CS202373B1 - Spósob přípravy imobilizovaných enzýmov - Google Patents

Abstract

Přihláška vynálezu sa týká přípravy imobilizovaných enzýmov viazaných na perlovej celulóze obsahujúcej karbonylové skupiny. Principy imobilizácie enzýmov na róznych polymérnych nosičoch sú dnes dostatočné známe nielen z literárnych údajov fjíethods in Enzymology, Vol. XLIV, Immobilized Enzames, Ed. Klaus Morbach, Academie Press, New York, San Francisko, London 1976J, ale i mnohých praktických aplikácií tak vo výskume, ako i v priemyslovej praxi. Chemická imobilizácia enzýmov na vhodnom nosiči patří k najrozšírenejším spósobom imobilizácie, pričom ako nosič sa používajú rózne syntetické polyméry, ale i přírodně polysacharidy: škrob, celulóza, dextrany a i. Ak sa použije ako nosič vláknitá alebo práš ková celulóza, je potřebné před imobilizáciou enzýmu vytvořit na celulóze vhodnú funkčnú skupinu, ktorá je schopná v druhom stupni kovalentne intereagovať s příslušnými skupinami enzýmu. Takouto skupinou je napr. karbonylové skupina, ktorá sa velmi jednoducho vytvoří známou oxidáciou celulózy, resp. iného polysacharidů s jodistanom draselným. (T. P. Novell: Methods in Carbohydrate Chemistry New York 1963, str. 165-68). Je však známe, že polymérny nosič, na ktorom je enzým viazaný má zásadný význam na aplikačně možnosti imobilizovaných enzýmov v priemyslovej praxi. Polymérny nosič musí meť dostatočné velký napúčací objem v reakčnom médiu, aby bola zabezpečená dostatočné rýchlosť difúzie substrátu k aktívnym centrám imobilizovaného enzýmu.

Description

ČESKOSLOVENSKÁSOCIALISTICKÁREPUBLIKA( 19 )

POPIS VYNÁLEZU

K AUTORSKÉMU OSVEDČENIU (61) (23) Výstavná priorita (22) Přihlášené 13 11 78 (21) PV 7360-78 202 373 (11) (Bl) (51) IntCl? C 12 N 11/14

ÚŘAD PRO VYNÁLEZY

A OBJEVY (40) Zverejnené 30 04 80(45) Vydané 01 q4 83 (75)

Autor vynálezu KUNIAK ÍUD0VÍT ing. CSc., BRATISLAVA a ZEMEK JURAJ ing. CSc., LEHNICA (54) Spósob přípravy imobilizovaných enzýmov 1 Přihláška vynálezu sa týká přípravy imobilizovaných enzýmov viazaných na perlovejcelulóze obsahujúcej karbonylové skupiny.

Principy imobilizácie enzýmov na róznych polymérnych nosičoch sú dnes dostatečnéznáme nielen z literárnych údajov fjíethods in Enzymology, Vol. XLIV, Immobilized Enzames,Ed. Klaus Morbach, Academie Press, New York, San Francisko, London 1976J, ale i mnohýchpraktických aplikácii tak vo výskume, ako i v priemyslovej praxi.

Chemická imobilizácia enzýmov na vhodnom nosiči patří k najrozšírenejším spósobomimobilizácie, pričom ako nosič sa používajú rózne syntetické polyméry, ale i přírodněpolysacharidy: škrob, celulóza, dextrany a i. Ak sa použije ako nosič vláknitá alebo práš-ková celulóza, je potřebné před imobilizáciou enzýmu vytvořit na celulóze vhodnú funkčnúskupinu, ktorá je schopná v druhom stupni kovalentne intereagovať s příslušnými skupinamienzýmu. Takouto skupinou je napr. karbonylová skupina, ktorá sa velmi jednoducho vytvoříznámou oxidáciou celulózy, resp. iného polysacharidu s jodistanom draselným. (T. P. Novell:Methods in Carbohydrate Chemistry New York 1963, str. 165-68).

Je však známe, že polymérny nosič, na ktorom je enzým viazaný má zásadný význam naaplikačně možnosti imobilizovaných enzýmov v priemyslovej praxi. Polymérny nosič musí maťdostatočne veTký napúčací objem v reakčnom médiu, aby bola zabezpečená dostatočná rýchlosťdifúzie substrátu k aktívnym centrám imobilizovaného enzýmu. 202 373 202 373 Z uvedených dfivodov eú pře imobilizáciu nativně polyaacharidy ako celulóza a škrobnevhodné. Třeba ich preto vhodným spfisobom chemicky modifikovat, aby napúčací objem poly-aaeharidového gélu bol dokonale príatupný i pre vfičšie molekuly subatrátu. VeTmi vhodnýmcelulózovým nosičom pre imobilizáciu enzýmov ukázala aa byť perlová celulóza (čs. AO 2.172640 (1976)), ktorá spina náročné požiadavky polymérneho nosiče pre kovalentné viazanieenzýmov.

