CS209755B1

CS209755B1 - A method for immobilizing amyloglucosidase onto a cellulose carrier

Info

Publication number: CS209755B1
Application number: CS292180A
Authority: CS
Inventors: Frantisek Svec; Helena Kudlvasrova; Ivana Konecna; Irina I Menjajlova; Levon A Nachapetjan
Original assignee: Frantisek Svec; Helena Kudlvasrova; Ivana Konecna; Irina I Menjajlova; Levon A Nachapetjan
Priority date: 1980-04-25
Filing date: 1980-04-25
Publication date: 1981-12-31

Abstract

Vynález se týká způsobu immobilizace amyloglukosidázy na celulosový nosič. Tento způsob umožňuje získat ve vodě nerozpustný konjugát enzymu a celulosy držený pospolu kovalentňí vazbou. Tato forma umožňuje jeho opakované použití. Způsob podle vynálezu se provádí tak, že se aktivovaný nosič obsahující skupiny vzorce III CEL- O —C —O— •no2 (III) kde CEL je opakující se jednotka celulosového řetězce, smísí s roztokem enzymu amyloglukosidázy v pufru o pH 3,5 až 7 a při teplotě 4 až 37 °C ponechá reagovat po dobu 0,25 až 6 hodin, načež se pevná fáze oddělí. Po oddělení se pevná fáze s výhodou promyje vodou a/nebo 1 až 40% roztokem Škrobu a/nebo 0,5% roztokem detergentu vybraného ze skupiny zahrnující alkylfenylpolyethylenoxidethery obsahující 1 až 12 atomů uhlíku v alkylu, a nakonec roztokem pufru o pH 4,7.The invention relates to a method for immobilizing amyloglucosidase on a cellulose support. This method makes it possible to obtain a water-insoluble conjugate of the enzyme and cellulose held together by a covalent bond. This form allows its repeated use. The method according to the invention is carried out by mixing an activated support containing groups of formula III CEL- O —C —O— •no2 (III) where CEL is a repeating unit of the cellulose chain with a solution of the amyloglucosidase enzyme in a buffer of pH 3.5 to 7 and allowing it to react at a temperature of 4 to 37 °C for 0.25 to 6 hours, after which the solid phase is separated. After separation, the solid phase is preferably washed with water and/or a 1 to 40% solution of Starch and/or a 0.5% solution of a detergent selected from the group comprising alkylphenyl polyethylene oxide ethers containing 1 to 12 carbon atoms in the alkyl, and finally with a buffer solution of pH 4.7.

Description

Vynález se týká způsobu immobilizace amyloglukosidázy na eelulosový nosič. Tento způsob umožňuje získat ve vodě nerozpustný konjugát enzymu a celulosy držený pospolu kovalentní vazbou. Tato forma umožňuje jeho opakované použití, což přináší značné ekonomické přednosti jednak v úspoře enzymu, jež se může několikrát recyklovat ve výrobním procesu, jednak ve stabilizaci proti denaturaci, např. teplem či jinými vlivy.The invention relates to a method of immobilizing amyloglucosidase to an eelulose carrier. This method makes it possible to obtain a water-insoluble enzyme-cellulose conjugate held together by a covalent bond. This form allows its reuse, which brings considerable economic advantages both in the saving of the enzyme, which can be recycled several times in the production process, and in the stabilization against denaturation, for example by heat or other influences.

