolyzátu nejprve rozpustí chlorid sodný v množství 1 až 2 %, načež se po přídavku organického, s vodou nemísitelného rozpouštědla, těžšího než voda, s výhodou halogenovaného alifatického uhlovodíku, jako chloroformu nebo tetrachlorethylenu, v množství 1 až 2 % obj., vztaženo na objem výchozího proteolyzátu, směs zředí 2- až 3-násobným objemem vody, vyčiří za současného oddělení těžší fáze, a čirý roztok se dále zpracovává, např. okyselením, na surový heparin.