CS211803B1

CS211803B1 - Method of isolating heparin

Info

Publication number: CS211803B1
Application number: CS117670A
Authority: CS
Inventors: Vladimir Jiricek; Stanislav Rericha; Vladimir Vavra
Original assignee: Vladimir Jiricek; Stanislav Rericha; Vladimir Vavra
Priority date: 1970-02-20
Filing date: 1970-02-20
Publication date: 1982-02-26

Abstract

Vynález se týká spůsobu izolace heparinu z upraveného proteolyzátu hovězích plic tak, že se v proteolyzátu rozpustí chlorid sodný v množství 1 až 2 % hmot., načež se po přídavku organického rozpouštědla těžšího než voda, například chloroformu nebo tetrachlorethylenu, směs zředí 2- až 3-násobným objemem vody, vyčiří, těžší fáze se oddělí a čirý roztok se zpracuje na heparin.The invention relates to a method of isolating heparin from a modified bovine lung proteolysate by dissolving sodium chloride in the proteolysate in an amount of 1 to 2% by weight, after which, after adding an organic solvent heavier than water, for example chloroform or tetrachloroethylene, the mixture is diluted with 2 to 3 times the volume of water, clarified, the heavier phase is separated and the clear solution is processed into heparin.

Description

Vynález se týká způsobu izolace heparinu z tekutých proteolyzátů, připravených enzymatickou degradací plic, zejména hovězích.The invention relates to a process for the isolation of heparin from liquid proteolysates prepared by enzymatic degradation of the lungs, in particular beef.

Heparin patří mezi kyselé mukopolysacharidy, které se ve velmi malých množstvích vyskytují v tkáních různých živočišných orgánů, např. plic, žaludeční nebo střevní sliznice atd., a které mají v organismu různé biologické funkce. Pro svoji vysokou antikoagulační a antilipemickou účinnost zaujímá heparin, nejznámější z uvedených mukopolysacharidů, významné místo v klinické praxi jako cenné léčivo-. Je známo, že pojem heparin neoznačuje látku jednotného složení, kterou lze charakterizovat přesnými fyzikálně-chemickými konstantami, ale nehomogenní směs vyšších esterů kyseliny sírové, nejvýše však tetrasírového esteru (vztaženo na základní strukturní tetrasacharidovou jednotku]. Vedle těchto vyšších esterů jsou v heparinu přítomny částečně i estery nižší. Směs těchto esterů je potom pod názvem heparin používána v klinické praxi jako konečná léková forma, podávaná nejčastěji parenterálně.Heparin is one of the acidic mucopolysaccharides that occur in very small amounts in the tissues of various animal organs, such as the lungs, stomach or intestinal mucosa, etc., and which have different biological functions in the body. Because of its high anticoagulant and antilipemic activity, heparin, the best-known of these mucopolysaccharides, occupies an important place in clinical practice as a valuable drug. It is known that the term heparin does not refer to a substance of uniform composition, which can be characterized by precise physicochemical constants, but by an inhomogeneous mixture of higher esters of sulfuric acid, but not more than of tetra-sulfur ester. A mixture of these esters is then used in clinical practice as the final dosage form, most commonly administered parenterally, under the name heparin.