Immobilizace amyloglukosidázy na eelulosový nosič je známa. Přitom byly využity prakticky všechny doposud známé techniky^tj. enkapsulace, zachycení v gelové matrici, fyzikální i kovalentní vazba k nosiči. Tak např. DOS 2 146 390 popisuje vlákna na bázi triacetátu celulosy naplněná amyloglukosidázou; obdobně také DOS 2 303 872 a US patent 3 809 605. Jiná skupina patentů popisuje použití celulosy jako plniva při zesítění enzymu bifunkčním činidlem (DOS 2 345 186, DOS 2 345 185) nebo při radiační polymerizaci monomeru v přítomnosti enzymu (DOS 2 633 259). Velká pozornost byla věnována immobilizaci prostřednictvím iontových vazeb zejména na DEAE derivátu celulosy (DOS 2 538 322, US patent 4 102 745, Jap. přihláška vynálezu 7 844 685, Brit. patent 1 302 706, US patent 4 029 546). Immobilizaci prostřednictvím kovalentní vazby při použití aminoethylcelulosy a glutaraldebydu se zabývá SSSR autorské osvědčení 507 636, diazotované nosiče na-celulosové bázi jsou popsány v DOS 2 336 423 a 2 012 089. DOS č. 2 062 246 je koncentrován na enzymatické preparáty a způsob jejich výroby immobilizaci na karbonát celulosy kromě dalších způsobů. Celulosa se nejprve modifikuje ve směsném rozpouštědle dimethylsulfoxid-1,4-dioxanethylesterem kyseliny chloromravenčí v přítomnosti triethylaminu, pak neutralizuje a rozmíchá se v 90% ethanolu. Nosič pak obsahuje skupiny typu I.Immobilization of amyloglucosidase to an eelulose carrier is known. In this case, virtually all of the hitherto known techniques were used. encapsulation, entrapment in gel matrix, physical and covalent binding to carrier. For example, DOS 2,146,390 discloses cellulose triacetate based fibers filled with amyloglucosidase; similarly, DOS 2,303,872 and U.S. Pat. No. 3,809,605. Another group of patents describes the use of cellulose as a filler in crosslinking an enzyme with a bifunctional reagent (DOS 2,345,186, DOS 2,345,185) or in the polymerization of monomer in the presence of enzyme (DOS 2,633,259). ). Much attention has been paid to immobilization via ionic bonds, in particular to the DEAE cellulose derivative (DOS 2,538,322, U.S. Pat. No. 4,102,745, Japanese Patent Application No. 7,844,685, British Patent 1,302,706, U.S. Patent 4,029,546). Covalent immobilization using aminoethylcellulose and glutaraldebyde is dealt with in USSR author's certificate 507 636, diazotized cellulose-based carriers are described in DOS 2 336 423 and 2 012 089. DOS No. 2 062 246 is concentrated on enzymatic preparations and a process for their preparation immobilizing to cellulose carbonate among other methods. The cellulose is first modified in a mixed solvent of dimethylsulfoxide-1,4-dioxanethyl chloroformate in the presence of triethylamine, then neutralized and stirred in 90% ethanol. The carrier then contains type I groups.

> )c-o (I)>) c-o

Jiný způsob výhodné aktivace celulosy spočívá v reakci s nitrofenylesterem kyseliny chloromravenčí v 1,4-dioxanu dávající skupiny typu II podle čs. autorského osvědčení č. 204 190Another method for the advantageous activation of cellulose consists in reacting with nitrophenyl chloroformate in 1,4-dioxane of the type II group according to U.S. Pat. Certificate No. 204 190

!!

Derivát celulosy I byl pak použit pro immobilizaci různých enzymů včetně amyloglukosidázy. Ani po třech hodinách reakce nebylo množství navázaného enzymu použitelně vysoké a rozdíl mezi slepým pokusem (1,9/umol glukosy/g nosiče za 1 hodinu) s neaktivovanou celulosou a při použití derivátu typu I (1,8^umol/g.h) není výrazný. Přitom byl použit relativně čistý preparát z Aspergilus niger s aktivitou 27 U/mg bílkoviny.The cellulose derivative I was then used to immobilize various enzymes including amyloglucosidase. Even after three hours of reaction, the amount of bound enzyme was uselessly high and the difference between the blank (1.9 µmol glucose / g carrier per hour) with unactivated cellulose and the type I derivative (1.8 µmol / gh) was not significant . A relatively pure preparation of Aspergilus niger with an activity of 27 U / mg protein was used.

