CS209755B1 - Způsob immobilizace amyloglukosidázy na celulosový nosič - Google Patents

Abstract

Vynález se týká způsobu immobilizace amyloglukosidázy na celulosový nosič. Tento způsob umožňuje získat ve vodě nerozpustný konjugát enzymu a celulosy držený pospolu kovalentňí vazbou. Tato forma umožňuje jeho opakované použití. Způsob podle vynálezu se provádí tak, že se aktivovaný nosič obsahující skupiny vzorce III CEL- O —C —O— •no2 (III) kde CEL je opakující se jednotka celulosového řetězce, smísí s roztokem enzymu amyloglukosidázy v pufru o pH 3,5 až 7 a při teplotě 4 až 37 °C ponechá reagovat po dobu 0,25 až 6 hodin, načež se pevná fáze oddělí. Po oddělení se pevná fáze s výhodou promyje vodou a/nebo 1 až 40% roztokem Škrobu a/nebo 0,5% roztokem detergentu vybraného ze skupiny zahrnující alkylfenylpolyethylenoxidethery obsahující 1 až 12 atomů uhlíku v alkylu, a nakonec roztokem pufru o pH 4,7.

Description

Vynález se týká způsobu immobilizace amyloglukosidázy na eelulosový nosič. Tento způsob umožňuje získat ve vodě nerozpustný konjugát enzymu a celulosy držený pospolu kovalentní vazbou. Tato forma umožňuje jeho opakované použití, což přináší značné ekonomické přednosti jednak v úspoře enzymu, jež se může několikrát recyklovat ve výrobním procesu, jednak ve stabilizaci proti denaturaci, např. teplem či jinými vlivy.

Immobilizace amyloglukosidázy na eelulosový nosič je známa. Přitom byly využity prakticky všechny doposud známé techniky^tj. enkapsulace, zachycení v gelové matrici, fyzikální i kovalentní vazba k nosiči. Tak např. DOS 2 146 390 popisuje vlákna na bázi triacetátu celulosy naplněná amyloglukosidázou; obdobně také DOS 2 303 872 a US patent 3 809 605. Jiná skupina patentů popisuje použití celulosy jako plniva při zesítění enzymu bifunkčním činidlem (DOS 2 345 186, DOS 2 345 185) nebo při radiační polymerizaci monomeru v přítomnosti enzymu (DOS 2 633 259). Velká pozornost byla věnována immobilizaci prostřednictvím iontových vazeb zejména na DEAE derivátu celulosy (DOS 2 538 322, US patent 4 102 745, Jap. přihláška vynálezu 7 844 685, Brit. patent 1 302 706, US patent 4 029 546). Immobilizaci prostřednictvím kovalentní vazby při použití aminoethylcelulosy a glutaraldebydu se zabývá SSSR autorské osvědčení 507 636, diazotované nosiče na-celulosové bázi jsou popsány v DOS 2 336 423 a 2 012 089. DOS č. 2 062 246 je koncentrován na enzymatické preparáty a způsob jejich výroby immobilizaci na karbonát celulosy kromě dalších způsobů. Celulosa se nejprve modifikuje ve směsném rozpouštědle dimethylsulfoxid-1,4-dioxanethylesterem kyseliny chloromravenčí v přítomnosti triethylaminu, pak neutralizuje a rozmíchá se v 90% ethanolu. Nosič pak obsahuje skupiny typu I.

> )c-o (I)

Jiný způsob výhodné aktivace celulosy spočívá v reakci s nitrofenylesterem kyseliny chloromravenčí v 1,4-dioxanu dávající skupiny typu II podle čs. autorského osvědčení č. 204 190

!

Derivát celulosy I byl pak použit pro immobilizaci různých enzymů včetně amyloglukosidázy. Ani po třech hodinách reakce nebylo množství navázaného enzymu použitelně vysoké a rozdíl mezi slepým pokusem (1,9/umol glukosy/g nosiče za 1 hodinu) s neaktivovanou celulosou a při použití derivátu typu I (1,8^umol/g.h) není výrazný. Přitom byl použit relativně čistý preparát z Aspergilus niger s aktivitou 27 U/mg bílkoviny.

Tento velmi závažný nedostatek je odstraněn při immobilizaci způsobem podle tohoto vynálezu. Zde se s výhodou využívá aktivního derivátu celulosy typu II, který je relativně snadno přístupný, stabilní, ale též dostatečně reaktivní. Další výhodou způsobu immobilizace podle vynálezu je skutečnost, že po skončení immobilizačni reakce lze snadno kontrolovat odstranění zbylých nezreagovaných skupin typu II, které by v opačném případě mohly způsobovat závažné problémy při aplikaci produktu. Detekce při jejich likvidaci vznikajícího nitrofenolu žluté barvy je velmi jednoduchá prostřednictvím fotometru.