Izolace heparinu v průmyslovém měřítku spočívá ve zpracování výchozí suroviny, převážně hovězích plic, buď enzymatickou degradací (proteolýzou] tkáně nebo extrakcí tkáně roztoky anorganických solí, zejména chloridu sodného-. V průběhu zpracování výchozí suroviny dochází v různém stupni k rozpuštění a suspendování průvodních látek (bílkovin a jejich degradačních produktů, tuků, zbytků apod.). Tyto balasty svým množstvím řádově několikanásobně převyšují množství heparinu obsaženého v roztoku. Vzhledem k tomu, že se v průmyslovém. měřítku při výrobě heparinu zpracovávají veliké objemy, představuje dokonalé vyčiření jedné násady značný technologický problém. Ve většině případů se dosud postupuje tak, že se výchozí roztok okyselí pod pH 3, za přítomnosti 10 % i více anorganických solí, obvykle chloridu sodného, čímž dochází k vysrážení bílkovin a jejich degradačních produktů. Vzhledem k přítomnosti většího množství elektrolytu zůstává heparin v roztoku. Po odstranění sraženiny balastů se potom heparin z čirého roztoku izoluje známými postupy, ať již srážením organickými, s vodou mísitelnými rozpouštědly nebo organickými aminky, nebo nověji srážením vyššími kvartérními amoniovými solemi, s nimiž tvoří ve vodě nerozpustné komplexy (francouzský pat. spis č. 1 261 870, americký pat. spis č. 3 058 884, čs. pat. spis č. 118 820).Heparin isolation on an industrial scale consists in processing the starting material, mainly bovine lung, either by enzymatic degradation (proteolysis) of the tissue or by extracting the tissue with solutions of inorganic salts, in particular sodium chloride. proteins and their degradation products, fats, residues, etc.) These ballasts are several times higher than the amount of heparin contained in the solution because of the large-scale processing of heparin on an industrial scale. In most cases, the starting solution has been acidified below pH 3 in the presence of 10% or more inorganic salts, usually sodium chloride, thereby precipitating proteins and their degradation products. After removal of the ballast precipitate, heparin is then isolated from the clear solution by known methods, either by precipitation with organic, water-miscible solvents or organic amines, or more recently by precipitation with higher quaternary ammonium salts, with which forms water - insoluble complexes (French Pat. No. 1,261,870, U.S. Pat. No. 3 058 884, MS. U.S. Pat. No. 118,820).

Nevýhodou popsaných způsobů čiření surových heparinových roztoků vylučováním a odstraňováním sraženiny balastů v kyselé oblasti pH je skutečnost, že dochází k ztrá2 tám heparinu, zejména jeho vysokoúčinné složky, částečnou adsorpcí na sraženinu balastů, a to i tehdy, je-li v roztoku přítomna sůl v koncentraci 10 % i více.A disadvantage of the described methods of clarifying crude heparin solutions by excretion and removal of the acid ballast precipitate in the acidic pH range is that heparin, especially its high-active component, is lost by partial adsorption to the ballast precipitate, even if salt in the solution is present. concentration of 10% or more.

Bylo zjištěno, že k vyčiření roztoků surového heparinu, získaných prioteolytickým štěpením nebo extrakcí p lícní tkáně, není nutná úprava pH do kyselé oblasti, ale že je naopak výhodné čiřit tyto roztoky v neutrálním nebo sl-abě alkalickém prostředí, kdy je heparin, přítomný v roztoku jako sodná sůl, dokonale rozpuštěn a nedochází k jeho adsorpci nebo jiné vázbě na odstraňované bílkovinné balasty. Přídavek chloridu sodného pro udržení účinného heparinu v roztoku je potom možno podstatně snížit, čímž se rovněž usnadňuje další zpracování vyčiřených roztoků. Takto lze vyčiřit extrakty nebo proteolyzáty bez nebezpečí ztrát na heparinu a z vyčiřených roztoků lze poté izolovat surový heparin některou ze známých metod nebo novým způsobem, pouhou adsorpcí na bílkovinný nosič, dodatečně vysrážený z vyčiřeného roztoku úpravou pH do kyselé oblasti.It has been found that adjusting the pH to the acidic area is not necessary to clear solutions of crude heparin obtained by proteolytic cleavage or extraction of the lung tissue, but it is preferable to clarify these solutions in a neutral or slightly alkaline environment where heparin is present in solution as the sodium salt, completely dissolved and does not adsorb or otherwise bind to the removed protein ballasts. The addition of sodium chloride to keep the active heparin in solution can then be substantially reduced, which also facilitates further processing of the clarified solutions. In this way, extracts or proteolysates can be clarified without the risk of loss of heparin, and crude heparin can then be isolated from the clarified solution by any known method or by a new method, simply by adsorption to a carrier protein subsequently precipitated from the clarified solution by pH adjustment to the acidic region.

