CS209251B1

CS209251B1 - Způsob výroby L-sorbosy

Info

Publication number: CS209251B1
Application number: CS491562A
Authority: CS
Inventors: Milos Kulhanek
Original assignee: Milos Kulhanek
Priority date: 1962-08-24
Filing date: 1962-08-24
Publication date: 1981-11-30

Description

(54) Způsob výroby L-sorbosy

Vynález se týká způsobu výroby L-sorbosy, ; důležitého meziproduktu syntézy kyseliny askorbové (vitaminu C).

L-sorbosa se vyrábí fermentačně-bakteriální dehydrogenací D-sorbitu vhodnými druhy octových bakterií, nejčastěji Acetobacter suboxydans.

Teoreticky má vzniknout ze 100 dílů sorbitu 98,9 dílu sorbosy. Při fermentad se zpravidla posuzuje výtěžek podle obsahu sorbosy, vypočítaného na základě stanovení redukujících cukrů, které jsou vyjádřeny v % sušiny přítomné ve vzorku a stanovené refraktometricky (vodné roztoky D-sorbitu a L-sorbosy o stejné koncentraci mají prakticky ; stejné indexy lomu). Při této metodě může být ; zjištěn uvedený teoretický výtěžek; nebere se při ; tom ovšem v úvahu ztráta sušiny cukrů, způsobená jednak totální disimilací sorbitu, jednak jeho ; spotřebou jako zdroje uhlíku pro růst bakterií. Tato ztráta se podle zkušeností pohybuje kolem ' 4—9 %, vztaženo na výchozí množství sorbitu.

Jak bylo prokázáno (Kulhánek, Ševčíkové, Folia ; microbiologica, 1962, v tisku), vzniká pří fermení tad vedle L-sorbosy v malých množstvích i D-fruktosa a v pokročilejších stadiích ještě i 5-keto-D-fruktosa (5-keto-L-sorbosa) jako vedlejší metabolity, které nežádoucím způsobem snižují výtěžek. Tyto vedlejší metabolity jsou při stanovení : távány jako sorbosa, což je dalším zdrojem nepřesností při zjišťování výtěžku fermentace. Pro určení výtěžku při výrobě sorbosy je z uvedených důvodů směrodatné pouze množství izolované sorbosy, vztažené na výchozí množství sorbitu.

V souvislosti se studiem podmínek pro zvýšení výtěžků byl vypracován nový způsob výroby L-sorbosy mikrobiální dehydrogenací D-sorbitu v tekuté živné půdě na bázi dusíkatých živin a minerálních živných solí, enzymovým systémem mikroorganizmů rodu Acetobacter, zejména Acetobacter suboxydans, podle vynálezu.

Podstata tohoto způsobu spočívá v tom, že se mikrobiální dehydrogenace provádí v přítomnosti inhibitorů, zabraňujících další enzymatické dehydrogenaci vzniklé sorbosy.

Jako inhibitorů enzymů lze používat fluoridu sodného, 2,4-dinitrofenolu nebo dithiokarbamátů, v koncentraci řádově 1.10^-3 až 1. 10^-4, vztaženo na objem živné půdy.

Příznivý vliv přídavku inhibitorů na zvýšení výtěžku, prokázaný papírovou chromatografií, se projevuje potlačením vedlejších reakcí, zejména tvorby 5-keto-D-fruktosy (5-keto-L-sorbosy).

Při vhodné koncentraci inhibitoru není doba fermentace nepříznivě ovlivňována. Vhodnou koncentraci mhibitoru, u kterého je možná částečná inaktivace reakcí se složkami surovin použitých k přípravě fermentační půdy, je nutno nalézt pro dané podmínky empiricky (např. u fluoridu sodného možnost reakce s vápenatými sloučeninami kukuřičného extraktu, vodovodní vody apod.). j Inhibitory přecházejí při izolaci sorbosy krystaliza- cí do matečných louhů a v isolované sorboze nebyly nalezeny.

Výhodou způsobu podle vynálezu je zvýšení výtěžku isolované sorbosy až o 10% proti kontrole, pří minimálně zvýšených nákladech.

Příklady provedení Přikladl:

Do 750 ml Erlenmayerovy baňky umístěno 100 ml živné půdy tohoto složení: 0,3 g kukuřičného extraktu, 0,17 sekundárního fosforečnanu amonného, 18,3 g sorbitu a 16,8 mg fluoridu sodného (koncentrace 4.10^_3M). Po sterilizaci , měla půda objem 94 ml (obsah sorbitu přepočítaný na 100 ml byl 19,4 g). Ochlazená půda zaočkována 10 ml kultury Acetobacter suboxydans 125 (sbírka Mikrobiol. ústavu ČSAV Praha), připravené na půdě stejného složení, ale bez fluoridu sodného, jednodenní stacionární kultivací při 32 °C (inokulum obsahovalo původně 1,9 g sorbitu). Po 58 hodinách inkubace při 30 °C na reciproké třepačce činilo prokvašení 97%, přičemž obsah sušiny poklesl o 6%. Papírová chromatografie ukázala skvrnu sorbosy a velmi malého množství D-fruktosy. Z roztoku bylo po filtraci vrstvou křemeliny a po zahuštění ve vakuu při 20—25 °C izolováno¹krystalizací v několika frakcích celkem 17,4 g produktu, obsahujícího 17,0 g 100%ní sorbosy. V matečném louhu zbylo 0,7 g redukujících cukrů, počítáno jako sorbosa. Na analytickou kontrolu průběhu fermentace byly odebrány celkem 4 ml ¹ roztoku, obsahujícího 0,8 g výchozího sorbitu. Z , celkového množství 19,3 g sorbitu (18,2 g + 1,9 g — 0,8 g) bylo tedy isolováno 17,0 g 100%ní sorbosy, což odpovídá výtěžku 88%. !

U současně provedeného slepého pokusu, při; němž bylo použito živné půdy stejného složení, avšak bez přísady fluoridu sodného, stejného inokula a stejných kultivačních podmínek, činilo i po 58 hodinách fermentace prokvašení 98%.

| Chromatografií dokázána přítomnost sorbosy, malého množství D-fruktosy a 5-keto-D-fruktosy. Pokles obsahu sušiny činil 9%. Isolováno celkem

Claims

[ PŘEDMĚT

1. Způsob výroby L-sorbosy mikrobiální dehydrogenací D-sorbitu v tekuté živné půdě na bázi dusíkatých živin a minerálních živných solí, enzymovým systémem mikroorganizmů rodu Aceto- í barier, zejména Acetobacter suboxydans, vyzná- ; čující se tím, žé se mikrobiální dehydrogénace provádí v přítomnosti inhibitorů, zabraňujících |

15.7 g 10Ó%ní sorbosy z 19,6 g výchozího sorbitu (odebrané vzorky obsahovaly 0,5 g sorbitu), tj. 80%. V posledním matečném louhu zbylo 1,2 g redukujících cukrů, počítáno jako sorbosa.

Zvýšení výtěžku izolované sorbosy činilo tedy s použitím fluoridu sodného 8%.

Příklad 2:

Obdobně jako v příkladě 1. provedena fermentace s přídavkem 2,9 mg 2,4-dinitrofenolu (výsledná koncentrace 1,7.10^_4M). Po 58 hodinách kultivace činilo prokvašení 98%, ztráta sušiny 7%. Chromatografií prokázána přítomnost sorbosy a velmi malého množství fruktosy. Izolováno

16.8 g 100%ní sorbosy, a to z 19,5 g výchozího sorbitu (se vzorky bylo odebráno 0,6 g z původního množství sorbitu). Výtěžek Snil tedy 86%, vztaženo na sorbit, což odpovídá zvýšení o 6% proti současně provedenému slepému pokusu. V matečném louhu zůstalo 0,5 g redukujících cukrů, počítáno jako sorbosa.

Příklad 3:

100 ml živné půdy, obsahující 0,1 g kukuřičného extraktu, 19,0 g D-sorbitu a 4,2 g fluoridu sodného (koncentrace 1.10^_3M) zaočkováno po sterilizaci 4 ml kultury Acetobacter suboxydans 125, kultivované 2 dny stacionárně při 32 °C na půdě obsahující 20 % sorbitu, 0,5 % pekařského droždí ve formě 20%ního autolyzátU, dále 0,2 % sekundárního fosforečnanu amonného, 0,1 % primárního fosforečnanu draselného a 0,02 % kryst. síranu hořečnatého. Po 65hodinách submersní fermentace bylo dosaženo prokvašení 96 %. Chromatografická analýza prokázala přítomnost sorbosy a malého množství D-fruktosy. Bylo izolováno celkem

16,7 g sorbosy, tj. 16,2 g 100%ní sorbosy z 19,1 g sorbitu (19,0 g + 0,8 g — 0,7 g), tj. 85 % vztaženo na výchozí sorbit.

Pri slepém pokusu za stejných podmínek činilo prokvašení 96 %. Chromatografií prokázána přítomnost sorbosy, 5-keto-D-fruktosy a malého množství D-fruktosy. Z 19,4 g sorbitu (19,0 g + 0,8 g — 0,4 g) izolováno celkem 14,9 g sorbosy, tj. 14,6 g 100%ní sorbosy, což odpovídá výtěžku 75 %, vztaženo na výchozí sorbit. Zvýšení výtěžku isolované sorbosy pri fermentaci s přísadou fluoridu sodného činilo tedy 10 %.

další enzymatické dehydrogenaci vzniklé sorbosy.

2. Způsob podle bodu 1. vyznačující se tím, že se jako inhibitorů enzymů používá fluoridu sodného,

2,4-dinitrofenolu nebo dithiokarbamátů, v koncentraci řádově 1 .10^-3 až 1. 10^-4M, vztaženo na objem živné půdy.