Tento velmi závažný nedostatek je odstraněn při immobilizaci způsobem podle tohoto vynálezu. Zde se s výhodou využívá aktivního derivátu celulosy typu II, který je relativně snadno přístupný, stabilní, ale též dostatečně reaktivní. Další výhodou způsobu immobilizace podle vynálezu je skutečnost, že po skončení immobilizačni reakce lze snadno kontrolovat odstranění zbylých nezreagovaných skupin typu II, které by v opačném případě mohly způsobovat závažné problémy při aplikaci produktu. Detekce při jejich likvidaci vznikajícího nitrofenolu žluté barvy je velmi jednoduchá prostřednictvím fotometru.This very serious drawback is overcome by immobilization by the method of the invention. Here, an active cellulose derivative of type II is used which is relatively easily accessible, stable but also sufficiently reactive. A further advantage of the inventive immobilization method is that after the immobilization reaction has been completed, removal of the remaining unreacted type II groups can easily be controlled, which could otherwise cause serious problems in the application of the product. Detection of the resulting yellow nitrophenol is very simple by means of a photometer.

Předmětem vynálezu je způsob immobilizace amyloglukosidázy na eelulosový nosič, který spočívá v tom, že se aktivovaný nosič obsahující skupiny vzorce IIISUMMARY OF THE INVENTION The present invention provides a method for immobilizing amyloglucosidase to an eelulose carrier comprising:

CEL-O(III) kde CEL je celulosová opakující se jednotka celulosového řetězce, smísí s roztokem enzymu amyloglukosidázy v pufru o pH 3,5 až 7 a při teplotě 4 až 37 °C ponechá reagovat po dobu 0,25 až 6 hodin, pevná fáze se oddělí s výhodou filtrací nebo odstředěním. Potom se výhodně promyje vodou, a/nebo 1 až 40% roztokem škrobu a/nebo 0,5% hmot. roztokem detergentu vybraného ze skupiny zahrnující alkylfenylpolyethylenoxidethery s 1 až 12 atomy uhlíku v alkylu, a nakonec s výhodou roztokem pufru o pH = 4,7.CEL-O (III) where CEL is a cellulosic repeating unit of the cellulosic chain, mixed with a solution of the enzyme amyloglucosidase in a buffer of pH 3.5 to 7 and allowed to react at a temperature of 4 to 37 ° C for 0.25 to 6 hours, solid the phases are separated preferably by filtration or centrifugation. It is then preferably washed with water and / or 1 to 40% starch solution and / or 0.5 wt. a detergent solution selected from the group consisting of alkylphenylpolyethylene oxide ethers having 1 to 12 carbon atoms in the alkyl, and finally preferably a buffer solution having a pH of 4.7.

Získaný preparát se používá při výrobě glukosy ze škrobu, přičemž lze výrobu výrazně zefektivnit. Podobný postup lze realizovat i pro jiné enzymy, nebot je do jisté míry obecný. Vynález je dále blíže objasněn na příkladech provedení.The obtained preparation is used in the production of glucose from starch, whereby the production can be significantly streamlined. A similar procedure can be implemented for other enzymes as it is to a certain extent general. The invention is illustrated by the following examples.

Příklad 1Example 1

Aktivovaná celulosa,uchovávaná v 1,4-dioxanú, byla promyta pufrem pH 4,0 a odstředěna.Activated cellulose stored in 1,4-dioxane was washed with pH 4.0 buffer and centrifuged.