Na základě nově zjištěných poznatků byl vypracován podle vynálezu způsob izolace heparinu z tekutých proteolyzátů, připravených enzymatickou degradací živočišných plic, zejména hovězích, upravených na hodnotu pH 7,0 až 8,5 a teplotu 40 až 60 °C, jehož podstata spočívá v to-m, že se ve výchozím upraveném proteolyzátů nejprve rozpustí chlorid sodný v množství 1 až 2 %, načež se po přídavku organického, s -vodou nemísitelného rozpouštědla, těžšího než voda, s výhodou halogenovaného alifatického uhlovodíku, jako chloroformu nebo tetrachlorethylenu, v množství 1 až 2 % obj., vztaženo na objem výchozího proteolyzátů, směs zředí 2- až 3-násobným objemem vody, vyčiří za současného oddělení těžší fáze a čirý roztok se dále zprac-ováva některým ze známých způsobů, např. okyselením, na surový heparin. Zpravidla se čirý roztok okyseluje na pH 2 až 3, s výhodou na 2,3 až 2,6, popřípadě se přidává 0,1 až 0,2 % vyšší kvartérní amoniové soli, potom se vyloučená sraženina oddělí, r-ozpustí v 10 % roztoku chloridu sodného s hodnotou pH 8,0 až 9,0 při teplotě 70 až 80 °C a přídavkem ethanolu do koncentrace 60 % se vyloučí ve formě sraženiny surový heparin, který se po izolaci čistí obecně známým způsobem.Based on the newly discovered findings, a process for the isolation of heparin from liquid proteolysates prepared by enzymatic degradation of animal lungs, in particular beef, adjusted to a pH of 7.0-8.5 and a temperature of 40-60 ° C has been elaborated. The process according to claim 1, characterized in that sodium chloride is initially dissolved in an initial treated proteolysate in an amount of 1 to 2%, followed by addition of an organic water-immiscible solvent heavier than water, preferably a halogenated aliphatic hydrocarbon such as chloroform or tetrachlorethylene. 2% by volume, based on the volume of the starting proteolysates, is diluted with 2 to 3 times the volume of water, clarified while separating the heavier phase, and the clear solution is further processed in some known manner, e.g. by acidification, to crude heparin. As a rule, the clear solution is acidified to a pH of 2 to 3, preferably 2.3 to 2.6, optionally 0.1 to 0.2% of a higher quaternary ammonium salt is added, then the precipitate formed is separated off, dissolved in 10%. sodium chloride solution having a pH of 8.0-9.0 at a temperature of 70-80 ° C and addition of ethanol to a concentration of 60% precipitates crude heparin as a precipitate which is purified after isolation in a generally known manner.

Za uvedených podmínek, tj. při úpravě pH na hodnotu 7,0 až 8,5 a při nízké koncentraci chloridu sodného zůstává heparin dokonale v roztoku a Čiření, tj. odstraňování balastů -a dispergovaných lipoidů probíhá v přítomnosti organického rozpouštědla, nemísitelného s vodou a těžšího než voda hladce a dokonale, bez ztrát účinné látky. Při dalším zpracování vyčiřeného roztokuUnder these conditions, i.e. pH adjustment to 7.0-8.5 and low sodium chloride concentration, heparin remains perfectly in solution and clarification, i.e. the removal of ballasts and dispersed lipoids takes place in the presence of a water-immiscible organic solvent and heavier than water smoothly and perfectly, without losing the active ingredient. For further processing of the clarified solution

211 803 je adsorpce heparinu na přirozený bílkovinný nosič, vyloučený okyselením na pH 2 až 3, poměrně rychlá a asi během 1 hodiny dojde k naadsorbování prakticky veškerého heparinu z roztoku. V této fázi je možno k novému postupu připojit známý způsob izolace, který spočívá v přídavku vyšší kvartérní amoniové soli k suspenzí heparinu vázaného na bílkovinném nosiči, čímž lze z roztoku izolovat také nízkoúčinnou složku heparinu v jedné pracovní operaci. Po izolaci pevné fáze odstředěním nebo filtrací se izoluje naadsorbovaný heparin jejím rozpuštěním v alkalickém 10 % roztoku chloridu sodného a vysrážením ethanolem. Získaná sraženina se po Izolaci čistí známým způsobem, např: oxidací manganistanem draselným a frakcionací ethanolem, čímž se získá ve vysokém výtěžku heparin o účinnosti přes 100 m. j./mg.211 803, the adsorption of heparin to a natural protein carrier, excreted by acidification to a pH of 2-3, is relatively rapid and virtually all of the heparin is absorbed from the solution in about 1 hour. At this stage, a new isolation method can be added to the novel process, which comprises adding a higher quaternary ammonium salt to a protein-bound heparin suspension, thereby also isolating the low-active heparin component from the solution in a single operation. After isolation of the solid phase by centrifugation or filtration, the adsorbed heparin is isolated by dissolving it in an alkaline 10% sodium chloride solution and precipitating with ethanol. After isolation, the precipitate obtained is purified in a known manner, for example by oxidation with potassium permanganate and fractionation with ethanol, yielding in a high yield heparin with an efficiency of over 100 IU / mg.