Předmětem vynálezu je způsob immobilizace amyloglukosidázy na eelulosový nosič, který spočívá v tom, že se aktivovaný nosič obsahující skupiny vzorce III

CEL-O(III) kde CEL je celulosová opakující se jednotka celulosového řetězce, smísí s roztokem enzymu amyloglukosidázy v pufru o pH 3,5 až 7 a při teplotě 4 až 37 °C ponechá reagovat po dobu 0,25 až 6 hodin, pevná fáze se oddělí s výhodou filtrací nebo odstředěním. Potom se výhodně promyje vodou, a/nebo 1 až 40% roztokem škrobu a/nebo 0,5% hmot. roztokem detergentu vybraného ze skupiny zahrnující alkylfenylpolyethylenoxidethery s 1 až 12 atomy uhlíku v alkylu, a nakonec s výhodou roztokem pufru o pH = 4,7.

Získaný preparát se používá při výrobě glukosy ze škrobu, přičemž lze výrobu výrazně zefektivnit. Podobný postup lze realizovat i pro jiné enzymy, nebot je do jisté míry obecný. Vynález je dále blíže objasněn na příkladech provedení.

Příklad 1

Aktivovaná celulosa,uchovávaná v 1,4-dioxanú, byla promyta pufrem pH 4,0 a odstředěna.

K navážce 0,2 g byly přidány 2 ml 0,5 M acetátového pufru pH = 4 a 2 ml roztoku amyloglukosidázy z Aspergilus niger o celkové aktivitě 190 jednotek (počet jednotek representuje počet μπιοί glukosy vzniklých rozštěpením škrobu za 1 minutu při použití daného množství preparátu) a směs 1 hodinu míchána při 25 °C. Immobilizovaný enzym byl poté promyt 100 ml vody, 30 ml 35% roztoku škrobu a poté 100 »10,111 acetátového pufru pH = 4,7. Získaný vzorek měl aktivitu 570 jednotek/g suchého preparátu.

Příklad 2

Stejným způsobem jako v příkladu 1 byla provedena immobilizace s tím rozdílem, že byl použit 1 M acetátový pufr pH = 3,5 při immobilizační reakci. Po jejím skončení byl produkt promyt 100 ml vody, 50 ml 10% roztoku škrobu a 100 ml acetátového pufru pH = 4,7. Aktivita byla 230 jednotek/g suchého preparátu.

Příklad 3

Stejným způsobem jako v příkladě 1 kromě pufru, jenž měl zde pH = 7, byl získán preparát s aktivitou 160 jednotek/g suchého vzorku.

Příklad 4

Celý proces byl proveden shodně jako v případě příkladu 1 pouze doba styku nosiče s enzymem byla zkrácena na 15 minut při teplotě 37 °C. Produkt měl pak aktivitu 370 jednotek/g suchého preparátu.

Příklad 5

Stejným způsobem jako v příkladu 1 byla provedena immobilizace, avšak doba vlastní reakce byla prodloužena na 4 hodiny při teplotě 4 °C. Aktivita byla 310 jednotek/g suchého preparátu.

Příklad6

Produkt immobilizace získaný postupem podle příkladu 1 byl namísto roztokem škrobu promýván 0,5½ roztokem n-oktylfenyl-dekaetylenoxidetheru. Aktivita byla 590 jednotek/g suchého preparátu.

Claims (2)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   1. Způsob immobilizace amyloglukosidázy na celulosový nosič, vyznačený tím, že se aktivovaný nosič obsahující skupiny vzorce III

   CEL-O-^-0

   O (III) kde CEL je opakující se jednotka celulosového řetězce, smísí s' roztokem enzymu amyloglukosi dázy v pufru o pH 3,5 až 7 a při teplotě 4 až 37 °C ponechá reagovat po dobu 0,25 až 6 hodin, načež se pevná fáze oddělí.
2. 2. Způsob podle bodu 1, vyznačený tím, že se pevná fáze po oddělení promyje vodou a/nebo 1 až 40% roztokem Škrobu a/nebo 0,5% roztokem detergentů vybraného ze skupiny zahrnující alkylfenylpolyethylenoxidethery obsahující 1 až 12 atomů uhlíku v alkylu, a nakonec roztokem pufru o /pH 4,7·