K navážce 0,2 g byly přidány 2 ml 0,5 M acetátového pufru pH = 4 a 2 ml roztoku amyloglukosidázy z Aspergilus niger o celkové aktivitě 190 jednotek (počet jednotek representuje počet μπιοί glukosy vzniklých rozštěpením škrobu za 1 minutu při použití daného množství preparátu) a směs 1 hodinu míchána při 25 °C. Immobilizovaný enzym byl poté promyt 100 ml vody, 30 ml 35% roztoku škrobu a poté 100 »10,111 acetátového pufru pH = 4,7. Získaný vzorek měl aktivitu 570 jednotek/g suchého preparátu.To the 0.2 g portion, 2 ml of 0.5 M acetate buffer pH = 4 and 2 ml of an Aspergilus niger amyloglucosidase solution with a total activity of 190 units were added (number of units representing the number of μπιοί glucose produced by starch cleavage per minute using the given amount of preparation). The mixture was stirred at 25 ° C for 1 hour. The immobilized enzyme was then washed with 100 ml of water, 30 ml of a 35% starch solution, and then 100 → 10.11 µl acetate buffer pH = 4.7. The sample obtained had an activity of 570 units / g dry preparation.

Příklad 2Example 2

Stejným způsobem jako v příkladu 1 byla provedena immobilizace s tím rozdílem, že byl použit 1 M acetátový pufr pH = 3,5 při immobilizační reakci. Po jejím skončení byl produkt promyt 100 ml vody, 50 ml 10% roztoku škrobu a 100 ml acetátového pufru pH = 4,7. Aktivita byla 230 jednotek/g suchého preparátu.In the same manner as in Example 1, immobilization was performed except that 1 M acetate buffer pH = 3.5 was used in the immobilization reaction. After completion, the product was washed with 100 ml of water, 50 ml of 10% starch solution and 100 ml of acetate buffer pH = 4.7. The activity was 230 units / g dry preparation.

Příklad 3Example 3

Stejným způsobem jako v příkladě 1 kromě pufru, jenž měl zde pH = 7, byl získán preparát s aktivitou 160 jednotek/g suchého vzorku.In the same manner as in Example 1, except for the buffer having a pH of 7 here, a preparation with an activity of 160 units / g dry sample was obtained.

Příklad 4Example 4

Celý proces byl proveden shodně jako v případě příkladu 1 pouze doba styku nosiče s enzymem byla zkrácena na 15 minut při teplotě 37 °C. Produkt měl pak aktivitu 370 jednotek/g suchého preparátu.The whole process was carried out as in Example 1 except that the contact time of the support with the enzyme was reduced to 15 minutes at 37 ° C. The product then had an activity of 370 units / g dry preparation.

Příklad 5Example 5

Stejným způsobem jako v příkladu 1 byla provedena immobilizace, avšak doba vlastní reakce byla prodloužena na 4 hodiny při teplotě 4 °C. Aktivita byla 310 jednotek/g suchého preparátu.Immobilization was carried out in the same manner as in Example 1, but the actual reaction time was extended to 4 hours at 4 ° C. The activity was 310 units / g dry preparation.

Příklad6Example6

Produkt immobilizace získaný postupem podle příkladu 1 byl namísto roztokem škrobu promýván 0,5½ roztokem n-oktylfenyl-dekaetylenoxidetheru. Aktivita byla 590 jednotek/g suchého preparátu.The immobilization product obtained in Example 1 was washed with a 0.5½ solution of n-octylphenyl-decaethylene oxide ether instead of starch solution. The activity was 590 units / g dry preparation.

Claims

SUBJECT OF THE INVENTION

Method for immobilizing amyloglucosidase to a cellulosic support, characterized in that an activated support containing groups of formula III

CEL-O-^ - 0

O (III) where CEL is a repeating unit of the cellulose chain, mixed with amyloglucose dase enzyme solution in a buffer pH of 3.5 to 7 and allowed to react at 4 to 37 ° C for 0.25 to 6 hours, whereupon solid phase separated.

2. A process according to claim 1, wherein the solid phase is washed with water and / or 1 to 40% starch solution and / or 0.5% detergent solution selected from the group consisting of alkylphenylpolyethylene oxide ethers having from 1 to 12 carbon atoms in the alkyl after separation, and finally a buffer solution of pH 4.7