Způsob podle vynálezu je objasněn dále v příkladu provedení:The method according to the invention is illustrated by the following example:

K 1300 litrům proteolyzátu, získaného enzymatickým štěpením 800 kg hovězích plic, se přidá 40 kg chloridu sodného a po jeho rozpuštění se pH roztoku upraví na hodnotu 7,0 až 8,5. Do roztoku se potom za intenzivního míchání a při teplotě kolem 60 °C přidá 15 litrů tetrachlorethylenu, rozpuštěného v 15 litrech ethanolu. Po důkladném promíchání se roztok zředí vodou na objem 4000 litrů a vyčiří se odstředěním. Vyčiřený roztok se okyselí kyselinou chlorovodíkovou na pH 2,0 až 3,0 s výhodou 2,3 až 2,6 a s vyloučenou sraženinou se míchá 1 hodinu. Poté se přidá 1 kg kvartérní amoniové soli (např. N-(karbethoxy-pentadecyl] trimethylamoniumbromidu) ve fo’rmě 10% vodného roztoku, čímž se vysráží zbytek neadsorbovaných nízkoúčinných heparidů. Následujícím odstředěním se získá asi 20 kg sraženiny, která se rozpustí ve 200 litrech 10 % roztoku chloridu sodného při pH 8 až 9 a při teplotě 80 °C. Po dokonalém rozpuštění sraženiny se z roztoku vysráží surový heparin přídavkem ethanolu do koncentrace 60 %. Surový produkt se izoluje odstředěním a některým ze známých postupů zpracuje na čistý preparát. Získá se 150 až 180 g surového heparinu s účinností 80 až 100 m. j./mg á dále asi 2 kg nízkoúčinných podílů, které se zpracovávají dodatečnou sulfonací.To 1300 liters of proteolysate obtained by enzymatic digestion of 800 kg of bovine lung, 40 kg of sodium chloride are added and after dissolution the pH of the solution is adjusted to 7.0-8.5. 15 liters of tetrachlorethylene dissolved in 15 liters of ethanol are then added to the solution with vigorous stirring at a temperature of about 60 ° C. After thorough mixing, the solution is diluted to 4000 liters with water and clarified by centrifugation. The clarified solution is acidified with hydrochloric acid to pH 2.0-3.0, preferably 2.3-2.6, and stirred for 1 hour with the precipitate formed. Then, 1 kg of quaternary ammonium salt (e.g. N- (carbethoxy-pentadecyl) trimethylammonium bromide) in 10% aqueous solution is added to precipitate the remainder of the unadsorbed low-activity heparides. 200 liters of 10% sodium chloride solution at pH 8-9 and 80 DEG C. After complete dissolution of the precipitate, crude heparin is precipitated from the solution by adding ethanol to a concentration of 60%, and the crude product is isolated by centrifugation and processed to a pure preparation 150-180 g of crude heparin having an efficacy of 80-100 IU / mg and further about 2 kg of low-active fractions are obtained, which are treated by post-sulphonation.

Claims

Process for the isolation of heparin from liquid proteolysates prepared by enzymatic degradation of animal lungs, in particular beef, adjusted to a pH of 7.0-8.5 and a temperature of 40-60 ° C, characterized in that sodium chloride is first dissolved in the initial treated proteolysate. an amount of 1 to 2%, after which an amount of 1 to 2% by volume of the starting proteolysate, based on the volume of the starting proteolysate, is diluted after addition of an organic water-immiscible solvent heavier than water, preferably a halogenated aliphatic hydrocarbon such as chloroform or tetrachlorethylene. - up to 3 times the volume of water, clarifies while separating the heavier phase, and the clear solution is further processed, eg by acidification, to crude heparin.