Podstata vynálezu spočívá v tom, že v prvom stupni sa perlová celulóza oxiduje vovodnom roztoku a jodistanom draselným, alebo sodným při izbovej teplote po dobu 10 až 24hodin za použitia 0,03 až 0,25 molu jodistanu draselného na anhydroglukózovú jednotku ce-lulózy, načo sa v druhom stupni po premytí produktu destilovanou vodou do negatívnej re-akcie na jodistan přidá vodný roztok enzýmu v množstve 10 až 50 % na váhu suchého celuló-zového oxidovaného nosiča a nechá sa za miešania reagovat po dobu 10 až 24 hodin pri pH 4až 8 podl’a pH optima a stability viazaného enzýmu při teplote 4 až 40 °C.

Pri oxidácii perlovej celulózy je ddležité, aby sa reakčná zmes nemiešala vysokoobrát-kovým miešadlom, pretože by mohlo ddjst k drobeniu celulozových guličiek, čo má za následokzvyšovanie odporu při práci na koloně. Je účelné preto volit vel’mi nízké obrátky potřebnélen na to, aby celulozová suspenzia počas reakcie nesedimentovala.

Reakčná doba potřebná na dosiahnutie potřebného oxidačného stupňa nepřesahuje 10 až24 hodin při izbovej teplote. Pri nízkých stupňoch oxidácie sa v uvedenom reakčnom časeoxidačně reagens spotřebuje takmer na 98 %, t.j. nie je potřebné po ukončení reakcie ne-zreagovaný jodistan chemicky eliminovat. Stačí na filtri premyť destilovanou vodou a hne3pokračovat s naviazaním aplikovaného enzýmu. Bnzým sa přidává vo vodnom roztoku pri opti-málnom pH aplikovaného enzýmu. Naviazanie enzýmu je ukončené do 24 hodin pri teplote 4 až40 °C podTa tepelnej stability enzýmu. Výhodou predmetnej imobilizácie enzýmov na perlovej celulóze je predovšetkým to, žeperlová celulóza v dĎsledku presnej guTovej geometrie častíc má veTmi dobré vlastnostipři práci v koloně,ako i dostatočne vysoký napúčací objem vo vodnom roztoku, čím sú pod-mienené dobré difúzne rýchlosti substrátu k aktívnym centrám imobilizovaného enzýmu. Příklady prevedenia Přiklad 1 K 16 g mokrej perlovej celulózy (sušina 10,5 %) sa přidá roztok 40 ml vody s 0,115 gjodistanu draselného. Reakčná suspenzia sa pri laboratornej teplote nechá reagovat pri stá-lom miešaní 24 hodin. Miešanie nesmie byť intenzívně, len také, aby perlová celulóza nese-dimentovala. Po ukončení oxidácie sa perlová celulóza odfiltruje a premyje destilovanou vo-dou, pričom sa získá produkt so stupňom oxidácie 0,05, t.j. každá 20. anhydroglukózová jed-notka je oxidovaná na dialdehyd v polohe C2, Cy K premytej dialdehyd celulóze sa přidá 60 ml 0,05 M barátového pufru o pH 8,6. K uve-denej suspenzii sa přidá roztok pseudocholínesterázy (acylcholín acylhydroláza EC 3.1.1.8)v množstve 0,5 g o aktivitě 120 U/mg v 50 ml 0,05 M barátového pufru o pH 8,6 za stáléhomiešania na elektromagnetickoj miešačke. Reakci a imobilizácie prebieha po dobu 24 hodin

Claims (3)

1. . z 202 373 při teplote 4 °C. Po ukončení reakcie sa perlová celulóza s zmobilizovaným enzýmom odfiltru-je, na filtri aa premyje 10 %-ným roztokom NaCl, aby sa vymyl podiel enzýmu viazaného fyzi-kálně. Premytý imobilizováný enzym mal aktivitu 1800 U/g mokrej celulózy a zachoval si tútoaktivitu pri skladovaní pri teplote 10 °C po dobu 1 roka. Příklad
2. 2 Postup podl’a příkladu 1 a tým rozdielom, že na imobilizáciu použijeme enzým ot-amylázu(oc-l,4-glukán glukánohydroláza EC 3.2.1.1) (Bacillus subtilus) vo fosfátovom pufri o pH = 7 Příklad
3. 3 Postup podl’a příkladu 1 s tým rozdielom, že na imobilizáciu použijeme enzým glukamylá-za (oo-l,4-glukán glukánohydroláza EC 3.2.1.3) (Endomycopsis bispora) vo fosfátovom pufrio pH = 6. Vynález sa mfiže uplatnit všade, kde sa používají) imobilizované enzýmy vo výskume, alebopriemyslovej aplikácii, resp. humánněj medicíně. PREDMET VYNÁLEZU Spfisob přípravy imobilizovaných enzýmov vyznačujúci sa tým, že v prvom stupni sa perlo-vá celulóza oxiduje vo vodnom roztoku s jodistanom draselným alebo sodným pri izbovej teplo-te po dobu 10 až 24 hodin za použitia 0,03 až 0,25 mólov jodistanu draselného na anhydro-glukózovú jednotku celulózy, načo v druhom stupni po premytí produktu destilovanou vodoudo negatívnej reakcie na jodistan sa přidá vodný roztok enzýmu v množstve 10 až 50 % naváhu suchého oxidovaného celulózového nosiča a nechá sa za miešania reagovat po dobu 10až 24 hodin pri pH = 4 až 8 podl’a pH optima a stability viazaného enzýmu pri teplote 4 až 40 °0